全 文 ：Research Paper 研究报告
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica
50(8):1072 － 1079;4 August 2010
ISSN 0001 － 6209;CN 11 － 1995 /Q
http:/ / journals. im. ac. cn / actamicrocn
基金项目:国家“973 项目”———国家重点基础研究发展计划(2009CB119000);公益性行业(农业)科研专项经费(3-25，nyhyzx07-050);国
家“十一五”国家科技支撑计划(2006BAD07B03，2006BAD08A08，2006BAD17B08)
* 通信作者。Tel / Fax: + 86-10-82109545;E-mail:xiebingyan2003@ yahoo. com. cn
作者简介:赵志祥(1981 －)，男，湖南岳阳人，博士研究生，研究方向为微生物资源与利用。E-mail:zhaozhixiang0207@ 126. com
收稿日期:2010-01-29;修回日期:2010-03-24
温室黄瓜根结线虫发生地土壤微生物宏基因组文库的构建及
其一个杀线虫蛋白酶基因的筛选
赵志祥1，2，芦小飞2，陈国华2，杨宇红2，茆振川2，刘二明1* ，谢丙炎2*
(1湖南农业大学生物安全科技学院，长沙 410128)
(2中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081)
摘要:【目的】本研究旨在通过非培养手段构建和筛选宏基因组文库，以求找到新型的杀线虫蛋白酶基因。
【方法】采用密度梯度离心法提取和纯化温室土壤微生物总 DNA，经平末端、连接、包装、转染后，构建宏基因
组 Fosmid 文库，同时，以脱脂奶为底物，以根结线虫为靶标，对文库进行功能初筛。【结果】该文库库容
31008 个克隆，平均插入片段 36. 5 kb，包含 1. 13 Gbp 的微生物基因组信息，适合大规模的微生物功能基因
筛选，通过功能初筛，筛选到 1 个含杀线虫蛋白酶基因的 Fosmid 克隆(pro12)。进一步构建和筛选出亚克隆
(espro124a5)，通过对基因结构进行了初步分析发现:espro124a5 是一种分泌型胞外蛋白酶，与来自于
Maricaulis maris MCS10 (accession no. YP_756822 at NCBI)的丝氨酸蛋白酶 S15 仅有 45%的同源性，是一种
新型的丝氨酸蛋白酶，有其保守的催化三元组:Asp469、His541和 Ser348。【结论】密度梯度离心法提取到的
DNA 纯度高、片段长，完全能满足构建宏基因组 Fosmid 文库的要求;同时，构建的宏基因组 Fosmid 文库库容
大，有利于我们从中筛选其他的微生物基因资源。
关键词:土壤微生物;宏基因组 Fosmid 文库;功能筛选;杀线虫蛋白酶基因
中图分类号:X172 文献标识码:A 文章编号:0001-6209 (2010)08-08-1072
土壤环境中蕴藏着巨大的微生物基因资源。然
而，环境样品中，超过 99% 的微生物不能用纯培养
的方法获得［1］。因而，多数的微生物不能够被描
述，阻碍了对微生物群体结构和生态功能的研究，以
及微生物基因资源的挖掘和利用。
随着分子生物学的发展，PCR 技术的应用，通
过构建基因克隆文库和质粒文库，一些有用的基因
及所编码的代谢产物被筛选出来，然而，这些基因是
基于已知序列信息的基础上的，事实上，大多数的微
生物基因序列信息是未知的。因此，可供挖掘利用
的微生物功能基因极其有限，为了克服这些局限，一
项新的技术，宏基因组技术，在 20 世纪 90 年代后期
开始发展起来［2 － 4］。宏基因组是对整个环境样品的
微生物群体的基因组分析。这一概念最初是由
Handelsman 提出［5］。
根结线虫(Meloidogyne spp.)是植物根系专性
内寄生物。在世界范围内，每年导致 1000 亿美元的
损失［6］。近年来，随着我国温室蔬菜种植面积的扩
大，蔬菜根结线虫病的发生逐年加重，严重地产量损
失达 30% － 50%，成为温室蔬菜生产的一大障
碍［7］。
目前，微生物蛋白酶被认为是线虫致病的毒力
因子。研究表明微生物蛋白酶通过降解宿主外层保
护屏障，侵染宿主［8 － 9］。然而，之前的研究都是基于
赵志祥等:温室黄瓜根结线虫发生地土壤微生物宏基因组文库的构建及其…… . /微生物学报(2010)50(8)
可培养的微生物，对不可纯培养的微生物研究较少。
基于此，我们直接从温室线虫发生地黄瓜根围土壤
取样，构建宏基因组 Fosmid 文库，通过对文库进行
杀线虫蛋白酶基因筛选，筛选到 1 个杀线虫蛋白酶
基因，并对基因结构进行了初步分析。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 主要试剂和仪器:超低温离心机(Sigma，
Type:3k15)，PCR 仪(BIO-RAD，ALS-1296)，凝胶成
像仪 (BIO-RAD，76S /06413)，普通水平电泳仪
(BIO-RAD，PAC3000)，显微成像仪 (OLYMPUS，
SZX12);文 库 构 建 用 的 Fosmid 试 剂 盒:
CopyControlTM HTP Fosmid Library Production Kit)，
Fosmid DNA 提 取 用 试 剂 盒:FosmidMAXTM DNA
Purification Kit，均购自美国 EPI 公司(Epicentre，
USA);引物由上海生工生物技术有限公司合成。
1. 1. 2 实验材料:土样于 2008 年 3 月采集自海淀
区中国农业科学院蔬菜花卉研究所试验农场黄瓜种
植地。种植黄瓜年限 10 年以上。采样地选择 10 个
种植黄瓜的地块。土壤样品采用五点采样法，用土
壤采样器采集 5 个黄瓜根围(采集直径 10 cm)的土
壤样品，采集深度为 0 － 15 cm，混合后用密封袋带
回，土样用 10 mesh(2 mm)筛网过筛，去除小颗粒的
石头和残存的植物根系，存放于 － 20 ℃ 冰箱中。
土壤性质见表 1。
表 1 温室土壤理化性质
Table 1 The soil sample tested in this study
Sample pH
Organic C
(g / kg)
Total N
(g / kg)
Available N
(mg /kg)
Total P
(g / kg)
Available P
(mg /kg)
Total K
(g / kg)
Available K
(mg /kg)
soil 7. 2 27. 5 2. 0 25. 7 2. 4 82. 6 25. 2 273. 7
1. 1. 3 引物:细菌、放线菌、古菌和真菌通用引物见表 2。
表 2 PCR 试验所用引物
Table 2 Primers used for PCR experiments
Primer Target sequences Primer sequences(5′→3′) References
F27
R1492
16S rDNA of Bacteria AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
TACGGCTACCTTGTTACGACTT
［16］
NS1
FR1
18S rDNA of Fungi GTAGTCATATGCTTGTCTC
AICCATTCAATCGGTAIT
［17］
21F
958R
16S rDNA of Archea TTCCGGTTGATCCYGCCGGA
TCCGGCGTTGAMTCCAATT
［18］
S-C-Act-0235-a-S-20
S-C-Act-0878-a-A-19
16S rDNA of Actinobacteria CGCGGCCTATCAGCTTGTTG
CCGTACTCCCCAGGCGGGG
［19］
1. 2 土壤 DNA 的提取
参考 Bertrand 等有所改进［10］。含微生物细胞
的沉淀用10 mL 0. 8% NaCl 重悬后，补上 10 mL 的
PVPP，涡旋混匀，10000 × g，4℃离心 10 min 后弃上
清，重复 3 － 5 次，至上清呈淡褐色，沉淀用10 mL
0. 8% NaCl 重悬。将 10 mL Nycodenz(Axis-Shield，
Oslo，Norway;8 g Nycodenz 溶于 10 mL 灭菌水)加
入悬液底部，11000 × g，4℃离心 30 min。小心收集
在 Nycodenz －土壤混合颗粒和上层水层分界面上的
白色细胞层，重悬后在 10000 × g 4℃离心 20 min 去
除 Nycodenz 溶液。紧接着用蛋白酶 K—溶菌酶—
SDS 法提取土壤 DNA，用 100 μL TE 溶解，1% 琼脂
糖电泳检测，－ 20℃保存。
1. 3 宏基因组 Fosmid 文库构建
1. 3. 1 DNA 样品提取及纯化:Nycodenz 密度梯度
离心法提取的粗 DNA 经低熔点琼脂糖电泳(4℃，
25 V，8 h)，溶胶酶法回收主带，脉冲场电泳检测
DNA 分子量大小(0. 1 － 40 s，6V / cm，16 h)。
1. 3. 2 构 建 文 库:按 照 Epicenter 公 司
CopyControlTM HTP Fosmid Library Production Kit 的
使用说明对 DNA 片段进行末端补平，然后再进行一
次低熔点琼脂糖脉冲电泳(0. 1 － 40 s，6 V / cm，
16 h)，切取 25 － 48 kb 之间的条带，溶胶酶法回收
DNA，连接，包装，转导入 EPI300 宿主细胞中，涂到
含 12. 5 mg /L 氯霉素的 LB 平板上。
1. 3. 3 克隆的挑取与保存:用无菌牙签将平板上的
单菌落挑至 96 孔板，每个菌落一个孔，每孔加入
150 μL 含 12. 5 mg /L 氯霉素的 LB 液体培养基，用
膜封口，37℃温箱中培养过夜。
1. 3. 4 Fosmid 基因组文库的质量鉴定:插入片段
大小检测:随机挑取 13 个克隆，根据 Fosmid 文库构
建试剂盒的说明书对其进行诱导培养，使其获得高
拷贝质粒，按照 FosmidMAXTM DNA Purification Kit
使用说明提取质粒 DNA，然后用 Not I 酶切，脉冲电
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泳检测插入片段大小。克隆稳定性检测:随机挑取
5 个克隆，分别接种于 1 mL 含氯霉素的 LB 液体培
养基中继代培养 6 d，分别提取第 0 代(第 1 天)和
第 100 代(第 6 天)细菌培养物中的质粒 DNA，EcoR
Ⅰ酶切后，电泳检测。文库中包含的微生物物种多
样性检测:从文库中随机抽取 138 个克隆进行单末
端测序，然后进行 BLAST 比对，检测比对结果的重
复度。
1. 4 蛋白酶基因筛选
1. 4. 1 超级池和二级池的构建:每个 96 孔板包含
8 行，12 列。构建二级池时，将保存好的 96 孔板中
8 行转接到新的 96 孔板中的同一行，12 列转接到另
外一个新 96 孔板中同一列，并补上 150 μL 含
12. 5 mg /L氯霉素的 LB 液体培养基，37℃ 培养过
夜。这样就形成了 42 个 8 合 1 板和 27 个 12 合 1
板。即二级池。将 8 合 1 板中同一行的克隆保存到
一块新的 96 孔板中的同一个孔(方法同保存 8 合 1
或 12 合 1)，这样就形成了 4 块 96 合 1 克隆板，即
超级池。
1. 4. 2 文库筛选:将 Fosmid 克隆接种于 LB 固体培
养基(含 1% 脱脂奶，12. 5 mg /L 氯霉素)上，37℃，
培养 48 h，通过观察菌落周围是否有透明圈来确定
该克隆是否含蛋白酶基因。
1. 5 亚克隆构建和筛选
提取 Fosmid DNA，经 EcoRⅠ和 SPhⅠ双酶切
后，胶回收 1. 5—5 kb 大小的片段，连接到用相应的
酶酶切后的 pUC19 载体上，转化(用 E. coli DH5α)
后，涂板于 LB 固体培养基(含 50 mg /L 氨苄青霉
素)上，37℃，12 h 后，挑取尽量多的亚克隆，37℃，
摇菌培养 12 h，将亚克隆转接到 LB 固体培养基(含
1% 脱脂奶，50 mg /L 氨苄青霉素)上，37℃，16 h
后，将周围产生透明圈的亚克隆挑出，37℃，摇菌培
养 12 h，加上终浓度为 15% 的甘油，－ 20℃冰箱保
菌备用。
1. 6 蛋白酶杀线虫室内生物测定
以根结线虫(Meloidogyne spp.)为靶标，按照
Huang 等［11］的方法稍作修改，进行杀线虫生物测定
试验。将保存好的亚克隆菌液从 － 20℃冰箱中取
出，待其融化后，取 1μL，接种于装有 50 mL 液体 LB
培养基的 100 mL 三角瓶中，28℃，240 r /min，培养
4 d 后，取出，4℃，8000 × g 离心 10 min，收集上清。
上清液分成两部分，一部分直接处理线虫，一部分高
温热处理(100℃，25 min)后作用于线虫。
生物测定试验在 12 孔平底细胞培养板中进行，
每孔 2 mL 处理液，200 － 300 头线虫，在显微成像仪
下观察死亡的线虫数。试验 5 次处理(阳性对照阿
维菌素(Abamectin)，发酵上清液，热处理发酵上清
液，阴性 E. coli 对照和 LB 培养基对照)，每处理至
少 3 次重复。
1. 7 序列测定和序列分析
提取克隆 espro124a5 质粒，送北京诺赛诺赛基
因组研究中心测序。序列分析在生物学软件
DNAman 和 DNAstar 中进行。亚克隆中包含的基因
数和 核 酸 序 列 运 用 在 线 分 析 页 面 (http:/ /
linux1. softberry. com /berry. phtml? topic =
fgenesb＆group = help＆subgroup = gfindb)进行［12］。
在 CBS SignalP 3. 0 server 界面 (http:/ /www. cbs.
dtu. dk / services / SignalP /)［13］中分析其信号肽劈开
位点，通过 BDGP Neural network promoter prediction
界面 (http:/ /www. fruitXy. org / seq _ tools / promoter.
html)［14］预测其是否含有独立的启动子，同时，进入
网络数据库(http:/ /merops. sanger. ac. uk)［15］，对蛋
白酶进行分类和鉴定。
2 结果和分析
2. 1 土壤微生物总 DNA 的提取
结合 PVPP 预处理和 Nycodenz 密度梯度离心法
提取的微生物基因组 DNA 纯度高，跟直接原位裂解
法提土壤 DNA 相比较，能有效去除土壤腐殖酸，有
机质等。并分别以细菌、放线菌、古菌和真菌通用引
物(表 2)进行 PCR 扩增，均扩增出各自的 rDNA 目
的条带说明纯度上能够达到构建基因组文库的要
求。
2. 2 Fosmid 文库构建及特征分析
2. 2. 1 纯化后 DNA 样品脉冲电泳检测:间接法提
取纯化后的 DNA 在 23 － 97 kb 之间有明显分布，而
Fosmid 质粒对插入片段大小的要求一般为 40 kb 左
右，所以所提 DNA 无需机械打断即符合建库要求。
此外，相比于单一物种的基因组 DNA，土壤微生物
DNA 主带并不明显集中于某一长度区域，而是分布
在较大的范围内，这可能有两方面的原因:其一，不
同物种的基因组 DNA 大小不一;其二，提取过程中
机械损伤造成 DNA 断裂。
2. 2. 2 文库插入片段鉴定:用 NotⅠ进行酶切发
现，所有克隆在 6. 5 － 9. 4 kb 之间有一条 8. 2 kb 的
载体条带，而插入片段呈大小不同的多个片段，这可
能是土壤微生物 DNA 上的 NotⅠ酶切位点较多的原
因。文 库 包 含 31008 个 克 隆，根 据 所 使 用 的
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pCC2FOS 质粒插入片段大小为 40 kb 左右，估计该
文库所覆盖的基因组大小超过 1 Gb。
2. 2. 3 克隆的稳定性检测:第 100 代酶切图谱与第
0 代的无任何明显差异，没有发现插入片段的丢失
或重排，说明所构建的 Fosmid 文库是稳定的。
2. 2. 4 文库末端测序鉴定:138 个随机末端测序结
果中，有 6 个分别比对上黄单胞菌、新月柄杆菌、汉
堡硝化杆菌、Parvibaculum lavamentivorans、茄科雷尔
氏菌和苜蓿中华根瘤菌，4 个比对上荧光假单胞杆
菌。共 10 个比对上了同源序列，占 7. 25%。无同
源序列的克隆共 128 个，占到 92. 75%。这表明该
文库富含大量未知微生物物种。其次，10 个比对上
同源序列的都是细菌序列，这可能是有两方面的原
因，其一，细菌是该环境样品的优势菌群，其物种丰
度远远高于古菌、真菌以及其他微生物;其二，间接
提取 DNA 的方法得到细菌比例更大一些。此外，由
测序结果分析该文库的空载率仅为 1. 2%，随机性
为 1. 000。部分 BLAST 比对结果见表 3。
表 3 部分 Fosmid DNA 测序结果 BLAST 比对结果
Table 3 Partial BLAST result of Fosmid DNA sequencing
Reads name e value Identities Annotation
vsmfaaA08 1e-79 84
gi | 154154406 | gb | CP000774. 1 | Parvibaculum lavamentivorans DS-1，complete
genome
vsmfaaC03 1e-121 86 gi | 91798527 | gb | CP000319. 1 | Nitrobacter hamburgensis X14，complete genome
vsmfaaD02 1e-149 90 gi | 19172958 | gb | AE005673. 1 | Caulobacter crescentus CB15，complete genome
vsmfaaD04 3e-12 82
gi | 47118316 | dbj | BA000040. 2 | Bradyrhizobium japonicum USDA 110 DNA，
complete genome
vsmfaaD11 7e-24 86
gi | 78033986 | emb | AM039952. 1 | Xanthomonas campestris pv. vesicatoria complete
genome
vsmfaaG03 5e-88 91
gi | 30407127 | emb | AL646052. 1 | Ralstonia solanacearum GMI1000 chromosome
complete sequence
VsmfaaB10 1e-126 88 gi | 77380231 | gb | CP000094. 1 | Pseudomonas fluorescens PfO-1，complete genome
2. 3 蛋白酶基因筛选
以脱脂奶为底物，将超级池和二级池中的
Fosmid 克隆转接到 LB 脱脂奶板上，37℃，培养 48 h
后，发现克隆 pro12 周围有明显透明圈(图 1)。经
反复验证，克隆 pro12 周围均有透明圈，而其他克隆
周围无透明圈存在，说明 pro12 中含蛋白酶基因。
图 1 pro12 在 LB 平板上降解脱脂奶的情况
Fig. 1 Degradation phenotype of proteinase pro12 to the skim
milk in LB medium.
2. 4 亚克隆构建、筛选
提取 Fosmid 克隆 pro12 的 DNA，经 EcoRⅠ和
SPhⅠ双酶切后，胶回收 1. 5—5 kb 大小的片段(图
略)，连接到用相应的酶双酶切后的 pUC19 载体上，
转化(用 E. coli DH5α)后，涂板于 LB 固体培养基
(含 50 mg /L 氨苄青霉素)上，37℃，12 h 后，挑取尽
量多的亚克隆，37℃，摇菌培养 12 h，将亚克隆转接
到 LB 固体培养基(含 1% 脱脂奶，50 mg /L 氨苄青
霉素)上。经筛选，克隆 espro124a5 能够降解脱脂
奶(图 2)。说明克隆中含有目标蛋白酶基因。
图 2 活性筛选亚克隆
Fig. 2 Subclones based on function-driven screening.
2. 5 蛋白酶杀线虫室内生物测定
结果显示(表 4，图 3)，亚克隆 espro124a5 对靶
标线虫 Meloidogyne spp. 具有较大的杀线虫活性。
在生物测定中，线虫的致死率 4 h、8 h、12 h 后的观
测结果分别为 80%，99%和 100%。12 h 后，能够看
到被破坏的线虫角质。在所有阴性对照:阴性对照
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菌 E. coli，LB 液体培养基和培养物上清液煮沸
25 min，12 h 后，致死率下降到 25% 以下，并且这些
对照中，死亡线虫的角质完好无损。热处理上清液
对线虫无活性，说明基因编码的蛋白对线虫起了一
定的作用。表 4 中可以看出，espro124a5 杀线虫活
性甚至强于阳性对照阿维菌素(Abamectin)，说明蛋
白酶 espro124a5 有较强的杀线虫活性。
表 4 Meloidogyne spp.在 espro124a5 培养物上清液中的致死率
Table 4 Mortality of Meloidogyne spp. in culture supernatants from espro124a5
Active substance
4-h mortality of Meloidogyne spp.
% (SE)
8-h mortality of Meloidogyne spp.
% (SE)
12-h mortality of Meloidogyne spp.
% (SE)
espro124a5 81 (2. 11)b，B 98 (0. 50)b，B 100 (0)b，B
Abamectin 35 (1. 19)b，B 75 (2. 80)b，B 100 (0)b，B
E. coli 8(0) 8(0) 13(0. 70)
boiled espro124a5 15 (0) 20 (0) 24 (0. 62)
LB medium 7 (0) 8 (0) 10 (0. 10)
Death was determined by nudging nematodes with a stick under a light microscope，the immobilized nematodes were counted as dead. Mortality of
nematodes = number of dead nematodes / all tested nematodes × 100% . The mortality with the letter b indicates statistically significant difference against
its corresponding E. coli control within a column. The mortality with the letter B indicates statistically significant difference against its corresponding LB
medium control within a column. SE，standard error of mortality. For all these treatments，an independent samples test showed P < 0. 01.
图 3 Bursaphelenchus xylophilus 在各处理中的致死情况
Fig. 3 Death note of Meloidogyne spp. in each treatment after eight hours. A:espro124a5 (25 × );B:E. coli culture
supernatants (25 ×);C:boiled espro124a5 (25 ×);D:LB medium (20 ×).
2. 6 序列测定、序列分析
编码该蛋白酶的 ORF 序列全长 1746 个碱基，
编码 581 个氨基酸残基的蛋白质，蛋白质分子量为
61，353 Da，G + C 含量 63. 82%，等电点 8. 75，包含
起始密码子 ATG 和终止密码子 TAG(Accession No.
GU556930 at NCBI)。在其 5′非编码区无 S-D 序列
(Shine-Dalgarno，SD)，3′非编码区无反向串联重复
序列(Tandem inverted repeat sequences)。在氨基酸
序列中，23 和 24 个氨基酸序列之间是其信号肽劈
开位点。
通过 NCBI 上 blastx 比对，发现 espro124a5 与来
自于 Maricaulis maris MCS10 (accession no. YP _
75682. 2 at NCBI)的丝氨酸蛋白酶 S15 仅有 45%的
同源性，与另外一种不可纯培养的 Maricaulis sp.
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赵志祥等:温室黄瓜根结线虫发生地土壤微生物宏基因组文库的构建及其…… . /微生物学报(2010)50(8)
(Accession No. ADD69818. 1 at NCBI)丝氨酸蛋白
酶 peptidase S15 仅有 93%的同源性，是一种新型的
丝氨酸蛋白酶，有其保守的催化三元组:Asp469，
His541和 Ser348。同时，espro124a5 已在 NCBI 上登
录，并获得核酸序列登录号:GU556930。
3 讨论
在宏基因组途径中，最重要的一步是环境样品
基因组 DNA 的提取。到目前为止，没有一个简单统
一的方案适合提取所有的环境样品 DNA。主要问
题是 DNA 的数量，纯度，完整性和 DNA 的代表性。
DNA 的提取方法有两种:要么，通过碱裂解法直接
从环境样品中提取;要么，间接法，先从环境样品中
分离和浓缩微生物细胞，然后再进行碱裂解提取环
境样品 DNA。对许多环境样品来说，间接法是十分
可取的。如对海洋水来说，直接从其中分离 DNA 是
不实际的，因为微生物密度较低，因此，在浓缩细胞
之前，通常进行一些过滤的操作［20］。对土壤样品来
说，许多土壤的污染是非常严重的，例如，多酚类物
质的污染能够影响 DNA 的纯化，也能影响宏基因组
过程中随后的步骤［21］。Lindahl 和 Bakken［22］报道
用密度梯度分离液(Nycodenz)将微生物细胞分离出
来，可以获取基本上全部加入灭菌土中的测试细菌。
据 Acridine Orange Direct Counts(AODC)方法估测，
这种方法提取到的细菌细胞比单用洗涤 /离心法得
到的细胞提高了 1%—50%，并且提取过程对细胞
并不造成损伤［22］。
因此，为兼顾土壤 DNA 的纯度和片段大小，本
研究采取结合 PVPP 的 Nycodenz 密度梯度离心法提
取温室土壤微生物基因组 DNA。先将分散的土壤
悬液低速离心，去除大的土壤颗粒，然后高速离心收
集上清中的细胞后，用 PVPP 洗涤 1 － 3 次，去除腐
殖酸等杂质，最后，将细胞重悬液经 Nycodenz 密度
梯度离心去除其余的土壤碎片及杂质，最终得到了
足量的纯净微生物细胞。实验结果表明，通过该法
提取到的 DNA 纯度高、片段长，完全能满足构建宏
基因组 Fosmid 文库的要求。
采用宏基因组克隆最先筛选到的生物活性物质
是具有抗菌活性的五种新的小分子物质 Terragine
A、B、C、D、E［23］。后来，人们陆续通过构建和筛选
宏基因组文库，筛选到新的生物素合成操纵子、脂
(酯)酶、琼脂糖酶、甘油脱水酶、蛋白酶和抗菌化合
物及合成酶基因簇等［2，24 － 27］。本研究通过构建和
功能驱动筛选宏基因组 Fosmid 文库，进一步构建和
筛选亚克隆，成功筛选到一个含蛋白酶基因亚克隆
(espro124a5)。杀线虫室内生物测定试验表明:克
隆发酵液在无需诱导剂，无需克隆载体上的启动子，
就能起到杀线虫的作用。说明该蛋白酶基因有独立
的启动子，同时，也说明该蛋白酶是一种分泌型胞外
蛋白 酶。 在 NCBI 上 通 过 blastx 比 对 发 现，
espro124a5 与 来 自 于 Maricaulis maris MCS10
(accession no. YP_756822 at NCBI)的丝氨酸蛋白
酶 S15 仅有 45%的同源性，是一种新型的丝氨酸蛋
白酶，有其保守的催化三元组:Asp469，His541 和
Ser348。但是，本研究仅对蛋白酶 espro124a5 的杀线
虫室内生物测定做了初步研究，其酶的活性，最适温
度和 pH 值，异源表达和蛋白纯化以及 espro124a5
的杀线虫机制还有待于进一步研究。
本研究构建的宏基因组 Fosmid 文库库容大，包
含了 3 万多个 Fosmid 克隆，覆盖了大于 1 Gb 的微
生物基因组信息，有利于我们从中筛选蛋白酶、淀粉
酶、酯酶、氧化还原酶和磷降解酶等微生物基因资
源;同时由于插入片段较大(> 35 Kb)，有利于我们
从中筛选到大的基因簇和生物素合成操纵子，如巨
酮合成酶基因簇(PKS 基因簇)等。
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Construction of microbial metagenomic library and
screening of a nematicidal protease gene in greenhouse
cucumber soil infested with Root-knot nematodes
Zhixiang Zhao1，2，Xiaofei Lu2，Guohua Chen2，Yuhong Yang2，Zhenchuan Mao2，
Erming Liu1* ，Bingyan Xie2*
(1 College of Biosafety Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Chinna)
(2 Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100081，China)
Abstract:［Objective］In order to search novel nematicidal protease genes，a metagenomic fosmid library was constructed
and screened by uncultured method. ［Methods］Density gradient centrifugation was used to extract and purify total
greenhouse soil microbial DNA. After end-repair，ligation，packing and transformation，metagenomic fosmid library was
constructed. At the same time，in order to screen the library，function-driven screening was used as a potential strategy，
skim milk was served as substrate and root-knot nematodes as targets. ［Results］The library contained 31，008 clones with
the average insert fragment of 36. 5 kb，including 1. 13Gbp microbial genetic information，so it was suitable for large-scale
microbial functional gene screening. By the function-driven screening，fosmid clone pro12 which contained the nematicidal
protease gene was screened. Then， subclones were constructed and screened. A subclone named espro124a5 was
screened. After analysis of gene structure，espro124a5 is a secreted extracellular protease and a database search for
homologies revealed it possessed 45% identities with peptidase S15 from Maricaulis maris MCS10 (accession no. YP_
756822 at NCBI). It is a novel serine protease. Besides these， it has the serine protease-conserved catalytic triad
residues，Asp469，His541 and the catalytic nucleophile Ser348 . ［Conclusion］DNA obtained from the method of Nycodenz
density gradient centrifugation had high purity，long fragment，and can meet the requirements of constructing metagenomic
fosmid library. At the same time，the metagenomic fosmid library contains a lot of microbial genetic information，which is
suitable for the screening of the other microbial genetic resources.
Keywords:soil microbes;metagenomic Fosmid library;function-driven screening;nematicidal protease gene
(本文责编:王晋芳)
Supported by the National Major Fundamental Research Program of China (2009CB119000)，the Public Service Sectors(Agriculture)Special
Funding for Research(3-25，nyhyzx07-050)and the Key Projects in the National Science ＆ Technology Pillar Program During the Eleventh Five-year
Plan Period(2006BAD07B03，2006BAD08A08，2006BAD17B08)
* Corresponding authors. Tel: + 86-10-82109545;E-mail:xiebingyan2003@ yahoo. com. cn
Received:29 January 2010 / Revised:24 March 2010
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