全 文 ：文章编号:1002-1302(2004)06-0080-03
一株芦竹内生真菌对黄瓜灰霉病菌的抑制作用研究
纪丽莲
(淮阴工学院生物工程系 ,江苏淮安 223001)
　　摘要:从黄海海岸低盐药用植物芦竹(Arundo donax)中分离得到一株木霉属的内生真菌 ,对该菌抑制黄瓜灰
霉病菌的活性及作用机制进行了研究。结果表明 , 芦竹内生真菌的菌悬液和发酵液对黄瓜灰霉病菌有较强的抑
菌活性 ,且较为长效 ,提示该内生真菌细胞和代谢产物具协同作用;对峙培养试验表明 , 芦竹内生真菌对黄瓜灰霉
病菌有很强的拮抗作用 ,拮抗机制主要为营养竞争作用 、重寄生作用及抗生作用等;芦竹内生真菌对离体黄瓜的
灰霉病斑扩展的抑制试验 , 进一步证实了该菌细胞和代谢产物的生物防治功能。
　　关键词:芦竹;内生真菌;黄瓜灰霉病菌;抑制作用
　　中图分类号:S482.2+92　　文献标识码:A
收稿日期:2004-04-01
基金项目:江苏省教育厅自然科学基金项目(编号:02KJD180010)。
作者简介:纪丽莲(1965—),女 ,福建厦门人 ,博士 ,副教授, 主要从事
微生物与生化药学的研究工作。 Tel:(0517)3591190;E-mail:
jll2863@vip.sina.com。
　　黄瓜灰霉病是由灰葡萄孢真菌引起的一种病
害 ,为黄瓜生育期的主要病害 ,一般导致减产 10%
～ 20%,严重的可达 70%以上 ,已成为我国温棚黄
瓜的主要病害之一。该病还能危害番茄 、茄子 、青
椒 、菜豆 、大葱 、韭菜 、莴苣等多种蔬菜 ,损失很大 。
长期使用化学农药防治 ,使灰霉病菌的抗药性逐年
增强 ,导致灰霉菌病害防治困难 ,蔬菜栽培中灰霉病
的危害日趋严重 。同时 ,化学农药的大量使用导致
的环境不可逆恶化已成为全球关注的重点[ 1] 。生物
农药与生物防治是解决病菌抗药性及环境问题的最
富前景的措施。近几年 ,已陆续报道几种生物防治
技术的研究与应用 ,如绿色木霉对黄瓜灰霉病的防
治作用[ 2] , 某些酵母菌在水果生物防治中的应用
等[ 3 ,4] 。我们从黄海海岸浅水滩的低盐芦竹(Arundo
donax)中分离到一种具抗真菌活性的内生真菌 ,经
鉴定属于木霉属菌(Trichoderma)。我们对该菌抑制
黄瓜灰霉病菌的作用进行了较为系统的研究 ,旨在
开发无公害的蔬菜病害生物防治技术。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　海岸低盐芦竹　采自黄海海岸浅水滩 。
1.1.2　黄瓜灰霉病菌及其培养　黄瓜灰霉病菌
(Botrytis cinerea)由南京大学生命科学学院微生物室
提供 ,用 PDA培养基(马铃薯 200 g ,蔗糖 20 g ,琼脂
20 g ,蒸馏水 1 000 ml ,pH 值自然)于28 ℃下培养 ,待
菌丝长满平皿时 ,用打孔器制成直径为 9 mm 的菌
丝块 。另挑取几环供试斜面上的菌丝 ,用无菌水洗
下 ,制成 108 CFU/ml的黄瓜灰霉病菌菌悬液 。
1.2　方法
1.2.1　芦竹内生真菌的分离与鉴定　芦竹采集后 ,
于无菌条件下去除根茎的表面组织后 ,置于无菌水
中研磨。取0.1ml研磨的浆液涂于含50 mg/L庆大
霉素的 PDA 固体培养基上 ,于 28 ℃下培养至菌丝
长出后 ,反复划线纯化 ,挑出单菌落接于 PDA 斜面
上保存。菌种采用 Ainsworth 等真菌鉴定系统和方
法进行鉴定。
1.2.2　芦竹内生真菌菌悬液与发酵液的制备　将
斜面保藏的芦竹内生真菌挑出几环 ,以无菌水制成
108 CFU/ml的菌悬液;另将芦竹内生真菌接于 PDA
液体培养基中 ,于 28 ℃、165 r/min摇床中培养 7 d ,
发酵液经冻融 、匀浆后 ,于4 000 r/min离心 5min ,取
上清液备用。
1.2.3　芦竹内生真菌对黄瓜灰霉病菌抑制作用测
定　将0.1 ml 108 CFU/ml的黄瓜灰霉病菌菌悬液与
20ml PDA培养基混合制成平板。以 0.2%的生理
盐水作阴性对照 , 500 mg/L的商业农药苯菌灵为阳
性对照 ,采用孔穴扩散法和滤纸片双层平板法测定
芦竹内生真菌菌悬液和发酵液对黄瓜灰霉病菌的抑
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DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2004.06.031
制作用 。孔穴扩散法:在上述混合平板上等距离打
3个直径为0.8 cm 的孔 ,每孔分别加入 0.05μl芦竹
内生菌菌悬液或发酵液 , 28 ℃下培养 ,48 h 后测定
抑菌圈直径 ,设 3个重复。滤纸片双层平板法:预先
配制好含 1.5%琼脂的底层培养基和上层培养基
(均为 PDA 培养基)。先将底层培养基在平板上浇
一层(约 10 ml),铺平凝固;另取上层培养基 ,接入黄
瓜灰霉病菌 ,摇匀 ,立即倒在底层平板上 ,铺平待凝 。
取经高压灭菌干燥的滤纸圆片 ,分别置于芦竹内生
真菌菌悬液或发酵液中浸泡 10 min后真空抽干 ,平
贴于上层平板表面 ,每个平板放 6个滤纸片 ,置于
28 ℃下培养 ,48 h后测量抑菌圈直径 ,设 3个重复。
1.2.4　生长竞争试验　采用两点对峙培养 ,即将芦
竹内生真菌与黄瓜灰霉病菌菌丝块接种于相对的
PDA平板边缘 ,28 ℃下培养 14 d ,连续观察测量菌
落的生长及相互影响情况 。
1.2.5　重寄生作用的测定　挑起上述对峙培养中
两菌落交界处的菌丝块 ,于光学显微镜下观察 。
1.2.6　芦竹内生真菌对离体黄瓜灰霉病斑的抑制
效果测定　以无菌水洗净刚采摘的幼嫩大棚黄瓜 ,
75%乙醇溶液消毒 ,室温下挥发干 。无菌状态下 ,用
手术刀片在黄瓜上切开一条 2 mm 深 、直径为 3 mm
的切口 。在切口上分别加入 15 μl的芦竹内生真菌
菌悬液或发酵液 ,静置 2 min ,使液体完全被黄瓜吸
收 ,然后将 15μl的黄瓜灰霉病菌菌悬液加入到切口
中。对照组以无菌水代替芦竹内生真菌菌悬液和发
酵液。将黄瓜置于托盘中 ,上面覆盖被无菌水潮湿
的滤纸 ,然后用塑料袋密封托盘 , 以维持较高的湿
度。托盘置于室温下观察 ,每天记录黄瓜上病斑的
变化情况 ,并计算芦竹内生真菌对灰霉病斑发展的
抑制率[抑制率(%)=对照组病斑面积-试验组病
斑面积)/对照组病斑面积×100] 。
2　结果与分析
2.1　芦竹内生真菌对黄瓜灰霉病菌的抑制效果
两种测定方法表明 ,菌悬液和发酵液都有较高
的抑菌活性 ,且活性强度与 500 mg/L的苯菌灵无显
著差异(表 1)。提示芦竹内生真菌细胞及其代谢产
物 ,对黄瓜灰霉病菌都有拮抗作用 。
2.2　芦竹内生真菌与黄瓜灰霉病菌的生长竞争
将芦竹内生真菌与黄瓜灰霉病菌作对峙拮抗培
养试验 , 其生长曲线见图1 。约4d后 ,芦竹内生真
表 1　芦竹内生真菌菌悬液和发酵液对黄瓜灰霉病菌的抑制作用
抑菌测定方法
抑菌圈直径(mm)
芦竹内生
真菌菌悬液
芦竹内生
真菌发酵液 阳性对照
孔穴扩散法 13a 15a 15a
滤纸片双层平板法 9a 12a 13a
　　注:同一行内 ,具有相同字母的数据 ,表明 LSD 分析差异不显著
(P>0.05)。
菌开始包围 、覆盖黄瓜灰霉病菌菌落 ,使其生长受到
抑制 ,面积不再扩展 ,菌落生长半径 Rp 明显低于对
照 R0 ,菌落逐渐萎缩 ,在芦竹内生真菌的进一步扩
张下(其半径 R f 不断扩大),最终全部萎缩 。可见 ,
芦竹内生真菌与灰霉病菌产生营养竞争 ,结果使灰
霉病菌生长受到明显抑制 ,整个平板为芦竹内生真
菌占据 ,并形成大量的绿色孢子 。在两菌交界面处
还可观察到一条清晰的拮抗带 ,说明产生了某种抗
生素物质 。
2.3　重寄生作用
挑取对峙培养交界面上的菌丝块镜检(表 2),
镜下可见芦竹内生真菌的菌丝以各种方式寄生于黄
瓜灰霉病菌菌丝上 ,如缠绕在病菌菌丝上 ,紧贴病菌
菌丝生长 ,穿透病菌菌丝和穿入病菌菌丝并在其上
生长 。同时 ,芦竹内生真菌菌丝寄生于病菌菌丝上 ,
使病菌的细胞质变稀薄而不能正常生长。当芦竹内
生真菌菌丝与病菌菌丝平行生长时 ,产生分枝吸附
于病菌菌丝上 ,进行侵入 、穿透 ,并通过酶的作用分
解病菌菌丝细胞壁 ,使之消解 。可见 ,芦竹内生真菌
对黄瓜灰霉病菌的重寄生作用是其拮抗的重要作用
机制之一 。
2.4　芦竹内生真菌对离体黄瓜灰霉病斑的抑制
作用
表 3给出了芦竹内生真菌不同处理对黄瓜灰霉
—81—纪丽莲:一株芦竹内生真菌对黄瓜灰霉病菌的抑制作用研究
表 2　芦竹内生真菌重寄生作用的显微观察
细胞质
变稀薄
细胞质
浓缩
菌丝
消解
菌丝
侵入
菌丝
穿透
菌丝
缠绕
菌丝
扭曲
++ ++ ++ ++ ++ +
病斑的抑制效果 。芦竹内生真菌107CFU/ml以上
细胞浓度的菌悬液与阳性对照苯菌灵具有等效的抑
制黄瓜灰霉病斑的效果 ,且这种效果在试验期 48 h
内很稳定 , 抑制率维持在 93%以上 , 表明其具有
长效抗病作用;芦竹内生真菌的发酵液在稀释 20
倍后培养 60 h时病斑抑制率仍达到 87.9%, 提示
芦竹内生真菌在代谢过程中产生了高效的抗生素等
次生代谢产物 , 可有效抑制黄瓜灰霉菌的生长 。这
与上述生长竞争试验相互印证 , 因而可推断抗生素
的产生是芦竹内生真菌防治黄瓜灰霉病的重要机制
之一 。
表 3　芦竹内生真菌不同处理对黄瓜灰霉病斑的抑制作用
处　　理
对黄瓜灰霉病斑的抑制率(%)
12 h 24 h 36 h 48 h 60 h
108 CFU/ml菌悬液 100.0a 100.0a 100.0a 96.5a 92.7a
107 CFU/ml菌悬液 100.0a 100.0a 97.2a 93.1a 89.0b
106 CFU/ml菌悬液 100.0a 98.9a 90.5a 82.6b 79.8b
105 CFU/ml菌悬液 90.3a 81.2b 72.4b 63.5c 45.1c
发酵液原液 100.0a 100.0a 100.0a 100.0a 97.4a
发酵液稀释 20倍 100.0a 100.0a 96.2a 91.7a 87.9b
发酵液稀释 40倍 90.3a 81.4b 72.6b 60.0c 44.8c
发酵液稀释 80倍 75.4b 60.2c 41.6c 25.5d 8.9d
阳性对照 100.0a 100.0a 100.0a 100.0a 96.1a
　　注:表中数字后字母不同者 ,表示 LSD 分析差异显著(P<0.05)。
3　小结与讨论
本研究结果揭示了芦竹内生真菌对黄瓜灰霉病
菌有良好的拮抗作用 ,这种作用源于内生菌细胞及
其代谢产物的协同效果。芦竹内生真菌生长速度
快 ,具较强的营养竞争能力 ,在生长过程中能占据绝
大部分营养空间 ,从而使灰霉病菌菌落最终萎缩 。
说明竞争作用机制是芦竹内生真菌防治黄瓜灰霉病
菌的主要机制。
芦竹内生真菌对黄瓜灰霉病菌的重寄生作用也
是其拮抗病菌的重要机制 。它通过缠绕 、穿透 、侵
入 、吸附等多种寄生方法侵入病菌菌丝 ,并通过酶的
作用消解病菌细胞壁 ,最终导致病菌死亡。同时 ,芦
竹内生真菌在生长过程中产生了某些抗生物质 ,从
而抑制病菌孢子萌发及菌丝生长 ,达到抑菌效果 。
因此 ,芦竹内生真菌既可作为黄瓜灰霉病菌的生物
防治剂 ,也可通过分离 、鉴定 、调控生产其次生代谢
产物(如抗生素)来开发生物农药。
许多文献报道木霉菌在对植物病原菌的拮抗及
重寄生过程中 ,几丁质酶及抗生素起着重要作用 ,如
几丁质酶消解和杀死病菌 ,抑制孢子萌发 、芽管伸长
和菌丝生长 ,诱导产生防卫素等[ 5～ 7] 。芦竹内生真
菌是否产生几丁质酶及抗生素目前尚在试验中 。
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