全 文 ：文章编号:1004—5570(2000)04—0028—03
高梁根质膜 K +转运蛋白的提取和纯化

乙　引1 ,汤章城2 ,倪晋山2 ,姜伯尼1 ,杨浩舒3
(1.贵州师范大学 生物科学技术系 , 贵州 贵阳　500001;2.中国科学院上海植物生理研究所 ,
上海 200032;3.贵阳市环境保护局 , 贵州 贵阳 550002)
摘要:采用蔗糖密度梯度法提取高梁根质膜 , 并以 Dextran T -500 和 PEG -3350G 两相法纯化质膜 , 用
6.5mmol/ L CHAPS 增溶膜蛋白 , 然后 ,经 Superose 12 柱和 Mono Q柱进行 FPLC 纯化 ,最终收集到具有 K +转运
功能的蛋白质。经 SDS-PAGE 分析表明 ,它至少含有一条 80kd 多肽。
关 键 词:高梁;K +转运蛋白;纯化
中图分类号:Q945.12　　文献标识码:A
Extraction and purification of K
+
transport protein
from plasma membrane of sorghum roots
YI Yin1 , TANG Zhang-cheng2 , NI Jin-shan2 , JIANG Bo-ni1 , YANG Hao-shu3
(1.Institute of Biology , Guizhou Normal Univ ersity , Guiyang 550001 , China;2.Shanghai Institute of Plant Plysiolo-
gy , Academia Sinica , Shanghai 200032 , China;3.The Bureau of Environmental Protection o f Guiy ang City , Guiyang
5500023 , China)
Abstract:This paper describes partial purification and characterization of a vandate-sensitive K+-
ATPase f rom PM of Sorghum vargular.Purification is based on the follow ing procedure:ext rac-
tio n of membrane w ith CHAPS , follow ed by fraction of the ex tract by successive FPLC-mediated
gel permeation and ion-exchanes chromatog raphy .The overall yield w as 5%.The partially purfied
ATPase appares to contain a polypept ide component of Mr=80kd.
Key words:sorghum root , K+ transport protein , purification
0　引言
植物对渗透胁迫的响应机制一直是科学家们
所关心的问题 。近十几年来的研究结果表明 , K+
在植物渗透调节方面起着重要的作用 ,它参与了
ABA和渗透胁迫诱导的脯氨酸累积(汤章城 1984;
Buhl和Stew art1983),但其作用并不在于对一些脯
氨酸代谢关键酶的影响 ,而是直接与组织中适当的
离子流入和离子水平有关(Pesci 1988)
在 E.coli 、S reptococcus faecalis 、酵母和高等
植物中相继发现了不同的 K+转运系统(Higgins
等 1987;Kakinuma &Harold 1985;Gaber等 1988;
乙引等 1996),它们是一类离子转运 ATP 酶 ,在渗
透胁迫中起吸收 K+的作用。但是 ,有关高等植物
K
+转运系统的研究处于起步阶段 ,我们提取和纯
化了高梁的 K+转运蛋白 ,为进一步开展其结构和
功能的研究打下基础。
28
收稿日期:1999-10-10
基金项目:国家自然科学基金重点资助项目(3920040)
　第 18卷 第 4期
2000 年 11月 　　　　　　　
贵州师范大学学报(自然科学版)
Journal of Guizhou No rmal University(Natural Science)　　　　　　　　
Vo l.18.No.4
Nov., 2000
1　材料和方法
1.1　材料　高梁(Sorghum vargula Jinza NO.5)
的培养和处理参照乙引等(1996)方法。
1.2　质膜的分离和纯化　质膜分离对照 Dupont
等(1988)的方法 ,质膜纯化参照Widell(1987)的方
法。
1.3　膜蛋白的增溶　参照乙引等(1994)的方法 ,
CHAPS 终浓度为 6.5mmol/L 。
1.4　K+运输活性测定　参照乙引等(1996)的方
法 ,用 K+专一性探针 PBFI进行检测。
1.5　蛋白的纯化　采用 Pharmacia 公司的 FPLC
LCC-500系统进行两次纯化 。首先用两倍柱体
积洗脱液平衡 Superose 12柱至基线稳定 ,洗脱液
为含有 1.6mmo1/L CHAPS , 125mmol/ L NaCl ,0.
5mmol/L EDTA , 0.2mmol/ L DTT , 100mmol/ L
蔗糖 , 1mmol/L 巯基乙醇以及 20 mmol/L T ris-
HCl(pH7.6)。取溶解的蛋白 200μL。置于柱上 ,
流速 0.5ml/min , 280 nm 检测蛋白 ,收集具有 K+
运转活力的蛋白组份 , 透析 ,经 PEG-6000浓缩
后 , 用 Mono Q 柱进行纯化。柱子先用含 1.6
mmol/L CHAPS , 0.5mmol/L EDTA , 0.2mmol/L
DT T , 100mmol/L 蔗糖和 20mmol/L Tris -HCl
(pH7.6)的缓冲液平衡 ,然后用含 0-500mmol/L
NaCl的缓冲液梯度洗脱 ,流速 0.5ml/min。
1.6　电泳分析　参照 Laemmli(1970)的方法进行
SDS-PAGE ,浓缩胶和分离胶浓度分别为 5%和
13%。用 Blue 等(1987)的方法银染 。
1.7　蛋白含量测定　参照 Smith等(1985)的方法
测定蛋白 ,以 BSA为标准蛋白。
2　结果和讨论
2.1　K+转运蛋白的 FPLC 纯化
　　经 CHAPS 增溶下来的蛋白 ,根据分子筛效应
用Superose 12柱进行层析分离(图 1)。洗脱缓冲
液中含有去垢剂 CHAPS ,其目的是稳定膜蛋白 ,防
止其聚集 。图 1表明 ,在收集到的 40个组份中 ,只
有第 11-15组份具有钒酸钠敏感 ATP 酶活力和
K+转运活性 ,其在分离的蛋白质中位于第 2 个峰
附近 。进一步的纯化步骤是将这部分蛋白浓缩 ,然
后进行离子交换柱层析。因为 K+转运蛋白转运
的是阳离子。其本身带负电荷 ,所以选用阴离子交
换树脂进行纯化能得到理想效果 。本试验采用
Mono Q 柱 ,经 NaCl梯度洗脱后 ,发现具有 K+-
ATP 酶活力的蛋白峰在 100mmol/L NaCl左右时
被洗脱下来(图 2)
表 1显示了高梁根质膜 K+转运蛋白的纯化
过程 。经过分子筛和离子交换两次层析 , K+转运
蛋白被纯化了 48倍。此外 , Superose 12层析将酶
比活从 0.38μmol/g·min提高到 10.3μmol/g·min ,
增加了 27.1 倍 ,而 Mono Q 层析仅将酶活提高了
2.2μmol/g·min ,为原来的 0.21倍 ,比活并没有很
大的增加 ,而且 K+转运活性也非常低 。这个结果
表明 ,Mono Q 层析纯化效果不如 Superose 12好 。
可能是因为整个纯化过程耗时过长 ,导致酶的部分
失活;或者 K+转运系统的 K+转运过程可能还需
要其它物质的参与 ,而纯化过程破坏了该转运蛋白
的构象而使其失活 。另外 ,本实验 ATP 酶得率较
低 ,纯化蛋白仅占质膜蛋白的 2.4%,表明在整个
纯化过程中 ,有部分酶活损失 。其最有可能的因素
包括:CHAPS 未能有效地将质膜 K+-ATP 酶全
部洗脱下来;在每一步纯化过程中 ,为了增加纯度 ,
只收集最具活力的部分 ,使得率减少;纯化过程中
29
　第 4 期　　　　　　乙　引 , 汤章城 ,倪晋山 , 姜伯尼 ,杨浩舒:高梁根质膜 K +转运蛋白的提取和纯化　　　　　　　　　　
有部分酶活丧失 。因此通过改进实验方法 ,可以提
高蛋白纯化倍数和得率 。此外 ,在实验过程中 ,我
们还发现贮于-20℃的 K+转运蛋白 ,经融解后仍
可保持相对稳定的离子转运活力 ,表明它是一个相
对稳定的酶系统。
表 1　高梁根质膜 K+-ATPase的纯化
Step
ATPase activity
P rotein To tal Specific Yield Purification
mg μmol/min μmol/ g·min % fold
PM 8.10 197.3 0.26 100
CHAPS ex tr act 4.20 91.6 0.38 46.4 0.8
FPLC-mediated filtration 0.13 23.2 10.3 11.8 39.6
FPLC-mediated ion-exchange 0.02 4.8 12.5 2.4 48.0
2.2　K+转运蛋白的 SDS-PAGE
图 3 显示了各种纯化步骤的蛋白 SDS -
PAGE分析结果 。由图中可以看出 , 80KD的蛋白
不断被纯化 ,同时 ,纯化过程中也存在一些其它蛋
白 ,由于它们在电泳图上并不象 80KD蛋白那样保
持不变 ,所以推测 80KD蛋白可能就是行使 K+转
膜运输的 K+-ATP 酶 ,至少它是该转运系统的一
部分 。
图 3　各纯化步骤 ATPase的电泳分析
渗透胁迫诱导了高梁根高 K+转运系统的产
生 ,它在植物渗透调节中起着重要作用 。本文通过
生化手段纯化这种 ATP 酶 ,它显示出 K+转运活
性是质膜上 K+转运系统中的主要部分。对该蛋
白结构和功能的研究将有助于阐明其离子转运分
子机制及其在渗透调节中的作用机制。
参考文献:
1　乙引 ,汤章城 , 倪晋山.渗透胁迫对高梁根 K +吸收的
影响[ J].植物生理学报 , 1996 , 22(2):191-196.
2　乙引 ,汤章城.经渗透胁迫高梁根的质膜囊泡 K +-
ATP 酶及其运输特征[ J] .植物生理学报 , 1996 , 22(3):
231-236.
3　乙引.渗透胁迫诱导的高梁根 K +转运蛋白的研究[ 博
士学位论文] [ D] .上海:中科院上海植物生理研究所 ,
1994.
4　Buhl MB and Stew art CR.Effect of NaCl on pro line syn-
thesis and utilization in excised barley leaves [ J] .Z.
Pflanzenphy siol , 1983 , 74:664-667.
5　Dupont FM , Tanaka CK and Hurkman WJ.Separation and
immunological characterization of membrane fractions from
barley roo ts [ J] .P lant Physiol , 1988 , 86:717-724.
6　Gaber RF , Styles CA and Fink GR.TRK1 encodes a plas-
ma membrance protein required for high-affinity potassi-
um transpor t in Saccharomyces cerevisiae [ J] .Mol.Cell
Biol., 1988 , 8:2848-2859.
7　Higgins CF , Cairney J , Stirling DA , Sutherland L and
Boo th IR.Osmotic regulation of gene expression;ionic
strength as an intracellular signal? [ J] .T IBS 1987 , 12:
339-344.
8　Kakinuma Y and Harold FM.High potassium affinity sys-
tem in Sreptococcus faecalis [ J] .J Biol Chem., 1985 ,
260:2086-2091.
9　Laemmli UK.A effecient method of pro tein separa tion in
electrophoresis[ J] .Nature , 1970 , 227;680-685.
10　Pesci P.Ion fluxes and abscisic acid-induced proline ac-
cumulation in barley segments [ J] .Plant Physiol., 1988 ,
86:927-930.
11　Smith PK , Drohn RL , Hermanson GT etal.Measure-
ment of protein using bicinchoninic acid [ J] .Anal
Biochem , 1985 , 150:76-85.
12　Widell S.Extraction and purification o f plasma membrane
by tw o-phase method [ J] .Physiol.Plant , 1987 , 69:727
-730
30
　　　　　　　　　　　　　　　　　　贵州师范大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　第 18 卷