全 文 ：第 25卷第 4期 　　　西　南　农　业　大　学　学　报 (自然科学版) Vol.25 ,No.4
2003年 8月 Journal of Southwest Agricultural University(Natural Science) Aug.2003
文章编号:1000-2642(2003)04-0287-03
豇豆根瘤亚细胞组分中ASAL的分段盐析
周跃钢1 ,张瑞宇2 ,全学军1 ,林治华1
(1.重庆工学院 生物工程学院 ,重庆　400050;2.重庆工商大学 环境与生物工程学院 ,重庆　400033)
摘要:68.5%的腺苷酸琥珀酸裂解酶(ASAL)活性和 62.2%的 5-氨基-4-咪唑-N-腺苷酸羧基酰胺核糖核苷酸
(SAICAR)裂解酶活性分布在豇豆根瘤亚细胞的可溶性组分中。亚细胞可溶性和颗粒组分的 ASAL和 SAICAR 裂解酶
活性回收率均在 50%～ 55%(NH4)2SO4 饱和度分段盐析沉淀中出现 1 个峰值。但在颗粒组分提取液的 60%～ 65%
(NH4)2SO4饱和度分段盐析沉淀中 , 分别另有一个小的ASAL和SAICAR裂解酶活性回收率峰值出现。讨论了 ASAL是
1 个双功能酶及其同工酶存在的可能性。
关　键　词:豇豆;根瘤;腺苷酸琥珀酸裂解酶
中图分类号:S 643.4　　　　　　文献标识码:A
FRACTIONATION OF ADENYLOSUCCINATE LYASE IN SUBCELLULAR
FRACTIONS OF COWPEA (VIGNA SINENSIS)NODULES
ZHOU Yue-gang1 , ZHANG Rui-yu2 , QUAN Xue-jun1 , LIN Zhi-hua1
(1.College of Engineering , Chongqing Institute of Technology , Chongqing 400050 , China;2.College of Environment and Bioengineering ,
Chongqing Technology and Business University , Chongqing 400033 , China)
Abstract:68.5% of ASAL(adeny losuccinate lyase)activity and 62.2% of SAICAR(5-amino-4-imidazole-N-succinocarboxamide ri-
bonucleotide)lyase activity were found in the soluble subcellular components of cowpea(Vigna sinensis)nodules.In 50%～ 55%(NH4)2SO4
saturation fractionations from soluble and particle components , a peak of recovery of ASAL and SAICAR appeared.Another peak , a bit lower ,
appeared in 60%～ 65%(NH4)2SO4 saturation fractionations from the particle component.The possibility of ASAL being another bifunctional en-
zyme and of the presence of its isoenzymes in cowpea nodules is discussed.
Key words:cowpea(Vigna sinensis);nodule;adenylosuccinate lyase
　　大多数豆科植物根瘤生物固氮的产物是以尿囊
素和尿囊酸形式输出[ 1] 。它们的形成涉及到嘌呤从
头合成途径 。腺苷酸琥珀酸裂解酶(EC 4.3.2.2 ,
ASAL)是这一途径中的 1 个重要的酶。已有报道[ 2]
指出ASAL是 1个双功能酶 ,能催化(1)腺苷酸琥珀
酸(SucAMP)※AMP+延胡索酸和(2)-5氨基-4-
咪唑-N-腺苷酸羧基酰胺核糖核苷酸(SAICAR)※5
-氨基-4-咪唑羧基酰胺核糖核苷酸(AICAR)+延
胡索酸。但不清楚豆科植物根瘤中的 ASAL 是否也
是 1个双功能酶。此外 ,尽管嘌呤从头合成途径的活
性已被定位在质体中 ,但也不清楚是否仅限于质体
中[ 1] 。因此 ,我们对豇豆根瘤 ASAL 的盐析行为和其
在细胞内的活性分布进行了初步的研究 ,以便初步了
解豇豆根瘤ASAL是否可能仍是 1个双功能酶 ,以及
初步推断豇豆根瘤中嘌呤从头合成途径的活性的可
能存在位点 ,并为进一步进行 ASAL 的纯化等研究做
准备。
繱收稿日期:2003-03-11基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670441)作者简介:周跃钢(1958-),男 ,重庆人 ,重庆工学院副教授 ,硕士 ,从事生物化学与分子生物学研究。
DOI :10.13718/j.cnki.xdzk.2003.04.002
1　材料和方法
1.1　植物材料
豇豆(Vigna unguiculata [ L.]Walp)用根瘤菌 Rhi-
zobium(B 756)接种 ,按Atkins的方法[ 3]生长 9 ～ 10周
后收获根瘤用于酶的提取。在摘取根瘤前先用冷去
离子水冲洗净。
1.2　豇豆根瘤亚细胞可溶性和颗粒组分提取液以及
SAICAR的制备
30 g 新鲜根瘤用去离子水洗净 ,置于预冷的研钵
中 ,加入 2 倍体积预冷的缓冲液 A(100 mmol·L-1
Tricine ,pH 7.5)/25 mmol·L-1KCl/5 mmol·L-1MgCl2/
5%(v/v)甘油/0.25 mmol·L-1蔗糖),用预冷的研棒
适度挤压 ,得到的粗提液经100 μm孔径尼龙布过滤 ,
搜集的无根瘤组织的滤液经离心(10 000×g , 10 min ,
3 ～ 4℃)后 ,分别搜集上清液A(含胞液中的蛋白质和
少数来自破碎的亚细胞器和类菌体一类的颗粒组分
的蛋白质)和沉淀部分(含类菌体和亚细胞器的颗粒
组分)。得到的颗粒组分沉淀用 30 ml裂解缓冲液
(50mmol·L-1 Tricine ,pH 7.5/25 mmol·L-1KCl/5 mmol
·L-1MgCl2/5%(v/v)甘油/0.5%(v/v)β -巯基乙醇)
悬混匀 ,使颗粒组分破裂释放出蛋白质 , 然后离心
(16 000×g ,15 min ,3 ～ 4℃),搜集含颗粒组分蛋白质
的上清液 B[ 4～ 5] 。SAICAR按周跃钢的方法[ 6]制备。
1.3　酶的硫酸铵分段盐析和蛋白酶抑制剂对酶活的
影响和酶活测定方法
在1 ～ 4℃冷室中进行上清液A和 B的硫酸铵分
段盐析 。每 1个分段盐析步骤得到的蛋白质沉淀重
新溶解在 0.5 ～ 2 ml缓冲液 B(50 mmol·L-1 Tricine ,
pH 8.0/0.1%(v/v)β-巯基乙醇)中 ,并测定ASAL 和
SAICAR裂解酶活性 。分别将上清液 A和 B 的酶活
性作为 100%,以此为基础计算每个分段盐析沉淀中
的酶活性回收率 。
蛋白酶抑制剂对酶活的影响试验在 1 ～ 4℃冷室
中进行 。在缓冲液A 中添加蛋白酶抑制剂苯甲基磺
酰氟(PMSF)至 1 mmol·L-1(不加PMSF 作为对照),然
后用于豇豆根瘤亚细胞可溶性组分提取液的制备 ,用
40%～ 65%饱和度硫酸铵进行分段盐析 ,并分别测定
计算蛋白质沉淀中ASAL和SAICAR裂解酶活性总回
收率 。
按照 Miller 等[ 7] 的方法测定 SAICAR 裂解酶活
性。1个酶活力单位定义为在 540 nm 处每 min引起
1.0 吸收值所需的酶量。按照Woodward的方法[ 2]测
定ASAL活性。1个酶活力单位定义为每 min 转化 1
nmol底物所需的酶量。
2　结果
2.1　豇豆根瘤亚细胞组分中 ASAL 的硫酸铵分段盐
析
盐析结果显示 ASAL 活性在可溶性组分和颗粒
组分中的酶活性总回收率分别为 47.5%和 91.5%。
可溶性组分中81.6%的酶活性分布在 45%～ 65%饱
和度硫酸铵分段盐析沉淀中 ,颗粒组分中 90.6%的
酶活性分布在 50%～ 65%饱和度硫酸铵分段盐析沉
淀中 。在 2 个组分中 ,酶活回收率高峰峰值出现在
50%～ 55%饱和度硫酸铵分段盐析沉淀中 。但在颗
粒组分中另有 1 个小的酶活回收率高峰峰值出现在
60%～ 65%饱和度硫酸铵分段盐析沉淀中(图 1)。
(NH4)2SO4 饱和度/ %
图 1　豇豆根瘤亚细胞组分中ASAL的(NH4)2SO4 分段盐析
Fig 1　(NH4)2SO 4 Fractionation of ASAL in Subcellular Components of Cow-
pea Nodules.
左:可溶性组分　　右:颗粒组分
ASAL总活性(904.65 U)的 68.5%分布在可溶性组分中
2.2　豇豆根瘤亚细胞组分中 SAICAR裂解酶的硫酸
铵分段盐析
盐析结果显示 SAICAR裂解酶活性在可溶性组
分和颗粒组分中的酶活性总回收率分别为 77.2%和
91.1%。可溶性组分中 87.3%的酶活性分布在 40%
～ 60%饱和度硫酸铵分段盐析沉淀中 ,颗粒组分中
89.7%的酶活性分布在 50%～ 65%饱和度硫酸铵分
段盐析沉淀中。在 2个组分中 ,酶活回收率高峰峰值
都出现在 50%～ 55%饱和度硫酸铵分段盐析沉淀
中 。但在颗粒组分中另 1个小的酶活回收率高峰峰
值出现在 60%～ 65%饱和度硫酸铵分段盐析沉淀中
(图2)。
2.3　蛋白酶抑制剂对酶活的保护作用
在蛋白酶抑制剂 PMSF 存在下 , 40%～ 65%饱和
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度硫酸铵分段盐析沉淀中的可溶性组分的 ASAL 和
SAICAR裂解酶活性总回收率分别提高了 43.3%和
13.9%(表 1)。
(NH4)2SO4 饱和度/ %
图 2　豇豆根瘤亚细胞组分中 SAICAR裂解酶的(NH4)2SO4 分段盐析
Fig 2　(NH4)2SO4 Fractionation of SAICAR Lyase in Subcellular Components
of Cowpea Nodules
左:可溶性组分　　右:颗粒组分
SAICAR裂解酶总活性(223.2 U)的 62.2%分布在可溶性组分中
表 1　PMSF 对ASAL和 SAICAR裂解酶活性的保护作用
Table 1　Effect of PMSF to ASAL and SAICAR lyase activity
酶活性总回收率/ %
ASAL SAICAR裂解酶
缓冲液 A 45.8 77.1
缓冲液 A+PMSF 89.1 91.0
　　注:测定的是可溶性组分的 40%～ 65%饱和度硫酸铵分段盐析沉
淀中的酶活。
3　讨论
分段盐析结果显示ASAL 和SAICAR裂解酶活性
总回收率最大峰值重叠在相同饱和度硫酸铵分段盐
析沉淀中 ,暗示豇豆根瘤 ASAL 也可能是 1个双功能
酶。在颗粒组分中 ,2种酶的活性总回收率在大峰之
后都出现了 1个新的小峰。这一方面暗示了可溶性
组分中来自破碎颗粒组分中的蛋白质的污染应该很
小 ,否则小峰也应该出现在可溶性组分中。另一方面
似乎也暗示 ASAL可能有 2种同工酶分子形式 ,其中
1种可能出现在颗粒组分中 ,而不出现在可溶性组分
中 。分段盐析结果也显示主要的ASAL和 SAICAR裂
解酶活性(分别为 68.5%和 62.2%)是与可溶性组分
偶联的 ,而且已有报道指出催化嘌呤从头合成途径中
的起始底物 PRPP 形成的 PRPP 合成酶的主要活性也
与可溶性组分偶联 。这些结果似乎暗示了有可能
ASAL在可溶性和颗粒组分中都有分布 ,但尚需进一
步的试验证明来证实 。其次 ,是否嘌呤从头合成途径
有可能不仅仅限于质体中这一点 ,也需更进一步的试
验来证实。另外也注意到ASAL活性比 SAICAR裂解
酶活性更易受蛋白酶降解的影响 ,酶活下降更快。其
真实的含义尚待进一步研究。
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289第 25卷第 4期　　　　　　　　周跃钢等　豇豆根瘤亚细胞组分中ASAL 的分段盐析