全 文 ：黄瓜叶围放线菌的分离及其对灰霉菌抑菌效果测定
王振跃 ,刘延红 ,高书锋 ,袁虹霞 ,李洪连
(河南农业大学 植物保护学院 , 河南 郑州 450002)
摘要:采用叶片冲洗液培养法和消毒叶片研磨液培养法 ,从郑州郊区温室及露地黄瓜叶片上分离
得到 45株放线菌。采用室内平板对峙法测定了各菌株对黄瓜灰霉病菌的抑菌作用 ,初筛出抑菌效
果明显的 S32 , S10等 6株放线菌 ,并测定了其发酵滤液的抑菌效果 ,结果表明:S32 ,S10 和 S23的
发酵滤液对黄瓜灰霉病菌菌丝生长有明显抑制作用 ,其中 S23稀释 10倍的发酵滤液抑菌效果优于
50%速克灵 1000倍液 。
关键词:黄瓜灰霉病菌;黄瓜叶围;放线菌;抑菌效果
中图分类号:S436.421.1　　文献标识码:A　　文章编号:1004-3268(2007)11-0078-03
Isolation and Inhibito ry Ef fects of Phyllosphere
Actinomycetes against Botryt is cinerea on Cucumber
WANG Zhen-yue , LIU Yan-hong ,GAO Shu-feng , YUAN Hong-xia , LI Hong-lian
(Co lleg e of P lant P ro tection , H enan Agricultural Univer sity , Zheng zhou 450002 , China)
Abstract:Forty-five st rains of phyllosphere actinomycetes were isolated f rom phyllosphere of cucumber in
the fields and greenhouses at suburb of Zhengzhou with methods of “plating of leaf washings” and “plat-
ing of diluted leachates f rom sterilized , grinded leaves” .The results of dual culture on PDA plate in vitro
showed that 6 strains of actinomycetes ,including S32 and S10 ,were capable of strong antagonism against
Botry tis cinerea Pers.The culture filt rate of S32 ,S10 and S23 had obvious inhibitory effects on the myce-
lial g row th of Botry tis cinerea Pers.The inhibitory ef fect of the diluted culture filtrate of S23 with 10
times dilution w as better than that of 50%Procymidone of 1000 times dilution.
Key words:Botry t is cinerea;Phy llosphere of cucumber;Actinomycetes;Inhibi to ry ef fect
收稿日期:2007-07-04
基金项目:河南省教育厅科技攻关项目(2000210028)
作者简介:王振跃(1958-),男 ,河南南召人 , 副教授 ,主要从事植物病理学教学及研究工作。
2.4　CGMMV 多克隆抗体对不同植物病毒的特异
性
表 1 的 结 果 显 示 , ODTMV/OD健康对照 < 2 ,
ODORSV/OD健康对照 <2 ,均为阴性反应 。因此 CGM-
MV 多克隆抗体特异性好。
表 1　CGMMV多克隆抗体特异性测定
病毒种类 OD405nm
CGMMV 1.037
T MV 0.248
ORSV 0.196
健康对照 0.145
3　讨论
目前 ,针对黄瓜绿斑驳花叶病毒的比较实用 、有
效的检测方法有酶联免疫吸附法和 PCR法 ,而酶联
方法比较稳定 、处理样品多 ,更适用于大量样品的检
测和筛查。现在黄瓜绿斑驳花叶病毒的酶联检测试
剂均来源于国外 ,由于种种原因限制了黄瓜绿斑驳
花叶病毒的检测。本试验制备的黄瓜绿斑驳花叶病
毒多克隆抗体的特异性好 ,效价高 ,可直接应用于间
接酶联法检测黄瓜绿斑驳花叶病毒 ,并且为其他试
剂和产品的研制打下基础。
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2007年第 11期
DOI :10.15933/j.cnki.1004-3268.2007.11.020
　　黄瓜灰霉病是流行性强 ,再侵染频繁的病害 ,历
年发生危害严重 ,给黄瓜生产造成严重的损失[ 1] 。
在北方温室栽培条件下更有利于病害的发生 ,同时 ,
温室内高湿 、相对稳定的环境条件也为微生物生防
因子发挥稳定的生防作用创造了条件。
近年来 ,人们发现一些叶围特殊的微生物对病
原菌的定殖有极大的影响[ 2 ～ 7] 。并且对小麦 、棉花 、
甜菜 、桃树 、水稻 、苹果 、桑树 、烟草 、毛白杨 、黄瓜 、红
松等植物叶围微生物进行了研究[ 5] ,但未见有关黄
瓜叶围放线菌的研究报道 。放线菌是抗生素的主要
生物来源 , 在自然界中分布十分广泛 ,产生代谢物
质能力强 ,种类繁多 ,从田间土壤 、根围 、叶际经常可
分离到[ 8] 。已有利用放线菌防治番茄灰霉病的报
道 ,但放线菌的来源均为土壤[ 8 , 9] 。从土壤中分离
的真菌 、细菌定殖能力差 ,受环境条件制约 ,防效难
以稳定[ 10] 。
本试验的目的就是从黄瓜叶片内外分离 、筛选
对黄瓜灰霉病菌有拮抗作用的放线菌 ,为温室黄瓜
灰霉病的防治提供新的途径。
1　材料和方法
1.1　供试病原菌和培养基
黄瓜灰霉病菌由河南农业大学植物病理实验室
提供 。
改良高氏一号培养基用于放线菌的分离和培
养;PDA 培养基用于黄瓜灰霉病菌的培养。
1.2　分离用黄瓜叶片
从黄瓜幼苗期到拉秧期 ,采集郑州郊区温室和
大田新鲜黄瓜叶片。
1.3　黄瓜叶际附生放线菌的分离
用直径 0.8 cm 打孔器打取黄瓜叶片 ,每叶打取
2片 ,共取 40个小圆片 ,置于 200mL 无菌水中充分
振荡(摇床 170 r/min , 2 h)[ 11 , 12] 。将摇匀的冲洗原
液稀释成一系列的浓度:原液 、1/10原液 、1/100 原
液 、1/1000 原液和 1/10 000 原液 , 取各梯度悬液
0.4mL ,均匀涂布于改良高氏一号培养基平板上 ,
倒置于 28℃恒温培养箱中培养 、分离和纯化。
1.4　黄瓜叶片内生放线菌的分离
将采摘的新鲜黄瓜叶片经流水冲洗 2 h 后 ,晾
干 ,用直径 0.8 cm 的打孔器打取叶片 ,每叶取 2片 ,
共计 40个小圆片 ,用 70%的酒精表面消毒 1min ,
再用 15%的 H2O2 表面消毒 3min ,无菌水冲洗 3
次[ 11 , 12] ,研碎后加入 10mL 无菌水 ,梯度稀释 ,分离
培养同上 。最后一次的无菌水冲洗液涂布于改良高
氏 1号平板 ,检测表面消毒是否彻底 。
1.5　叶围放线菌对黄瓜灰霉病菌拮抗效果测定
采用平板对峙法 。将 PDA 平板上活化好的黄
瓜灰霉病菌菌片转接在另一个 PDA 平板中央 ,用
直径 0.6 cm 打孔器将活化过的生防菌打成菌片对
称接种在距灰霉菌 3 cm 处 ,空白对照只接黄瓜灰霉
病菌 ,26℃下恒温培养 。等空白对照长满平板时 ,
测量黄瓜灰霉病菌的平均菌落直径和抑菌带宽度。
以生防菌平均抑菌率和平均抑菌带宽作为衡量拮抗
作用强弱的指标。抑菌率的计算公式如下:
抑菌率=
对照平均
菌落直径-处理平均菌落直径
对照平均菌落直径 ×100%
1.6　发酵液的制备
将平板对峙筛选出的放线菌活化后分别转接到
装有 50mL 高氏一号培养液的 250mL 三角瓶中 ,
置于 28 ℃恒温 , 170 r/min震荡培养 6 d ,用灭菌滤
纸过滤 ,滤液转移到 50mL 灭菌的离心管中 , 4 ℃,8
000 r/min下离心 15min ,再取上清液经滤膜孔径为
0.22μm的细菌过滤器过滤后备用 。
1.7　不同放线菌发酵液对黄瓜灰霉病菌生长的
影响
采用杯碟法[ 13] 。从活化好的黄瓜灰霉病菌平
板边缘用直径为 0.6 cm 的打孔器打取菌片 ,以冷却
的 PDA平板中心为中心 ,呈正六边形分布放 6个灰
霉病菌菌片于 PDA 平板 ,菌片距平板中心为 3 cm ,
再放一个无菌牛津杯(内径 0.7 cm ,高 0.9 cm)于平
板中央 ,牛津杯中分别加入 300μL 各生防菌发酵液
原液 、5 倍 、10倍稀释液 ,以加 50%速克灵 1000倍
液 、无菌水作对照 。置 26℃温箱中培养 ,待对照(无
菌水)长满平板时 ,记录各处理抑菌圈直径 。
2　结果与分析
2.1　黄瓜叶围放线菌分离结果
从郑州郊区的温室和大田黄瓜叶围分离到 45
株附生放线菌。从黄瓜生长时期来看 ,以结瓜期和
衰老期黄瓜叶围附生放线菌较为丰富 ,而苗期则很
少分离到。未从黄瓜叶片内分离到内生的放线菌。
2.2　叶围附生放线菌对黄瓜灰霉病菌拮抗作用测
定结果
叶际附生的放线菌对黄瓜灰霉病菌的拮抗作用
测定结果见表 1。结果表明 ,在 45 株不同的放线菌
中 ,共有 13株对黄瓜灰霉病菌的生长有一定的抑制
作用 ,其中抑菌效果最好的是 S32 ,S10和 S24 ,其抑
菌带宽分别为 0.72 cm ,0.65 cm 和 0.60cm ,抑菌率
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河南农业科学
分别为 52.94%, 47.05%和 44.71%;其他菌株没有
抑菌效果 。
表 1　叶围放线菌对黄瓜灰霉病菌生长的抑制作用
菌株 平均抑菌带宽(cm) 平均菌落直径(cm) 抑菌率(%)
S10 0.65 4.50 47.05
S17 0.52 5.50 35.29
S21 0.50 5.40 36.47
S23 0.44 5.20 38.82
S24 0.60 4.70 44.71
S28 0.30 5.30 27.40
S29 0.20 5.50 24.66
S32 0.72 4.00 52.94
S37 0.55 4.70 35.62
S38 0.55 4.80 34.25
S39 0.20 5.80 20.55
S40 0.20 6.30 13.70
S41 0.40 5.00 31.51
ck 0.00 8.50 ―
　注:其他菌株均没有抑菌效果 ,故未在表 1中列出
2.3　放线菌发酵液对黄瓜灰霉病菌生长的影响
供试的 6种放线菌发酵液对黄瓜灰霉病菌菌丝
生长的影响见表 2 ,由表 2可以看出:S23 , S32 , S10
的发酵液对黄瓜灰霉病菌菌丝生长抑制效果较好 ,
10倍发酵液的抑制作用均与速克灵 1 000倍液的抑
制效果相当 。而 S17 ,S21 , S24 发酵液对黄瓜灰霉
病菌生长无抑制作用 。
表 2　生防菌发酵滤液对黄瓜灰霉病病菌生长的抑制作用
材料 平均抑菌圈直径(cm)原液 稀释 5倍 稀释 10倍
S10 2.50 1.90 1.80
S17 0.00 0.00 0.00
S21 0.00 0.00 0.00
S23 2.30 2.20 2.00
S24 0.00 0.00 0.00
S32 2.70 2.00 1.80
速克灵 1000倍 1.90
ck 0.00
3　结论与讨论
通过分离培养 ,从郑州郊区黄瓜叶围分离得到
45株放线菌 ,说明放线菌是黄瓜叶围微生物区系的
重要组成部分 ,它们在叶部病害的发生危害 、病害生
态防治和生物防治方面具有不可忽视的重要作用 。
通过室内抑菌测定 ,发现部分菌株对黄瓜灰霉
病菌有较好的抑菌作用 ,其中 S23 , S10和 S32抑菌
效果最好 ,可做进一步的田间防效试验。本试验无
菌发酵液的抑菌测定主要是为了明确代谢产物是否
有抑菌效果 ,因此 ,稀释倍数较低。
对峙培养时 ,S17 , S21 , S24对灰霉菌生长表现
出拮抗作用 ,但代谢产物对灰霉菌丝生长未表现出
拮抗作用 ,原因可能与发酵过程中代谢产物积累的
量有关。发酵培养液的种类 、初始 pH 值 、摇床温
度 、发酵时间 、通气量等发酵条件不适 ,都会造成放
线菌的代谢产物积累受到影响 ,因此 ,需要对放线菌
的发酵条件进行优化研究。
本研究为黄瓜灰霉病的防治提供了一条新的途
径 ,但还需进行田间防病试验 ,需进一步研究放线菌
的防病机制 、在大田黄瓜叶片的定殖性能;在定殖点
放线菌生长和产生毒素的适宜条件等 ,为生防菌在
大田的应用提供依据 ,最大限度地发挥生防菌的防
病潜能 。
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