全 文 ：　　收稿日期: 2003-10-06
　　基金项目: 湖南省教育厅资助项目 ( 02C056)
　　作者简介: 洪亚辉 ( 1955-) ,女 ,汉族 ,湖南益阳人 ,湖南
农业大学研究员 .
　　文章编号: 1007-1032( 2003) 06-0474-04
碧冬茄花特异表达基因启动子 PchsA
的克隆与序列分析
洪亚辉 1, 3 ,蒋　泓2 ,萧浪涛3 ,黄　璜 1 ,张　文 1
( 1.湖南农业大学生物技术系 ,湖南 长沙　 410128; 2.暨南大学生命科学技术学院 ,广东 广州　 510632; 3.湖南农
业大学植物激素重点实验室 ,湖南 长沙　 410128)
摘　要: 根据 Ing rid M .报道的碧冬茄花特异表达基因 CHSA启动子的序列设计并合成一对特异引物 ,以碧冬茄总
DN A为模板 ,通过 PCR扩增出约 370 bp大小的 DN A片段 ,回收后克隆到 pUCm-T质粒载体上 ,经转化、筛选确
定重组子 ,酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序 ,得到片段长度为 370 bp.采用 DSgene分析软件进行序列分
析发现其基本具有启动子的所有保守序列 , T AT A box , CCAAT box , Anthe r box , G-box , TACPy AT box , box1,
box2, Capsite等 ,且经 Internet BLAS T程序和 DSgene分析软件进行同源性对比和序列分析 ,显示序列与已报道
序列同源性为 96% .登陆 GenBank, ID号为 AY360358.
关　键　词: 碧冬茄 ; Pchs A启动子 ;克隆 ;序列分析
中图分类号: S686; Q785　　　　　　　　文献标识码: A
Cloning and Sequence Analysis of Flow er Tissue-Speci fic
Expression Gene Promoter PchsA from Petunia hybrida
HONG Ya -hui
1, 3
,JIANG　Hong 2 ,XIAO Lang -tao 3 ,HUANG　Huang 1 ,ZHANG　Wen 1
( 1. Depa rtment of Bio techno lo gy , HNAU , Chang sha　 410128, PRC; 2. Co llege o f Life Science and Techno log y ,
JNU , Guang zhou　 510632, PRC; 3. Key Labo ra to ry o f Phy toho rmones, HNAU, Chang sha　 410128, PRC)
Abstract: Acco rding to the sequence o f f low er tissue-specific expression gene CHSA promo ter in
Petunia hybrida repo rted by Ing rid M. , w e design and synthesize a pai r o f primers. With to tal
DN A of Petunia hybrida used as template, w e get a DN A fragment about 370 bp ampli fied by
PCR procedure, reclaim the product and clone i t into plasmid vecto r pUCm-T. We confirmed the
recombinant af ter t ransfo rmation and fil t ra tion. Then the recombinant T-vecto rs a re identi fied by
rest riction enzymes and subjected to sequence analy sis. The result show s that this f ragment s
leng th is 370 bp. W e use DSgene analyse so f tw are analy zed the sequence and find tha t i t has all
the basic conserva tive sequences of a promo ter, TAT A box , CCAAT box , anther box , G-box,
T ACPy AT box , box1, box2, Capsite etc. These sequences are to tally the same as wha t is repo rt-
ed, and the f ragment is proved to share 96% homology w ith the reported sequence by Internet
BLAS T prog ramme and DSgene analyse sof twa re.
Key words: Petunia hybrida; PchsA promo ter; clone; sequence analysis
　　基因工程技术的发展使转基因植物的花色得到
定向改变已经成为可能 .外源基因能否在转基因植
株中高效稳定表达 ,是其花色能否定向改变的前提
条件 .基因表达的程序、时间和位置在不同层次上受
不同的调节因素控制 .采用什么样的启动子对于外
源基因的表达至关重要 .组织特异性表达启动子 ,如
在花、果实和种子等器官特异表达的启动子 ,不仅可
以提高外源基因的表达量 ,而且可将生物能耗降到
最低 ,不影响植株的正常生长 ,比组成型启动子更适
应转基因的各种特殊要求 .因此以碧冬茄 Petunia
第 29卷第 6期 湖南农业大学学报 (自然科学版 ) 　 Vol. 29 No. 6
2003年 12月 Journal of Hunan Ag ricultura l Univ er sity ( Na tural Sciences) Dec. 2003 „
DOI : 10. 13331 /j . cnki . jhau. 2003. 06. 005
hybrida 为材料分离克隆其 CHSA ( chalconesyn-
thase A)基因的启动子 Pchs A,拟以该启动子驱动
“蓝色基因 Hf1 , Hf2 , Hf6 , F1”在菊花中特异表达 ,培
育具有新型花色的切花新品种 .
1　材料和方法
1. 1　材料与主要试剂
碧冬茄购自湖南长沙红星花卉大市场 .受体菌
E. col i INV AF′为实验室保存菌种 ,植物组织细胞
基因组 DNA小量纯化试剂盒购自 Vitagene公司 ,
DN A限制性内切酶、 PCR产物克隆试剂盒、凝胶回
收试剂盒购自上海生工生物工程公司 ,核酸分子量
标准 ( DN A M arker Ladder)、核糖核酸酶 ( RN A酶
A )、 Taq酶、脱氧核苷三磷酸 ( deoxyribonucleo side
t ripho spha te, dN TP)购自北京鼎国生物工程公司 .
1. 2　碧冬茄基因组 DNA的提取
参照 Vitag ene公司操作流程进行取碧冬茄幼
嫩叶片 ,清洗、吸干、称质量后取液氮 ,在液氮中迅速
将其研磨至粉末状 ;按试剂盒说明相继加入 S-G, G-
A, G-B溶液 ,过滤后弃去蓝色上相 ;再加入 G-C,将
DNA吸附至 DNA结合柱 , W1和 W2洗涤液过柱洗
涤 ,再用 DNA溶解液洗脱、收集 DNA.用 1%的琼
脂糖凝胶电泳进行鉴定 .
1. 3　PCR引物的设计和合成
PCR引物参照文献 [1]报道的序列 ,用 DSgene
分析软件设计上游和下游引物 P1 , P2 ,由上海生工
生物工程公司合成 ,引物序列为:
　　 P1 : 5′-GGAAGCT T TTCCTG TTCAAAGC
T GATG -3′, P2 : 5′-GCTCTAGACGA TT TT TG
CTT GAAAAAAG-3′.
1. 4　PCR反应及其产物的纯化
以碧冬茄幼嫩叶片基因组 DNA为模板 ,用 1. 3
中合成的引物作特异引物进行 PCR反应 . PCR反
应体系总体积为 40μL,其中包括模板 2μL( 100
ng )、引物 P1和 P2各 1. 5μL( 10 pmo l /μL) , dN TPs
0. 5μL( 10 mmo l /L)、 Taq酶 0. 5μL( 1 U )、 10倍
PCR buffer 4. 0μL和双蒸水 30μL. PCR反应循环
条件为 94℃预变性 10 min, 94℃变性 30 s, 55℃退
火 30 s, 72℃延伸 30 s, 37个循环 ,然后 72℃延伸
15 min. PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后 ,切
下目的条带 ,用凝胶回收试剂盒回收 .
1. 5　重组质粒的构建、筛选及鉴定
按上海生工生物工程公司的 PCR产物克隆试
剂盒操作手册 ,将碧冬茄花特异性启动子 PchsA的
PCR纯化产物克隆进 pUCm-T载体 ;转化 E. coli
INV AF′感 受态细 胞 ,接种 到含有 Ampici llin /
IPTG /X-gal的 LB平板 ,用蓝白斑进行初步筛选 ,
挑取白色菌落 ,以上述 PCR反应体系和条件进行鉴
定 ,将检测到阳性信号的白色菌落接种于含有
Ampicillin的 LB液体培养基中 , 37℃ , 200 r /min
培养过夜 ,收集菌体 ,碱法提取质粒 ,用 PstⅠ 单酶
切以及质粒 PCR鉴定 PchsA-pU Cm-T重组质粒 ;
将含有正确插入子的重组质粒送上海生工生物工程
公司进行序列测定 .
2　结果与分析
2. 1　碧冬茄基因组 DNA的提取
采集碧冬茄幼嫩叶片 ,用 Vitag ene植物组织细
胞基因组 DNA小量纯化试剂盒 ,提取的碧冬茄基
因组 DNA,呈单一条带 ,纯度高 .
2. 2　PCR结果
以碧冬茄基因组 DNA为模板 , P1 , P2扩增得到
预期大小的约 400 bp片段 (图 1) .
1.回收后 PCR产物 ; 2.碧冬茄基因组 DN A; M . DNA
Marker Ladder
图 1　碧冬茄基因组 DNA的提取和其花特异性表达
基因启动子 PchsA的 PCR扩增结果
Fig . 1　Petunia hybr ida genomic DNA extraction and PCR
ampli fi cation of Petunia hybrida flower tissue -
specific expression gene promoter PchsA
2. 3　PchsA -pUCm -T重组质粒的鉴定
Pchs A-pUCm-T重组质粒经 PstⅠ 单酶切后 ,
切出预期 400 bp片段 ,说明碧冬茄花特异性启动子
PchsA已经正确插入 pU Cm-T载体中 (图 2) .
2. 4　测序及序列分析结果
含 PchsA启动子的 pU Cm-T重组质粒测序结
475　第 29卷第 6期 洪亚辉等　碧冬茄花特异表达基因启动子 PchsA的克隆与序列分析
　　 1.原始 PCR产物 ; 2.重组质粒 PC R产物 ; 3.未重组质
粒 ; 4.酶切质粒 ; 5.未酶切质粒 ; M. DN A Marker Ladde r
图 2　碧冬茄花特异性表达基因启动子 PchsA
重组质粒酶切鉴定图
Fig. 2　 Id ent ifi cation w ith res t rict ion en zyme of the recombinan t
plasmid con taining Petunia hybrida f lower t issue -
specific expression gene promoter PchsA
果 ,经 BLAST程序和 DSgene分析软件进行同源性
对比和序列分析 ,显示序列与已报道序列同源性为
96% (图 3) .
经序列测定 ,该片段全长 370 bp,采用 DSgene
分析软件进行序列分析 ,其在第 238～ 244位碱基之
间有一个 T ATA box ( T ATAAA T) ,在第 61～ 72
位
碱 基 之 间 有 一 个 CCAAT box ( CAAGGCCA
TTCA ) ,在第 267～ 272位碱基间有一戴帽位点
capsite ( CCAT AA) ,它们是基础启动子所必有的
表达调控元件 ;另外其在第 29～ 44位碱基间有一个
anther box ( TAGAAGTGACAGAAAT) ,它是目
的基因在幼嫩的花药中特异表达所必须的调控元
件 ;在第 140～ 157位碱基之间有一个 box2元件 ,在
第 172～ 186位碱基间有一个 box1元件 , bo x1和
box2元件是与类黄酮生物合成相关酶基因启动子
的保守序列 ; box1元件内包含有一个 G-box
　　　　
图 3　碧冬茄花特异性表达启动子 PchsA的序列和报道序列的比较
Fig . 3　Comparison of the sequences between the flower tissue -speci fi c expression promoter PchsA of
Petunia hybr ida and the sequence reported
( CACGTG) ,而且在第 199～ 204位碱基之间还有
一个 G-box ,它是花核蛋白的结合域 ,是光、厌氧生
活和 ABA应答元件 ,受光和紫外线诱导调控 ,并与
花特异表达有关 ,在第 207～ 219位碱基之间有两个
拷贝的 TACPyAT box ,它是决定花特异表达的序
列 .所有这些调控元件及其附近的序列与报道的序
列基本一致 .
2. 5　GenBank 登记
碧冬茄花特异性启动子 PchsA,在 Internet上
用 BANKIT程序进行序列登记 , GenBank ID号为
AY360358,已在网上发布 .
476 湖南农业大学学报 (自然科学版 ) 2003年 12月　
3　讨　论
植物花的颜色主要由三大类群色素决定 [2, 3 ]: 类
黄酮 ( f lav onoids)色素、类胡萝卜素 ( carotenoids)色
素以及与生物碱有关的其他水溶性色素 .大自然中
普遍缺少蓝色花系的花 ,蓝色花仅仅局限于高度进
化的被子植物家族 ,而很多原始的家族只拥有以花
青素为基础的色素 (其色调从红色到紫色 ) .所以 ,蓝
色花花色素的结构和形成机理以及使花色显蓝的基
因工程研究是近年来的热点之一 .
到目前为止 ,大多数蓝色花的新品种都是采用
传统育种法获得的 ,蓝花植物的花色素主要是翠雀
素 .由于大多数植物缺乏翠雀素的前体 ,用传统的育
种法来培育缺乏翠雀素前体的蓝花是不可能的 .随
着基因工程技术的发展 ,利用基因工程技术导入外
源基因可以解决这个问题 .目前 ,已发现了不少类黄
酮生物合成途径中酶的结构基因及其调控基因 ,如
CHSA, CHI( chalcone-f lav anone) , F3H( f lav anone3-
hydroxylase ) , DFR ( dihydro flav ono l4 reductase ) ,
U FGT( U DP-g lucosef lav onoid3-oxy-g luco sy transf-
erase)等 [4, 5 ] .当植物本身含有花色素代谢的结构基
因 ,如果因组织特异性或缺乏调节基因表达产物的
激活而不表达时 ,则可采用导入调节基因并使其适
当表达而改变植物花色 .为了提高外源基因在花组
织中的特异表达 ,增加转基因效果 ,近年来人们相继
分离和鉴定了许多花特异表达基因的启动子 ,如大
豆的苯丙氨酸氨裂解酶 PAL2基因的启动子 [6 ] ,碧
冬茄、金鱼草与类黄酮合成相关的一些基因 CHSA,
CHSJ, CHIB, CHIA2的启动子 [7 ] .其中对查尔酮合
成酶基因家族的 CHSA启动子的了解较多 ,它是光
依赖性的并在花器官中特异表达的启动子 ,在 UV
诱导条件下也在实生苗中低水平的表达 [1 ] .本试验
成功克隆碧冬茄花组织特异性表达启动子 ,并准确
测定其序列 ,证明了 Ing rid的结果对不同来源的材
料具有广泛性 ,同时也获得了差异性的表现 (如除启
动子的基本元件外的其他序列均与 Ingrid的结果有
或多或少的差别 ) ,而且自己得到了启动子的片段 .
参考文献:
[ 1]　 Ing rid M van der Meer , Cornelis E Spelt, Jo sph N M
Mol, et al. Pr omo ter analy sis o f the chalcone synthase
( ch sA) g ene of Petunia hybrida: a 67 bp promote r r e-
gion directs flow er specific expression [ J]. Plant Mol
Bio l, 1990, 15: 95-109.
[ 2]　 Mitchell K A, Markha rn K R, Boase M R. Pigment
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[ 3]　 Tanaka Y , T suda , Kusumi T. Metabo lic engineering to
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[ 4]　 Brenda W S. Flavonoid biosynthesis: A co lo rf ul model
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477　第 29卷第 6期 洪亚辉等　碧冬茄花特异表达基因启动子 PchsA的克隆与序列分析