全 文 ：橡胶草种植前后土壤微生物细菌多样性研究(Ⅰ)———基础分析
梁素钰，李 琳，杜 倩，王文帆，刘铁男，田松岩 (黑龙江省森林工程与环境研究所，森林持续经营与环境微生物工程重点实
验室，黑龙江哈尔滨 150081)
摘要 ［目的］对开垦荒地种植橡胶草前后的土壤微生物细菌多样性进行 454测序技术并对基础数据进行分析，探求利用边际土地进行
战略能源作物种植的可行性。［方法］通过蛇形取样法对土壤样品采集、用试剂盒提取土壤微生物总 DNA、选择细菌 16SrDNA V3 ～ V1
区，进行引物设计与 PCＲ预扩增，采用 454测序技术获得数据序列并优化，用 Ｒ软件进行指数多样性等基础分析。［结果］样品总 DNA
无蛋白质和ＲNA污染，PCＲ预扩增出500 bp左右的细菌16S rDNA。454测序序列优化序列占有效序列的90%以上，在97%相似性水平
下的指数多样性显示橡胶草种植后土壤细菌 OTU数目较多;Shannon-Wiener曲线和稀释性曲线显示，当测序序列细菌超过 15 000时曲
线趋向平坦。［结论］试验测序数据可以反应样品中绝大多数微生物信息，此次取样的数量比较合理，细菌丰富度高。
关键词 橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Ｒodin);454测序;细菌;多样性;土壤微生物
中图分类号 S576 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2014)09 －02563 －02
Study on Diversity of Soil Bacteria before and after Planting Taraxacum kok-saghyz (I)-Basic Analysis
LIANG Su-yu et al (Heilongjiang Forestry Engineering and Environment Institute，Key Laboratory of Forest Sustainable Management and En-
vironmental Microorganism Engineering，Harbin，Heilongjiang 150081)
Abstract ［Objective］The diversity of soil bacterial before and after planting Taraxacum Kok-saghyz in land reclamation is analysed to explore
the strategy feasibility of using marginal land for energy crop cultivation． ［Method］ In this study，using serpentine sampling to collectthe soil
sample，using DNA extraction kit to obtain total DNA，selecting bacteria 16SrDNA V3 ～ V1 region for PCＲ primer design and pre － amplifica-
tion，using 454 sequencing technology to obtain the data sequence and optimizing，analyzing diversity index based on Ｒ software． ［Ｒesults］The
quality of DNA sample is good，without pollution of protein and ＲNA． The amplified PCＲ band was 500 bp in 16S rDNA of bacteria． The opti-
mized sequences were higher than 90% of available sequences． Diversity index analysis under the 97% similarity level indicated that the OTU
number of soil bacteria was more abundant． Shannon-Wiener curve and dilution curve showed that when bacteria sequences were higher than
15 000，the curve tended to be smooth． ［Conclusion］This showed the sequencing data can reflect the information of vast majority of bacterial in-
formation and the number of sample is reasonable．
Key words Taraxacum kok-saghyz;454 sequence;Bacteria;Diversity;Soil microorganism
基金项目 国家林业局 948，编号 2013-04SC2，2011-4-51;黑龙江省财
政，编号 2011-02;黑龙江省森工总局，编号 sgzjY2012010;黑
龙江省博士后，编号 LBH-Q10010)。
作者简介 梁素钰(1970 － ) ，女，黑龙江哈尔滨人，副研究员，博士，从
事生物能源与技术研究。
收稿日期 2014-02-14
橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Ｒodin)是菊科(Composi-
tae)蒲公英属(Taraxacum)多年生宿根草本产胶植物，首先于
20世纪 30年代在前苏联被发现，并对橡胶草体内橡胶的形
成［1 －2］及品质变化［3 －4］、体内碳水化合物［5 －6］、果聚糖［7］、多
酚氧化酶及化合物［8 －9］和脱氢酶［10］等进行了研究。中国在
20世纪 50年代初，为解决国内天然橡胶供应不足问题，中央
轻工业部曾组织调查团前往新疆对发现的大面积野生橡胶
草进行全面考查［11 －12］。
近年来，随着橡胶草作为替代巴西橡胶的可用资源之
一［13 －17］，人们对橡胶草的研究维度更加多样化，从田间种
植［18］，组织培养［19 －22］、到分子水平的蛋白质［23 －24］、转基
因［25 －27］、遗传图谱多样性［28］和基因克隆［29 －30］等进行了一系
列的研究。笔者主要是利用 454 技术［31 －32］研究北方田间种
植橡胶草前后的土壤微生物细菌的多样性，并对所测序列进行
基础数据分析，以期为橡胶草的进一步开发利用提供依据。
1 材料与方法
1． 1 材料 于种植 1年橡胶草的土地和未种植地，以 5 m ×
5 m为试验单元，尽量靠近橡胶草根蛇形取土样 5个，每个样
品 50． 0 g，混合，过40目土壤筛。样品用锡纸包裹，置于液氮
中带回实验室。试验中用 KOK 表示橡胶草种植后的样本，
用 CK表示橡胶草种植前的样本。
1． 2 方法
1． 2． 1 土壤总基因组的提取与纯化。利用土壤 DNA 提取
试剂盒(PowerSoil DNA Isolation Kit)进行微生物基因组 DNA
的提取和纯化，土样取 0． 25 g，提取完成后，取 1 μg DNA 上
样，用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1． 2． 2 454测序进行 PCＲ扩增时引物选择。检测细菌选择
16SrDNA V3 ～ V1区，进行引物设计与 PCＲ扩增。扩增引物
为 27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;533Ｒ:5’-TTAC-
CGC GGCTGCTGGCAC-3’(测序端)。
1． 2． 3 有效序列数据及优化序列数据。对 2 个样品混合测
序后，去除测序接头、barcode和前引物(forward primer)序列，
并对处理后的有效序列和优化序列数据进行分布统计。
1． 2． 4 OTU聚类分析。对所测细菌序列进行归类操作，按
照彼此的相似性归为许多小组，1个小组就是 1 个 OTU(Op-
erational Taxonomic Units，可操作的分类单元) ，来自 1 个菌。
试验基于 97%的相似度，对所有细菌序列进行 OTU 聚类并
进行生物信息统计分析。
1． 2． 5 多样性分析。试验使用 Ｒ 软件，应用菌群丰度指数
Chao、Ace，菌群多样性指数 Simpson、Shannon 和测序深度指
数 Coverage和 Shannon-Wiener 曲线反应样品的微生物多样
性指数，用稀释性曲线比较测序数量不同的样本物种的丰富
度和样本的取样大小。
2 结果与分析
2． 1 DNA的提取与 PCＲ扩增 图 1表明，2个样品均获得
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2014，42(9):2563 － 2564，2596 责任编辑 石金友 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2014.09.005
质量良好的总 DNA，无蛋白质和 ＲNA 污染，可进行 PCＲ 扩
增。细菌 PCＲ均预扩增出 500 bp左右的条带，无拖尾现象。
注:M为 DL2000;90为 KOK;100为 CK;(a)为样品总 DNA;(b)
为细菌 16srDNA PCＲ。
图 1 土壤基因检测
可以进行后续 454测序。
2． 2 样品序列数据的分析 由表 1 可知，优化后的序列长
度占有效序列的 90%以上，满足试验分析要求。
表 1 样品中细菌的序列数据统计
样品 有效数据 优化数据 百分比∥%
CK 18 131 17 017 93． 86
KOK 19 831 18 677 92． 59
2． 3 橡胶草土壤细菌多样性分析
2． 3． 1 指数多样性分析结果。由表 2 可知，橡胶草种植前
和种植后细菌 OTU 数目相差不大，shannon 指数均较高，
simpson指数均较低，说明 2个样地的微生物多样性水平丰
表 2 细菌群落多样性指数
样品 Ｒeads OTU
菌群丰度指数
ace chao
测序深
度指数
菌群多样性指数
shannon simpson
CK 16 364 4 751 9 176(8 910，9 459) 7 808(7 480，8 176) 0． 863 970 7． 86(7． 85，7． 88) 0． 000 7(0． 000 7，0． 000 7)
KOK 18 005 4 914 7 785(7 540，8 054) 7 840(7 529，8 188) 0． 875 590 7． 85(7． 83，7． 87) 0． 000 8(0． 000 7，0． 000 8)
富，丰富度差距不大。
2． 3． 2 Shannon-Wiener曲线分析。图 2表明，这 2个样本的
曲线离得比较近，当细菌测序序列超过 15 000 时，曲线趋向
平坦，说明试验选取细菌测 15 000条序列时能反应样品中绝
大多数微生物信息，所测序的数据具有高的可信度，可真实
地反应试验结果。
2． 3． 3 稀释性曲线(rarefaction curve)分析。该分析是在
97%相似性水平下划分 OTU 并制作样品的稀疏曲线，当细
菌达到 15 000，曲线有趋向平坦趋势，说明此次取样的数量
比较合理(图 3)。
注:90为 KOK;100为 CK。
图 2 细菌 16S Shannon-Wiener曲线
注:90为 KOK;100为 CK。
图 3 细菌 16S稀释性曲线
3 结论与讨论
试验主要针对土壤样品的采集、DNA的提取、PCＲ预处
理以及获得样品的测序数据进行的基础分析。用 454 技术
研究土壤微生物，在土壤样品的准备上，为了尽可能接近土
壤内真实微生物的组成，在取样时第一时间将样品原地处理
后，存于液氮中保存。但在试验过程中，DNA的提取、纯化以
及 PCＲ引物的设计和扩增，都会对所测序列产生影响。该
试验中的 PCＲ是预试验，主要目的是为了检测基因组 DNA
是否可以进行后续的 454测序。
序列优化是为了去除测序过程中出现的冗余数据，其中
不含所设计序列的数据不可用于后续分析。试验数据分析
是在 0． 03水平上，即 97%相似性，选取数据并进行分析。在
分析过程中，也可以根据需要选取 0． 1 或者 0． 01 等不同程
度的相似性水平所获得的数据，那就要看实际优化的序列是
否可以满足试验分析要求。
(下转第 2596页)
4652 安徽农业科学 2014 年
态系统。
参考文献
［1］苏少泉．长残留除草剂对后茬作物安全性问题［J］．农药，1998，37(12):
4 －7．
［2］陶波，苏少泉，刘金宇．农作物对磺酰脲类除草剂耐性的研究［J］．东北
农业大学学报，1995，26(2):105 －110．
［3］邓金保．磺酰脲类除草剂综述［J］．世界农药，2003，25(3):24 －32．
［4］杨景辉．土壤污染与防治［M］．北京:科学出版社，1995．
［5］BAＲＲIUSO E，HOUOT S，SEＲＲA W C． Influence of compost addition to
soil on the behavior of herbicides［J］． Pesticide Science，1997，49(l):65 －
75．
［6］朱鲁生，王军，林爱军，等．二甲戊乐灵的土壤微生物生态效应［J］．环境
科学，2002，23(3):88 －91．
［7］范秀容，李广武，沈萍．微生物学实验［M］． 2版．北京:高等教育出版社，
1989．
［8］蔡玉琪，王珊龄，蔡道基．甲基异柳磷等四种农药对土壤呼吸的影响
［J］．农村生态环境，1992(3):36 －40．
［9］金益．试验设计与统计分析［M］．北京:中国农业出版社，2007．
［10］方程冉，沈东升，贺永华．有机毒物甲磺隆胁迫下根际微生物种群生态
的动态变化研究［J］．土壤通报，2003，34(4):340 －342．
［11］吴小毛，龙友华，李明．仲丁灵对土壤微生物种群和土壤呼吸强度的影
响［J］．贵州农业科学，2009，37(10):91 －93．
［12］腾春红．氯嘧磺隆对土壤微生态的影响及其高效降解真菌的研究
［D］．哈尔滨:东北农业大学，2006．
［13］史伟，李香菊，刘士阳，等．咪唑乙烟酸对土壤好氧微生物和酶活性的
影响［J］．湖北农业科学，2011，50(4):700 －703．
［14］于健垒，宋国春，万鲁长，等．乙草胺对土壤微生物的影响研究［J］．环
境污染治理技术与设备，2000，1(5):61 －65．
［15］赵宁伟，郜春花，李建华．土壤呼吸研究进展及其测定方法概述［J］．山
西农业科学，2011，39(1):91 －94．
［16］李慧冬，李瑞菊，杜红霞，等．啶虫脒对土壤微生物呼吸及数量的影响
［J］．山东农业科学，2009(8):69 －70．
［17］姜虎生，王宏燕．除草剂对土壤脱氢酶活性及呼吸强度的影响［J］．吉
林农业科学，2011，36(5):
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
53 －55．
(上接第 2564页)
橡胶草种植前和种植后 2 个样地的土壤样品均获得质
量良好的总 DNA，无蛋白质和 ＲNA 污染，细菌 PCＲ 均预扩
增出 500 bp左右的条带，无拖尾现象。优化后的细菌序列长
度占有效序列的 90%以上，满足试验分析要求。2 个样地细
菌 OTU数目相差不大，多样性指数 shannon和 simpson 的值
比较接近，说明 2个样地的微生物多样性丰富度种植前后差
距不大。Shannon-Wiener曲线分析和稀释性曲线分析表明所
测样品数据可反映绝大多数细菌信息，测序的数据具有极高
的可信度，此次取样的数量比较合理，可真实地反应试验
结果。
参考文献
［1］А·А·普罗科菲耶夫，柳大绰．植物体内橡胶的形成［J］．植物生理学
通讯，1955(6):30 －38．
［2］А．А． Дробков，李有则．橡胶草内醣对于橡胶形成的意义［J］．植物生
理学通讯，1955(6):50．
［3］S·M·马希塔科夫，周嘉槐．橡胶草根在其发育过程中橡胶及树脂质
的变化［J］．植物生理学通讯，1955(6):51．
［4］S·M·马希塔科夫，周嘉槐．橡胶草在第二年生长期间根内橡胶品质
的变化［J］．植物生理学通讯，1955(6):52．
［5］М·Б·Нейман，А·А·ПрокоФьеви，П·С·Шантарович，等．碳水
化合物是植物用作综合橡胶的原始产物［J］．植物生理学通讯，1955
(6):43．
［6］ KOLESNIKOV P A． Carboxylase in kok-saghyz［J］ Dokl Akad Nauk
SSSＲ，1952，85(3):611 －614．
［7］MIKHLIN D M，AKHUNBAEVA B O． Fructosans in roots of Taraxacum
kok-saghyz［J］． Biokhimiia，1956，21(2):186 －190．
［8］KOLESNIKOV P A． Chinones and localization phenoloxidase in kok-saghyz
［J］． Dokl Akad Nauk SSSＲ，1952，85(4):847 －850．
［9］MIKHLIN DM，PSHENOVA K V． Polyphenol compounds in kok-saghyz
［J］． Biokhimiia，1953，18(1):24 －28．
［10］MIKHLIN D M，BＲONOVITSKAIA Z S． Dehydrogenases of kok-saghyz
［J］． Dokl Akad Nauk SSSＲ，1953，89(5):893 －896．
［11］成言．橡胶草［J］．化学世界，1950(11):10 －11．
［12］罗士华．橡胶草［J］．科学大众，1952(5):121 －122．
［13］COＲNISH K，MYEＲS M D，KELLEY S S． Latex quantification in homoge-
nate and purified latex samples from various plant species using near in-
frared reflectance spectroscopy［J］． Industrial Crops and Products，2004，
19:283 －296．
［14］BUＲANOV A V，ELMUＲADOV B J． Extraction and Characterization of
Latex and Natural Ｒubber from Ｒubber － Bearing Plants［J］． J Agric
Food Chem，2010，58:734 －743．
［15］王凤菊．国外生物橡胶资源开发动态［J］．中国橡胶，2012(13):4 －7．
［16］孙树泉，张继川，张立群，等．生物橡胶的研究进展［J］．高分子通报，
2013(4):42 －50．
［17］赵平娟，安锋，林位夫，等．大力开展巴西橡胶树替代产胶植物及技术
研发的建议［J］．中国农学通报，2012(34):124 －130．
［18］OLIVE MUNT，MAＲINA AＲIAS，MNICA HEＲNANDEZ，et al． Fertiliz-
er and Planting Strategies to Increase Biomass and Improve Ｒoot Mor-
phology in the Natural Ｒubber Producer Taraxacum Brevicorniculatum
［J］． Industrial Crops and Products，2012，36(1):289 －293．
［19］梁素钰，王文帆，刘滨凡，等．能源橡胶草的综合利用研究［J］．能源研
究与信息，2010，26(4):219 －224．
［20］罗成华，闫洁，祝建波．橡胶草高频再生体系的建立［J］．北方园艺，
2012(7):115 －119．
［21］林伯煌，魏小弟．橡胶草的组织培养研究［J］．热带农业工程，2009，33
(4):1 －3．
［22］梁素钰，王述洋．新型能源战略植物———橡胶草的开发与利用［M］．
哈尔滨:东北林业大学出版社，2008．
［23］JILLIAN COLLINS-SILVA，AISE TABAN NUＲAL，AMANDA SKAGGS，
et al． Altered levels of the Taraxacum kok-saghyz(Ｒussian dandelion)
small rubber particle protein，TkSＲPP3，result in qualitative and quantita-
tive changes in rubber metabolism［J］． Phytochemistry，2012，79:46 －56．
［24］黄荣辉，校现周，仇键，等．橡胶草胶乳蛋白双向电泳方法的建立［J］．
热带作物学报，2013(2):272 －275．
［25］孙怀娟．橡胶草遗传转化体系的建立及 HMGＲ1的转化研究［D］．海
口:海南大学，2008，7．
［26］ DANIELA WAHLEＲ，CHＲISTIAN SCHULZE GＲONOVEＲ，CAＲOLIN
ＲICHTEＲ，et al． Polyphenoloxidase Silencing Affects Latex Coagulationin
Taraxacum Species［J］． Plant Hysiology，2009，151:334 －346．
［27］ THOMAS SCHMIDT，MALTE LENDEＲS，ANDＲEA HILLEBＲAND，et
al． Characterization of rubber particles and rubber chain elongation in Ta-
raxacum koksaghyz［J］． BMC Iochemistry，2010，11:2 －11．
［28］李若霖．新疆橡胶草种质资源遗传多样性研究［D］．海口:海南大学，
2012．
［29］仇键，刘实忠，张志平，等．橡胶草异戊烯焦磷酸异构酶基因的电子克
隆及分析［J］．生物信息学，2013(3):209 －215．
［30］王启超，刘实忠，校现周．橡胶草 HMGＲ基因的克隆及表达分析［J］．
植物研究，2012(1):61 －68．
［31］YAＲWOOD S，BＲEWEＲ E，YAＲWOOD Ｒ，et al． Soil microbe active
community composition and capability of responding to litter addition af-
ter 12 years of no inputs［J］． Appl Environ Microbiol，2013，79(4):1385
－1392．
［32］KOOPMAN M M，FUSELIEＲ D M，HIＲD S，et al． The carnivorous pale
pitcher plant harbors diverse，distinct，and time － dependent bacterial
communities［J］． Appl Environ Microbiol，2010，76(6):1851 －1860．
6952 安徽农业科学 2014 年