全 文 ：注:菌株第 1、2、3个英文字母代表土样来源,最后一个英文字
母代表种子类型;DD为德都;LYG为连云港;SJZ为石家庄;HD为
邯郸;XT为邢台;WM为吴名;E表示豇豆品种鄂豇 1号;Z表示豇
豆品种早丰。
表1 供试菌株和参比菌株
菌株
XTE4
DDZ3DDZ4
LYGE1LYGE2LYGZ4LYGZ5
SJZZ1SJZZ6
HDE1HDE4HDZ2
WMZ4WME5
S.frediUSDA205
S.frediUSDA194
M.tianshanenseCCBAU3306
M.lotiNZP2213
R.legumenosarumUSDA2370
R.legumenosarum127K17
供
试
菌
株
参
比
菌
株
宿主植物
豇豆
豇豆
豇豆
豇豆
豇豆
豇豆
野大豆
野大豆
刺果甘草
百脉根
菜豆
菜豆
来源
河北邢台
黑龙江德都
江苏连云港
河北石家庄
河北邯郸
河南吴名
美国
美国
新疆
美国
美国
美国
文章编号:0439-8114(2006)05-0593-03
第45卷第5期
2006年9月
湖北农业科学
HubeiAgriculturalSciences
Vol.45No.5
Sept.,2006
收稿日期:2006-06-16
基金项目:国家“973”重点基础研究项目(001CB1089)和农业微生物国家重点实验开放基金项目(Aml-0309)
作者简介:袁天英(1978-),女,河南安阳人,2003级硕士研究生,主要从事根瘤菌多样性和生物固氮遗传学方面的研究,
(电子信箱)yuanty0924@tom.com;通讯作者,周俊初,(电话)027-87281685(电子信箱)zhoujunchu@mail.hzau.edu.cn。
豇豆(Vignaunguiculata)属一年生草本,是豆
科豇豆属植物。豇豆又称豆角,以嫩荚和种子供食
用,原产于非洲东北部和印度,中国为第二起源中
心[1]。嫩荚富含蛋白质和维生素C等营养,主要作蔬
菜食用。干子粒除含淀粉外,蛋白质含量亦较丰富,
并有多种氨基酸、矿物质和多种维生素。茎叶是优
质饲料,也可作绿肥[2]。由于我国地域辽阔、地质构
造复杂、地理和气候环境多样,因而也是世界上根
瘤菌资源和多样性最丰富的国家之一[3]。目前,进行
豇豆根瘤菌资源的调查研究对于保护和发掘我国
根瘤菌资源、发挥资源优势具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 供试菌株与参比菌株
本研究自豇豆根瘤中分离的 14个菌株和 6个
参比菌株见表1。
1.2 培养基和培养条件
根瘤菌的分离和培养采用YMA培养基[4]。碳、
氮源利用的测定采用WHITE培养基 [6]进行质粒快
速检测时采用PA培养基[5],培养温度为28℃。
1.3 研究方法
1)供试菌株的分离、纯化和回接 从河北省石
家庄、邢台和邯郸等地采用五点取样法采集土壤样
品。以豇豆为捕获植物,以土样悬液为接种剂,无菌
砂培豇豆来捕获根瘤菌。采集根瘤经初步纯化并经
镜检确认无污染后选取分离物进行回接试验,回接
时分别取各自宿主植物,用Jensen无氮植物营养液
[5]进行盆栽试验,各菌株接种处理和不接种对照分
设3～5个重复,人工光照室培养(25～28℃,每日光照
12～14h),30d后观察结瘤情况。能使其宿主结瘤的
菌株为供试菌株并编号。
2)耐盐性测定 先制备每 100mL含 NaCl分
别为0.4g、0.8g和1.0g的YMA平板,然后将供试
中国北方地区快生豇豆根瘤菌的多样性研究
袁天英,杨成运,张伟涛,周俊初
(华中农业大学农业微生物国家重点实验室,武汉 430070)
摘要:从采自不同土壤中的豇豆(Vignaunguiculata)根瘤中分离、纯化并通过结瘤试验筛选出 14株豇豆
快生根瘤菌,将其和来自其他种属的6个参比菌株的耐盐性、耐酸碱性、天然抗药性、碳源与氮源利用和
质粒图谱分析进行了系统比较,通过聚类分析得到供试菌株的数值分类树状图谱。结果表明,分离自不
同土壤中的豇豆快生根瘤菌具有较大的多样性。在 77%的相似水平上,快生豇豆根瘤菌与参比菌株分
为4个亚群,亚群中部分菌株的相似性与分离的土壤有关,而6株参比菌株则分别独立形成两个亚群。
关键词:豇豆;根瘤菌;多样性;质粒快检;聚类分析
中图分类号:S643.4;S154.38+1 文献标识码:A
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2006.05.025
菌株接种至不同盐浓度平板上,同时以YMA培养基
为对照,各作3个重复,28℃培养,3～6d后观察结果。
3)pH值生长范围的测定 用 HCl和 NaOH分
别将 YMA液体培养基的 pH值调到 4.0、5.0、6.0、
7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和 12.0,分别接种供试菌株,
各设3个重复,28℃摇床培养3～6d后,测定菌悬液
光密度(D625nm)值[7]。
4)天然抗药性的测定 供试氨苄青霉素、四环
素、卡那霉素、链霉素、新霉素、壮观霉素、红霉素、
萘啶酮酸和利福平溶解后,经过滤除菌制成贮存
液。测定时按抗生素的终浓度计算加入的贮存液
量,准确加入至融化后冷却至50℃左右的YMA培
养基中,摇匀,制成所需浓度平板。将供试菌株接种
在抗性平板上,均为 3个重复,并以不加抗生素的
YMA为对照,28℃培养3～6d后,观察记录结果[8]。
5)碳、氮源利用的测定 采用WHITE法,将10
mL经过滤除菌或 115℃、15min湿热灭菌的 0.1g·
L-1供试碳源和 0.75mL无碳基础培养基 B组分加
入融化并冷却至50～60℃的90mL的无碳基础培养
基A组分中,使碳源的终浓度为0.01g·L-1。供试菌
株在YMA液体培养基中培养后,离心收集菌体并
用生理盐水洗 3次,配制成含菌浓度为每毫升 1×
108个的菌悬液,用多头接种器接种平板,各菌设 3
个重复,同时设立 YMA和不加碳源的对照,28℃培
养3d和6d后各记录1次结果。氮源试验方法同
碳源测定,但需加入甘露醇取代NaNO3制成无氮基
础培养基,供试氮源的终浓度0.01g·L-1[4]。
6)根瘤菌质粒的快速检测 采用修改过的
Eckhardt方法检测[9]。
7)聚类分析 先将供试性状转换为数字性状,
如根据供试菌株的生长情况,可将能在供试平板上
生长或形成典型菌落者记为”1”,否则记为”0”,然
后采用“NTSYS-PCAppliedBiostatics,Inc”软件,以
平均连锁法(UPGMA)聚类系统自动生成树状图谱。
2 结果与分析
2.1 供试菌株的分离与纯化
从生长在德都、连云港等6个地区不同土壤类
型上的豇豆根瘤中获得的分离物样品中经分离、纯
化得到待测根瘤菌。所有供试菌株经革兰氏染色反
应镜检均为负反应,呈短小杆状。在菌落形态上,快
生型为圆型、黏液较丰富、白色或半透明、在加有
BTB(溴百里香酚兰)的YMA平板上呈黄色。
2.2 耐盐性与耐酸、碱性
耐盐性检测结果表明,所有菌株表现出较一致
的耐盐性。所有菌株在 0.4%NaCl浓度下都能够生
长,当NaCl浓度为0.8%只有WME5可以生长;而在
0.8%NaCl浓度以上几乎所有的菌株都不能生长。同
时供试菌株表现出较强的耐酸性,有 7个菌株在
pH值为 4时仍能生长,而耐碱性都比较弱,在 pH
值为11时只有3个菌株能生长,在pH值为12时
所有的菌株都不生长。但是不同菌株间表现出不同
的pH值生长范围,分离自连云港和邯郸土壤中的
菌株 LYGE1和 HDE4其 pH值生长范围较大,pH
值在4～11都能生长;而分离自黑龙江德都和石家
庄土壤中的菌株 DDZ4和SJZZ1其pH值生长范围
却较小,pH值小于5和大于10都不能生长。此外,
从连云港土壤中分离得到的 3株根瘤菌在耐酸碱
性方面存在很大差异,如 LYGZ4与其余两个菌株
相比,耐酸碱性相对都较弱。
2.3 天然抗药性(IAR)
供试菌株对 9种抗生素的天然抗药性测定结
果表明,多数菌株对新霉素(20μg·mL-1)、四环素
(15μg·mL-1)表现出很强的抗性,而对链霉素(10
μg·mL-1)和红霉素(30μg·mL-1)敏感。约70%的菌
株对氨苄青霉素(25μg·mL-1)、利福平(15μg·mL-1)、
萘啶酮酸(100μg·mL-1)、卡那霉素(30μg·mL-1)表
现抗性。此外,菌株间对不同或不同使用浓度抗生
素的抗性差异较大。即使是来自同一地域的菌株之
间也有部分差异,如从德都土壤中分离出的两株菌
株中,菌株DDZ3对氨苄青霉素(25μg·mL-1)、链霉
素(20μg·mL-1)敏感,而另一菌株 DDZ3对氨苄青
霉素(70μg·mL-1)、链霉素(30μg·mL-1)仍表现出抗
性,但对卡那霉素(10μg·mL-1)却表现敏感。
2.4 碳源和氮源利用
由菌株对 12种供试碳源利用的结果可知,供
试菌株能利用的碳源范围十分广泛,不仅能利用葡
萄糖、半乳糖等单糖,也能利用乳糖等双糖。同时甘
油、山梨醇、甘露醇等都是它的合适碳源,多数菌株
也能利用糊精和木糖,相比之下,这些菌株对果糖
的利用能力较差。供试菌株对13种氮源的利用情
况表明,供试菌株对氮源的利用范围相对较窄,在
13种供试氮源中就有L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-
色氨酸、L-赖氨酸和硝酸钾5种供试氮源几乎不能
被利用。供试菌株大多数能在 L-脯氨酸、L-酪氨
酸、L-亮氨酸、L-丝氨酸、L-组氨酸、L-缬氨酸和蛋
白胨上生长,利用率均大于 90%,绝大部分菌株也
能利用硫酸铵,但利用能力较差。
2.5 质粒图谱
用快速检测质粒的方法(Eckhardt方法)[9]对供
试菌株的质粒进行了检测。检测结果表明,供试的
14个快生型菌株均含有1～4条质粒带。根据质粒的
594 湖 北 农 业 科 学 2006年
大小及其数目将不同菌株的质粒图谱分为不同类
型,部分菌株的质粒图谱如图1所示。从图 1可以
看出,供试的14个菌株的质粒组成存在差异,表现
出6个不同的质粒图谱类型。菌株所具质粒图谱类
型的分布情况见表2。从表2可知,具有第6类质粒
图谱特征的菌株最多,占快生型菌株的43%;而3、4
和 5类质粒图谱的菌株各占 14.3%;1和 2类质粒
图谱的菌株各仅占7%,表现出了较为丰富的多样
性。
2.6 表型性状聚类分析
对上述所测表型数据采用平均连锁法聚类,结
果如图2。从图2中可以看出全部菌株在67%的相
似水平上聚成一类,均为快生根瘤菌。在77%的相
似水平上则分为4个亚群,亚群1、2中都不含参比
菌株,分离自连云港和邯郸土壤中的菌株都聚为一
类,而分离自黑龙江德都的两个菌株则分别在亚群
1和2中。亚群3的参比菌株USDA205、USDA194、
CCBAU3306、NZP2213聚为一类,两个参比菌株
USDA2370、127K17独立形成亚群4。
3 讨论
表型分析结果表明,供试快生根瘤菌在加有
BTB的 YMA平板上呈黄色,都能够耐受 0.4%Na-
Cl,这与 Eaglesham等(1987)对 Bradyrhizobium sp.
的研究相一致。这些菌株能利用双糖、三碳糖、五碳
糖和己糖,其中甘露醇、葡萄糖、甘油、乳糖、山梨醇
等是良好的碳源。多数也能利用木糖,这与樊蕙等
(1986)报道有少许差异。而且对氮源的利用与已知
文献相比也有较大出入。这些菌株利用硝酸钾和甲
硫氨酸的能力很差,却能利用丝氨酸。
通过聚类分析研究,20株根瘤菌在77%的相似
性上分为4个亚群,而14株供试菌株在80%相似
性上分为2个亚群,而亚群中多数菌株的相似性与
分离地有关。但个别菌株即使它们分离自不同土
壤,甚至不同宿主,其表型性状的相似性仍然很高,
图1 部分菌株的质粒图谱
表2 供试菌株的质粒图谱类型
质粒图谱
类型编号
1
2
3
4
5
6
各类型菌株
所占比例/%
7.0
7.0
14.3
14.3
14.3
43.0
菌株
DDZ4
WME5
HDE1;XTE4
SJZZ1;SJZZ6
WMZ4;LYGZ5
LYGE1;LYGZ4;LYGE2;
HDZ2;HDE4;DDZ3
图2 供试菌株的数值分类树状图
第5期 595袁天英等:中国北方地区快生豇豆根瘤菌的多样性研究
GeneticDiversityofVignaunguiculataRhizobiaFrom theNorthRegionofChina
YUANTian-ying,YANGCheng-yun,ZHANGWei-tao,ZHOUJun-chu
(StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)
Abstract:Fourteenstrainsoffast-growingrhizobiawereisolatedandpurifiedfromdiferentregionsrepresentingthetypical
vigna ofChina.These strainsand six reference strainswere comparatively studied by determining theirbiological
characteristicsincludingsaltstress,acid-alkaliendurance,resistanceofintrinsicantibiotics,utilizationofcarbonandnitrogen
sourcesandplasmidprofiles.Thedendrogramwasdescribedbyusingclusteranalyses,andthebiodiversityofrhizobiaisolated
fromvignawasshown.Atthesimilarityof77%,alstrainscouldbedividedinto4subgroups.Similaritiesofsomestains
clusteredintoasubgroupwererelatedwithgeographicalsamplingsites.And6referencestrainsclusteredintotwosubgroups
respectively.
Keywords:Vignaunguiculata;rhizobia;biodiversity;clusteranalysis
表3 各亚群菌株的鉴别特征
性状
ρ(NaCl)/g·100mL-1=0.4
ρ(NaCl)/g·100mL-1=0.8
pH值4.0时生长
pH值11.0时生长
天然抗药性
Amp(50μg·mL-1)
Spe(20μg·mL-1)
Rif(10μg·mL-1)
Ery(20μg·mL-1)
Nal(100μg·mL-1)
Neo(30μg·mL-1)
Km(30μg·mL-1)
Tc(15μg·mL-1)
Str(30μg·mL-1)
惟一碳源
甘露醇
蔗糖
乳糖
山梨醇
果糖
糊精
肌醇
半乳糖
甘油
麦芽糖
木糖
唯一氮源
L-Met
L-Phe
L-Trp
L-Pro
L-Tyr
L-Lys
L-Leu
L-Ser
L-His
L-Val
KNO3
蛋白胨
(NH4)2SO4
亚群1(11)
+
+(1)
+(7)
+(3)
+(6)
+(5)
+(7)
+(4)
+
+
+(10)
+
-
+
+
+
+
+(2)
+
+
+
+
+
+(9)
-
-
-
+
+
-
+
+
+
+
+(1)
+
+
亚群2(3)
+
-
-
-
+
+(2)
+(2)
-
-
+(2)
-
+
+(1)
+
+
+
+
+(1)
+
+
+
+
+
+(2)
+(1)
-
-
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
亚群3(4)
+
+
-
+(3)
+(1)
+(2)
+(1)
+
+
+
+(3)
+
+(1)
+
+
+(1)
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
-
+(2)
+(2)
-
+
-
+(2)
-
+
+
+
亚群4(2)
+
+
-
+(1)
+
-
+
+(1)
+(1)
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
-
+(1)
+(1)
-
-
+
+
+(1)
+
+
+
注:“+”示所有的菌株均为正反应;“-”示所有的菌株均为负
反应;括号内所示数字为有正反应的菌株。
如第一亚群的 HDE1和 XTE4其相似性高达 90%;
而有些菌株即使它们分离自同一土壤,甚至同一宿
主,其表型性状却存在很大差异,如 DDZ3和 DDZ4
尽管都分离自德都土壤,但它们分属于不同的亚
群。以上结果表明了快生型豇豆根瘤菌在形态、生
理生化、抗逆性等方面表现出多样性。通过快生型
菌株的质粒检测发现其质粒图谱的差异与其表型
性状的检测结果有一定的相关性。如第3类质粒图
谱的菌株与表型结果一致。但大部分菌株的质粒组
成具有多样性。如亚群1的菌株的质粒型分属于第
2、4、5和第 6质粒型;菌株 DDZ4、SJZZ1和 SJZZ6
在表型分类中均属于亚群2,而质粒型却分别属于
第1和第3质粒型。本研究结果表明分离自不同土
壤的豇豆根瘤菌是一个复杂的群体,表现出丰富的
表型多样性。此外,此项研究也对我们了解我国豇
豆根瘤菌的分布,保存根瘤菌资源有重要意义。
参考文献:
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(责任编辑 郑 威)
596 湖 北 农 业 科 学 2006年