全 文 ：收稿日期：2009-06-12
基金资助：国家“863”计划（2006AA06Z357）、北京市科学技术委员会和国家现代蔬菜产业技术体系建设项目
作者简介：王宏乐（1984 -）,女，湖南邵阳人，硕士研究生，研究方向：土传病害生物防治。E-mail:teajam@163.com.
摘 要：本文建立了土壤中黄瓜枯萎病病原物的 Real-time PCR监测方法，该方法能准确快速反应环境中的病原物数量变化，
且检出限为 2 ng·g-1。进一步研究黄瓜枯萎病感病品种津研 4号和抗病品种中农 10号根分泌物对土壤中黄瓜枯萎病病原菌的
影响。结果表明，抗病品种和感病品种根际的枯萎病菌数量变化趋势明显不同。抗病品种的根分泌物抑制枯萎病菌在土壤中的
存活，第 14 d已不能检出。而感病品种的根分泌物却能延长枯萎病菌的存活时间，第 21 d，LgQ为 2.32±0.07。
关键词：Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum；根分泌物；实时荧光定量 PCR；黄瓜品种
中图分类号：S432.3+9 文献标识码：A
Effects of Root Exudates of Cucumber on Population of Fusarium
oxysporum f.sp. cucumerinum in Soil as Detected by Real-time PCR
WANG Hong-le
(Key Laboratory of Biological Control, Ministry of Agriculture, Institute of Plant Pretection, CAAS, Beijing 100081,China)
Abstract：A fast and accurate method was established to detect Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum (Foc) in the soil which caused
cucumber wilt, and the detection limit was 2 ng·g-1. Effects of cucumber root exudates on the population of Foc were further detected.
Tests of the effects of root exudates on the survival of Foc in natural soil showed that root exudates from resistant cultivar shortened
the survival period of Foc, and it could not be detected on 14th day. While that from susceptible cultivar could prolong the survival
period of Foc; the LgQ was 2.32±0.07 on 21th day.
Key words: Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum; root exudates; Real-time PCR; cucumber cultivars
文章编号：1671－9964（2010）01－0041-05
荧光定量 PCR监测黄瓜根分泌物对土壤中枯萎病菌生物量的影响
王宏乐
（中国农业科学院 植物保护研究所，农业部生物防治重点实验室，北京 100081）
黄瓜枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp. cucumeri－
unum)是严重影响黄瓜生产的一种重要土传病害，不
同黄瓜品种对枯萎病的抗病性存在着明显差异[1-4]，
诸多研究表明抗感品种根分泌物对病原菌生长影
响差异很大[5]。韩雪等对 6个抗枯萎病性能不同的
黄瓜品种根系分泌物进行了收集和测定，采用平板检
测方法研究报道了其对黄瓜抗病品种根系分泌物对枯
萎病病原菌孢子萌发、菌丝生长及病原菌生物量 3项
指标有显著的抑制作用，而感病品种根分泌物则有显
著的促进作用[6]。黄奔立等也平板检测了不同黄瓜抗枯
萎病品种根分泌物对枯萎病菌的影响，也得到了感病
品种根系分泌物促进了黄瓜枯萎病菌的生长, 而抗病
品种和云南黑籽南瓜根系分泌物则抑制病菌生长的
结果[7,8]。
虽然前人使用平板检测研究不同抗性品种根分
泌物与病原的关系得到了一些结果，但是却不能体
现病原菌在植株根际对根分泌物的实时反应。近年
发展起来的实时荧光定量 PCR（Real-time PCR）技
术为快速、准确和灵敏地定量监测土壤微生物提供
了一种十分有效的手段，解决了传统方法灵敏度不
高，特异性不够，无法实现环境中特异病原微生物的
实时监测等缺点，使从基因水平上定量监测各种生
物体成为可能。Leonardo建立了土传真菌 Phytoph－
thora nicotianae, Phytophthora citrophthora，Rosellinia
necatrix及 Verticillium dahliae的定量监测体系用于
土传病害的预防与治理[9]。Corey利用定量 PCR技术
检测了模拟根际环境下，体外添加根分泌物对土壤
真菌群落组成和多样性的影响，发现根分泌物的作
DOI：10.3969/j.issn.1671-9964.2010.01.008
上海交通大学学报 (农业科学版 )
JOURNAL OF SHANGHAI JIAOTONG UNIVERSITY (AGRICULTURAL SCIENCE)
Vol．28 No．1
Feb．2010
第 28卷 第 1期
2010年 2月
上海交通大学学报 (农业科学版 ) 第 28 卷
用与种植同种作物产生的影响表现相一致，认为根
分泌物是引起土壤真菌群落组成和多样性改变的主
要原因[10]。Steven利用定量 PCR监测澳洲玉米根际
6种镰刀菌的种群变化趋势来研究水肥管理对作物
根际微生物的影响[11]。利用荧光定量 PCR监测土壤
中的植物病原物，为深入理解病害的发生发展和指
导病害防治及农业生产抗病品种和优质、高产感病
品种的合理利用提供理论依据；探索在连作条件下，
利用抗病品种（抗重茬）根系分泌物的抑病（菌）作用
控制或减轻连作病害的可能性。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
1. 1. 1 寄主及病原物 黄瓜（寄主）：黄瓜枯萎病
感病品种津研 4号和抗病品种中农 10号，均由中国
农业科学院蔬菜花卉研究所提供。黄瓜枯萎病病原
菌（Fusaium oxysporum f.sp. cucumerinum，Foc），本
实验室分离保存。
1. 1. 2 供试土壤 采自中国农业科学院东门外，
前茬作物为小麦。土样风干后，过 2 mm筛，混匀。
1. 1. 3 黄瓜枯萎病病原菌的培养 采用改良查氏
培养液，28 ℃，180 r·min-1培养 5 d后，将含有孢子
和菌丝的培养液双层纱布过滤得获得菌丝。
1. 1. 4 育苗及根分泌物的收集 供试种子经 1%
次氯酸钠表面消毒 10 min，无菌水冲洗 3次后，置
于 90 mm培养皿中灭菌滤纸上，加无菌水 2 mL，28
℃下萌发出芽后，置于 25 ℃光照培养箱中光暗交替
培养（14 h/10 h），待上述苗育至长出两片真叶时，用
于根系分泌物收集。
上述苗移至装有 10 mL日本山崎营养液[8]的试
管中（每管 1株），25 ℃、光暗交替培养（14 h/10 h），
每 7 d收集一次根分泌物液，共收集 20株苗，每株
收集的根分泌物用蒸馏水先定容到 10 mL，整个收
集过程共 28 d。收集的根分泌物全部混匀，随后添
加至供试土壤中[7,8]。
1. 2 抗感品种根分泌物中总糖的测定
采用硫酸苯酚法及硫酸蒽酮法测定根分泌物的
总糖含量[12]。
1.3 土壤中黄瓜枯萎病病原菌的定量监测
采用 SYBR GREEN染料法对土壤中的 Foc定
量监测。定量方法使用绝对定量法[13]。
1. 3. 1 Foc RAPD Marker OPZ-12865标准品的制备
标准品制备及引物设计参考 Bart，目的基因为黄瓜枯
萎病病菌 OPZ-12865区（EF056791.1），目的片段长为
244 bp[14]。
在 Bio-Rad iQ5荧光定量 PCR 仪上扩增，反应
体系为 25 μL：SYBR Premix Ex TaqTM (2×)12.5 μL
（Takara公司）；上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL
（Takara公司合成）；去离子水 9.5 μL；模板 2 μL。两
步法扩增：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，62 ℃ 30 s，45个循
环。每个样品 3个重复，取平均值。数据收集主要由
Bio-Rad iQ5操作软件完成，数据分析与结果计算
参考文献[13.14]。
M分子量=（244+载体 2692）bp×650 daltons/
base pair=1905400 daltons
重组质粒拷贝数=（质粒浓度×0.5 g土×模板
2μL）/(50μL×分子量 M) ×6.02×1023
1. 3. 2 土壤中黄瓜枯萎病病原菌的定量监测
菌丝用组织均浆机 10 000 r·min-1，5 min打成菌丝
段。将所得的匀浆液用铺有三层灭菌滤纸的布氏漏
斗抽滤至无液滴滴下。称取 1 g菌丝匀浆液，用 9
mL无菌水稀释，作为稀释 10-1样品，依次稀释为制
备成 10-5、10-6、10-7 、10-8、10-9 5个梯度。每个浓度
取 2 mL加入到 10 g过 2 mm筛的风干土壤中。设
不加菌的空白对照，每个样品 3个重复。
取土 0.5 g（干重），用Mobio（USA）土壤 DNA提取
试剂盒从制备的土壤样品中提取 DNA作为模板，土
壤 DNA定量扩增采用绝对定量法，按照李光伟等[13]方
法进行。
1. 4 根分泌物对土壤中黄瓜枯萎病菌存活的影响
称取自然土 10 g于 50 mL离心管中，每管添加
2 mL 10-3 g·mL-1的菌丝液(抽滤后的菌丝用组织匀
浆机 10000 r·min-1、5 min打成菌丝段，将所得的菌
丝液用铺有 3层灭菌滤纸的布氏漏斗抽滤至无液滴
滴下，称取 1 g菌丝，用 9 mL无菌水稀释，作为 10-1
样品)，即浓度为 200 μg·g-1土，添加物按 40%（W/
V）添加，旋涡震荡仪混匀，放置于 25 ℃，湿度控制
为 20%~45%。每 7 d取 0.5 g土样用于枯萎病菌的
检测，并在取样后添加一次根分泌物，共添加 4次根
分泌物。
添加物分别为：感病品种根分泌物、抗病品种根
分泌物、感病品种根分泌物+抗病品种根分泌物（V/
V=0.5: 0.5）、同时设阳性对照和阴性对照。阳性对照
为葡萄糖溶液，其葡萄糖的含量根据 1.2测定的根
分泌物中总糖含量设定在 200 μg·mL-1；阴性对照为
用于根培养的山崎营养液。每处理重复 3次。土壤
DNA定量扩增方法同 1.3.1。
1. 5 数据收集及处理
使用 Excel2003及 SAS进行数据分析。
42
第 1 期




 
 

 
 114.003.70 115.000.71
 123.330.70 130.004.24

/pg     
Plasmid dilution Copy numbers Ct(meanS. D) CV/%
1.00E-02 6.32E+01 35.190.19 0.54
1.00E-01 6.32E+02 31.060.08 0.26
1.00E+00 6.32E+03 27.640.65 2.35
1.00E+01 6.32E+04 24.600.13 0.53
1.00E+02 6.32E+05 20.651.45 7.02
1.00E+03 6.32E+06 17.120.24 1.4
Foc
   
Foc dilution/(ng·g ) Copy numbers Ct(mean S. D) CV/%
Control(-) 0 N/A N/A
2.00E-01 N/A N/A N/A
2.00E+00 6.31E+01 35.70 0.51 1.44
2.00E+01 4.39E+02 32.45 0.64 1.98
2.00E+02 5.32E+03 28.52 0.06 0.22
2.00E+03 2.01E+04 26.48 0.30 1.13
图 3 实时荧光定量 PCR定律监测土壤中 F.oxysporum f.sp.
cucumerinum
Fig.3 Standardcurves forF.oxysporum f.sp.cucumerinum in soi
图 1 实时荧光定量 PCR检测
F.oxysporum f.sp. cucumerinum的标准曲线
Fig.1 Standard curve of F.oxysporum f.sp. cucumerinum assay
detected by real-time PCR
2 结果与分析
2. 1 根分泌物中糖含量测定
分别采用蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法测总糖，结
果表明抗病品种与感病品种根分泌物中糖类物质的
含量在统计学上有显著差异，感病品种总糖含量高
于抗病品种（表 1）。
2. 2 重组质粒标准曲线制作
将标准质粒 Foc RAPD marker OPZ-12865 进行
10倍梯度稀释后，选取 6.32×101-6.32×106 Copies·
μL-1的稀释样品作为模板进行 PCR反应，3个重复
变化不大，变异系数（CV%）很小，建立的标准曲线
（表 2，图 1）具有较好的精确度和良好的重复性。由
溶解曲线(图 2)可见，目的产物熔解温度为 82.0 ℃，
引物二聚体熔解温度为 74.5 ℃, 产物单一，引物二
聚体不影响目的基因的扩增。
2. 3 土壤中 F.o. f.sp. cucumerinum的定量监测
在菌丝浓度为 0.2 ng·g-1土至 2 μg·g-1土之间，
3个重复之间的拷贝数变化不大，变异系数很小，通
过数据的回归分析证实所得拷贝数符合统计学要求
（表 3，图 3）。未添加菌及 0.2 ng·g-1均未能检测到信
号，检测限为 2 ng·g-1，即 63.1个拷贝数，利用本方
法能准确高效灵敏地用于黄瓜枯萎病病原的环境监
测。
2. 4 根分泌物对土壤中黄瓜枯萎病菌存活的影响
实验 3个重复的检测值相差不大，数据重现性
较好，符合统计学要求。检测结果（图 4）表明，0 d
表 1 根分泌物中可溶性糖的含量
Table 1 Soluble sugar content in root exudates
Letters following numbers indicate the Significant difference by
Student’s Newman-Keuls test at P= 5%.
表 2 不同质粒浓度 Real-time PCR检测的精度
Table 2 Precision of standard plasmids of different
concentrations detected by Real-time PCR
Th
re
sh
ol
d
Cy
cl
e
表 3 自然土壤中添加不同浓度的病原DNA扩增效果及分析
Table3 Amplificationanddata analysis of the gradient inoculation
quantity ofF. oxysporum f.sp.cucumerinum innon-steril soil
LogStarting Quantity,copy number
FAM E=91.6% R＾2=0.992 slope=-3.541 y-int=41.211
图 2 熔解曲线
Fig.2 Melt curve of F.oxysporum f.sp. cucumerinum assay
detected by real-time PCR
d(
RF
U)
/d
T
Target, 82.0 ℃
Dimmer, 74.5 ℃
→
→
Temperature,Celsius
LG(Con)
LG
(C
op
y) y=0.8594x+1.5707
R2=0.9878
王宏乐，等：荧光定量 PCR监测黄瓜根分泌物对土壤中枯萎病菌生物量的影响 43
上海交通大学学报 (农业科学版 ) 第 28 卷
时，所有处理的初始生物量拷贝数为 4E+06，对数值
（LgQ）为 6.65±0.10；7 d后所有处理病原菌数量 LgQ
在 5.04~5.18之间，均开始下降，下降率约 22.1%~
24.2%；14 d时添加抗病品种根分泌物的处理 R已
检测不到病原菌。添加感病品种根分泌物的处理 S
的 LgQ为 2.53±1.10，阳性对照和阴性对照之间的
生物量相差不大，处理 S，RS，Control(-)，Control(+)的
菌量下降率分别为 61.8%、76.8%、66.7%、69.6%；到
21 d时，负对照的菌量亦趋为 0，而 RS与正对照的
LgQ相近，分别为 1.34±0.08和 1.69±0.41，与初始生
物量相比减少了 79.8%和 74.6%，处理 S的 LgQ为
2.32±0.07，生物量下降率为 65.1%，下降得最为缓
慢；第 28 d，所有处理的菌量均趋为 0。
结果表明，抗病品种的根分泌物抑制病原菌在
土壤中的存活，感病品种根分泌物却能加强病原菌
的存活能力，而 Foc 量在添加混和根分泌物（0.5:
0.5）的处理处于二者之间。
3 讨论
由于尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起的黄瓜枯萎病
的发生不仅涉及病原与寄主，还涉及土壤及土壤微
生物等极为复杂的生态环境，包括生物缓冲区及土
壤抑菌作用等，对土传性病害发生规律及其防控技
术的研究一直是植物病害研究的难点之一。前人研
究根分泌物与土传病原的关系多采用菌丝生长速率
测定法等，但是由于土壤环境的复杂性使得根分泌
物对土壤中病原菌的影响的相关研究缺乏更有力的
证据。并且传统的检测方法还存在精准度不够的问
题。定量 PCR技术解决了常规方法精准度差，无法
实现环境中病原菌的检测的问题。目前，国内利用荧
光定量 PCR研究根分泌物与病原物的关系的文章
几乎没有，而国外也是刚刚开始。以定量 PCR技术
为手段，人们可以从生态学角度直接研究植物与病
原互作发生的过程。
本实验将黄瓜枯萎病病原菌添加到土壤中，采
用 Real-time PCR 对土壤中的病原物进行定量监
测。土壤中的一些有机成分如腐殖酸、褐黄酸等物质
可能影响样品 DNA的提取。Sarah报道使用 Mobio
试剂盒不能很好的提取土壤中未萌发的真菌孢子，
即使它们在土中的浓度达到 108个·g-1[15]。为了避免
土壤中的病原菌在逆境中形成孢子而不能检出，本研
究设计体外实验选择添加抗逆性极差的菌丝匀浆液尽
量避免菌丝在不良环境中形成孢子对 DNA提取的影
响。虽然，PCR能对从已死亡的菌丝中提取出的 DNA
进行扩增，但是在土壤生态环境中，这些菌丝死体会被
其他微生物迅速消解掉，因此认为真菌死体对土壤中
病原真菌的定量影响不大[16,17]。本研究采取添加菌丝匀
浆液的方法，使用Mobio试剂盒提取得到 DNA能够
做出较好的标准曲线。土壤中 Foc的检测限为 2 ng·
g-1土，这与他人报道结果相一致[9,18]。土壤中其他镰
刀菌对病原菌 Foc数量并无影响，该方法特异性很
高，能用于土壤中黄瓜枯萎病病原的定量监测，能准
确快速反应环境中的病原物数量变化。由于实际连
作生产中，土壤中真菌孢子必然存在，因此土壤
DNA的提取方法上还需进一步的改进。本文为大田
监测黄瓜枯萎病病原种群动态奠定了基础。
当植株存在时，植物脱落物可为病原菌提供其
它碳、氮源，对研究根分泌物与病原菌的关系造成影
响[6,19]。同时为了避免病原孢子在营养匮乏情况下不
萌发从而影响土壤中病菌生物量的测定，而菌丝抗
逆能力远小于分生孢子。本研究设计体外添加根分
泌物对病原菌丝的存活影响的实验。该实验中，阴性
对照处理并未添加碳氮源，营养物质的缺乏，造成病
原菌数量的快速下降，而阳性对照添加 200 μg·mL-1
的葡萄糖可以延缓菌丝消解，这与他人报道相符[20]，
说明本实验获得的结果真实可信。相比阴性对照处
理，抗性品种根分泌物的添加能加速土壤中菌丝的
消解，而感病品种根分泌物的添加有利病原菌的存
活。这与前人用常规方法研究报道黄瓜、棉花抗病品
种根分泌物抑制病原物生长，而感病品种促进病原
物生长相一致[6-8,21]。作者推测感病品种根分泌物中
可能有某类物质能够促进病原物的生长，从而延长
了病原菌的存活时间；抗病品种根分泌物中可能是
图 4 黄瓜抗感品种根分泌物对土壤中菌丝存活的影响
Fig.4 The population dynamics of Foc in response to root
exudates of the resistant and susceptible cucumber cultivars in soil
注：R: 抗病品种中农 10号根分泌物；S: 感病品种津研 4 号根分泌
物；RS: 中农 10号，津研 4号根分泌物 0.5: 0.5混合；Control (+)：200
μg·mL-1葡萄糖；Control (-)：添加山崎营养液.
Note:R：root exudates from resistant cultivar Zhongnong 10; S：root
exudates from susceptible cultivar Jinyan 4; RS：mixure of root exudates
from Zhongnong 10 and Jinyan 4 at 0.5:0.5; Control (+)：200μg·mL-1
glucose; Control (-)：soil added nutrition solution.
LG
Qu
an
tit
y
日期 Time/d
π
s
πs
Contral(-)
Contral(+)
44
第 1 期
缺少此类物质或者是能分泌其它抑制因子。且处于
中间位置的抗感品种混合处理也可以部分说明这个
原因。
本研究明确了抗感黄瓜枯萎病品种根分泌物对
土壤中的病原菌的作用不同。作者采用定量 PCR技
术研究抗感品种黄瓜根分泌物对土壤中病原菌的影
响，相比以往方法更贴近于大田实际情况。虽然本研
究仅选用了两个品种做初步研究，但是所得的结果
对揭示黄瓜枯萎病的发病规律，以及建立该病害的
防控技术提供了工作基础以及理论基础。从化学生
态学角度进一步研究抗感品种根分泌物组分的差
异，对深入揭示根分泌物与抗病性的关系具有十分
重要的意义。
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