全 文 ：　 2005年 10月第 24卷　第 5期
绵阳师范学院学报
Journa l o fM ianyang Norm al University
O c.t , 2005
Vo .l 24　No. 5　
收稿日期:2005-03-08
作者简介:代敏(1974～ 　),女 ,讲师 、硕士 ,主要从事微生物学研究。
苜蓿根瘤菌对环境 pH影响的试验研究
代　敏 ,王雄清 ,罗　英
(绵阳师范学院动物应用技术研究所 , 四川绵阳　621000)
摘　要:研究表明 , 6株苜蓿根瘤菌能在含 1% ～ 8%NaC l、K 2 SO 4及 pH 7 ～ 13的环境中生长 ,具有较强的耐盐
性和耐碱性。除 1株产碱外 , 其余 5株都产酸 ,随环境 pH、NaC l、K2 SO4浓度的增加菌株产酸(碱)的能力逐渐降低。
苜蓿根瘤菌通过产酸(碱)改变环境 pH值 ,从而对 pH值较高的盐碱地具有一定的改良作用。
关键词:苜蓿根瘤菌;酸;盐碱地
中图分类号:Q939.1　　文献标识码:A　　文章编号:1672-612x(2005)05-0084-04
0　引言
土壤盐碱化是农业生产中普遍存在的问题 ,我国的盐碱化土壤占现有耕地面积的 1 /4[ 1] 。西部的半干
旱地区分布有不同程度的盐碱地 ,尤其是在新疆的干旱地区分布有不同程度的盐碱化土壤。这些盐碱化土
壤中含有较高浓度的 N aC l、K 2SO 4 、Na2CO3 、Na2 SO4等 , pH值一般在 8. 0以上 ,一般植物难以生长 ,从而导致
土壤的荒漠化。根瘤菌是一类生活在土壤中的革兰氏阴性杆状细菌 ,在合适的条件下 ,能浸染苜蓿 、花生 、大
豆等豆科植物 ,而某些苜蓿根瘤菌能够产酸产碱 ,具有改良盐碱地的作用[ 1 ～ 2] 。土壤本身也是一个复杂的生
态系统 ,土壤的类型 、pH值及其它理化性质自身也会影响根瘤菌的产酸(碱)及竞争结瘤的能力 [ 3] 。此外 ,
根瘤菌能与豆科植物进行共生固氮结瘤 ,该固氮体系是已知固氮能力最强的生物固氮体系之一 ,每年固氮量
占全球生物固氮量的 65%以上 ,在可持续农业发展中起着重要的作用 [ 4] 。为此 ,本研究对苜蓿根瘤菌进行
分离纯化 ,并测定了其在不同 pH值 、N aC l以及 K2 SO 4浓度中的生长情况及对环境 pH的影响 ,为苜蓿根瘤菌
对盐碱化土壤的改良提供依据 。
1　材料与方法
1.1　培养基
YMA(酵母汁 -甘露醇琼脂 )培养基;Jense固体培养基 。
1.2　样品的采集及菌株的分离与纯化
分别从绵阳师范学院和绵阳市森林公园采取苜蓿根瘤样品共 10个。将采集到的新鲜样品用清水洗净
后 ,分别用 2%双氧水洗 1 ～ 2m in、1%酸性 HgC l2洗 2 ～ 3次 、无菌蒸馏水洗 5 ～ 6次 ,用无菌刀片将根瘤切开
后涂抹于 YMA培养基 , 28℃恒温培养 2 ～ 3d,具体方法参见文献 [ 5 -6] 。挑取生长好 、不吸色的单个菌落进行
纯化培养 ,标明采集时间 、地点及编号等信息后保存于 4℃冰箱备用。
1.3　苜蓿根瘤菌的鉴定
1.3.1　菌落特征的观察及革兰氏染色
对分离纯化的菌株进行菌落特征的观察 ,并用革兰氏染色法对其进行染色。
1.3.2　回接试验
将表面灭菌的苜蓿种子插入含 Jense固体培养基的斜面上 ,并接种相应的分离菌株 ,以接种标准苜蓿根
84
DOI牶牨牥牣牨牰牪牱牰牤j牣cnki牣cn牭牨牠牨牰牱牥牤g牣牪牥牥牭牣牥牭牣牥牪牪
瘤菌为阳性对照 ,不接种为阴性对照 ,于 28℃恒温培养 ,光照 12h /d,具体方法参见文献[ 7] 。
1.4　pH值与盐浓度对苜蓿根瘤菌产酸 (碱 )量的影响试验
1.4.1　pH值影响试验
用 N aOH分别调 YMA培养液的 pH值至 7、8、9、10、11、12、13共 7个梯度 ,每个梯度为 1组 ,分装在 7支
试管内 ,每支试管 15mL。将分离纯化的 6株根瘤菌液 1mL(约 106CFU /mL)分别接种于上述各组 YMA培养
液中 , 28℃培养 3 ～ 5d,测定各组培养液 pH值的变化情况 。每株菌株做 5个重复。
1.4.2　N aC l影响试验
在 pH值为 7.0的 YMA培养液中加入 NaC l,使 N aC l的质量百分比浓度分别为 1%、2%、3%、4%、5%、
6%、7%、8%,共 8个梯度 ,每个梯度为 1组 ,分装在 8支试管内 ,每支试管 15mL,以不加 N aC l为对照组。将
分离纯化的 6株根瘤菌液 1mL(约 106CFU /mL)分别接种在上述各组 YMA培养液中 , 28℃培养 3 ～ 5d,测定
各组培养液 pH值的变化情况 。每株菌株做 5个重复。
1.4.3　 K2 SO 4影响试验
在 pH值为 7.00的 YMA培养液中加入 K2 SO4 ,使 K2 SO4的质量百分比浓度分别为 1%、2%、3%、4%、
5%、6%、7%、8%,共 8个梯度 ,每个梯度为 1组 ,分装在 8支试管内 ,每支试管 15mL,以不加 K 2 SO4为对照
组 。将分离纯化的 6株根瘤菌液 1mL(约 106CFU /mL)分别接种在上述各组 YMA培养液中 , 28℃培养 3 ～
5d,测定各组培养液 pH值的变化情况。每株菌株做 5个重复。
2　结果与讨论
2.1　分离纯化结果
对采集样品进行分离和纯化 ,共获得 6株菌株 ,分别编号为:M1 、M2 、M3 、M4 、M 5、M6。
2.2　鉴定试验
2.2.1　菌落特征及革兰氏染色
菌落呈圆形 ,中央稍凸起 ,直径约 0.5 ～ 1.5cm ,边缘整齐 ,表面光滑 、粘稠状 、易流动 ,有光泽 ,菌落不吸
色 ,具有一般根瘤菌的形态特征 [ 8] 。革兰氏染色结果表明 , 6株菌株均为革兰氏阴性杆菌。
2.2.2　回接试验
在阳性对照植株能结瘤 、阴性对照植株不结瘤的前提下 ,接种分离菌株的植株都能结瘤 。根据菌落特
征 、革兰氏染色及回接试验结果 ,证实所分离的 6株菌株都是苜蓿根瘤菌。
2.3　 pH值和盐浓度对苜蓿根瘤菌产酸(碱)量的影响
2.3.1　pH值对苜蓿根瘤菌产酸量的影响
pH值对苜蓿根瘤菌产酸量的影响结果见表 1,统计分析结果见图 1。
表 1　pH 值对苜蓿根瘤菌产酸量的影响
菌　株
编　号
不同 pH值环境中的 pH值变化(△pH)
7 8 9 10 11 12 13
M 1 0.50 0. 82 0. 43 0.19 0.13 -0.01 0.00
M
2 1.37 1. 37 0. 79 0.22 0.00 0. 01 -0. 02
M
3 1.43 1. 15 0. 37 0.29 0.12 0. 07 0.02
M 4 1.29 1. 53 0. 76 0.07 0.10 0. 05 -0. 02
M 5 - 0. 14 - 0.22 -0.23 -0. 12 - 0. 03 0. 00 0.01
M
6 0.33 0. 17 0. 23 0.08 - 0. 01 0. 02 -0. 01
　　注:当 pH﹥ 7. 0时△pH =培养前的 pH值 - Log1515 /16 -培养后的 pH值。
85
代　敏 ,王雄清 ,罗　英 苜蓿根瘤菌对环境 pH影响的试验研究
　　　图 1　pH值对苜蓿根瘤菌产酸量的影响
F ig 1:Influence of pH on rhizobium meliloti produc ing acid
　　由表 1和图 1可知:分离的 6株苜蓿根瘤菌能在 pH
7 ～ 13的环境下生长 ,具有较强的耐碱性。除 M5菌株产
碱外 ,其余 5株都产酸 ,且随环境 pH值的升高 , pH值的
变化总体呈下降趋势 ,即随着环境 pH值的不断增加 ,苜
蓿根瘤菌对环境 pH值的影响越来越小 。如 M1菌株在
pH值 13时几乎对环境 pH值无任何影响 ,产酸 (碱 )量
趋近于零。
2.4.2　N aC l对苜蓿根瘤菌产酸 (碱)量的影响
NaC l对苜蓿根瘤菌产酸 (碱)量的影响结果见表 2,统
计分析结果见图 2。
表 2　N aC l对苜蓿根瘤菌产酸量的影响
菌　株
编　号
不同 NaCI浓度对环境 pH的影响(△pH)
1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% 对照(%)
M 1 0. 16 0.27 0. 31 0. 20 0.12 0. 16 0.10 0.11 0. 05
M 2 1. 40 1.38 1. 30 1. 10 0.45 0. 25 0.09 0.02 1. 16
M 3 1. 30 1.07 1. 10 0. 50 0.26 0. 08 0.02 -0.03 1. 12
M 4 1. 37 1.15 1. 28 0. 96 0.10 0. 02 0.04 0.01 1. 10
M 5 - 0. 46 - 0. 55 - 0.38 - 0. 34 -0. 11 - 0.06 - 0. 08 0.02 - 0.23
M 6 0. 30 0.20 0. 26 0. 30 0.14 0. 11 0.02 -0.04 0. 26
图 2　NaC l对苜蓿根瘤菌产酸量的影响
F ig2　 Influence of NaC l on rhizobium meliloti producing acid
　　注:△pH =培养前的 pH值 -培养后的 pH值。
由表 2和图 2可知:6株苜蓿根瘤菌能在含 1%
～ 8%N aC l的环境下生长 ,具有较强的耐盐性和生
长范围 。在含不同 NaC l浓度的环境中 ,仅 M5菌株
产碱 ,其余 5株都产酸 ,且随 NaC l浓度的增加 , pH
值的变化总体呈下降趋势 ,即随着环境 N aC l浓度
的不断增加 ,苜蓿根瘤菌对环境 pH值的影响越来
越小 ,其产酸 (碱 )的能力逐渐降低。
2.4.3　 K2SO4对苜蓿根瘤菌产酸量的影响
K 2SO 4对苜蓿根瘤菌产酸(碱 )量的影响结果见
表 3 ,统计分析结果见图 3。
表 3　K2 SO4对苜蓿根瘤菌产酸量的影响
菌　株
编　号
不同 K 2 SO 4浓度对环境 pH值的影响(△pH)
1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% 对照(%)
M 1 0. 35 0.3 0. 2 0. 21 0.12 0. 1 0.02 0.01 0. 47
M 2 1. 57 1.39 1. 45 0.7 0. 5 0. 18 0.19 0.18 1. 34
M 3 1. 35 1.24 1. 04 0.6 0.17 0. 04 0.01 0.02 1. 3
M 4 1.3 1.12 1. 03 0. 91 0.17 0. 02 0.01 0 1. 13
M 5 - 0. 37 - 0. 41 - 0.52 - 0. 5 -0. 26 - 0.07 - 0. 03 -0.01 - 0.18
M 6 0.4 0.29 0. 26 0. 44 0.47 0. 03 0.02 0.01 0. 38
　　注:△pH =培养前的 pH值 -培养后的 pH值 .
由表 3和图 3可知:6株苜蓿根瘤菌都能在含 1% ～ 8%K2SO4的环境下生长 ,具有较强的耐盐性 ,与康金
花 [ 1]等报道一致。在含不同 K 2SO 4浓度的环境中 ,仅 M5菌株产碱 ,其余 5株都产酸 ,且随环境 K2 SO 4浓度的
86
绵阳师范学院学报 2005　Vo.l 24　N o.5
图 3　K 2 SO 4对苜蓿根瘤菌产酸量的影响
F ig3　 Influence o fK
2
SO
4
on rhizobium meliloti producing acid
增加 , pH值的变化总体呈下降趋势 。即随着环境 K2
SO 4浓度的不断增加 ,苜蓿根瘤菌对环境 pH值的影
响越来越小 ,其产酸(碱)的能力逐渐降低 ,这可能与
随着 K2 SO 4浓度的增加苜蓿根瘤菌受到不同程度地
抑制有关。
3　结论
一般根瘤菌生长的 pH环境为 6.7 ～ 7.5,过酸过
碱都会抑制其生长 ,而我们分离纯化的 6株苜蓿根瘤
菌的 pH生长范围为 7 ～ 13。耐盐性试验研究表明 ,
苜蓿根瘤菌具有较强的耐盐性 ,能在含 1% ～ 8%的
N aC l、K 2SO 4的培养基中生长 。
除 M5菌株产碱外 ,其余 5株都产酸。M 5菌株在 pH7 ～ 10、3 ～ 4%N aC l和 3 ～ 4%K 2 SO4浓度环境下产碱
较大 ,对环境 pH值影响较大。M1 、M2 、M3 、M 4、M6菌株在 pH7 ～ 9、1% ～ 5% NaC l和 1 ～ 5%K2 SO 4浓度的环
境中产酸较多 ,对环境 pH值影响较大。此外 ,随着环境 pH、NaC l、K2 SO4浓度的增加苜蓿根瘤菌产酸 (碱)的
能力逐渐降低 ,表明苜蓿根瘤菌的产酸(碱 )能力受盐浓度和 pH值的影响 ,这也可能与菌株在高 pH值和盐
浓度条件下生长受到抑制有关。而顾素芳报道 ,有些根瘤菌产酸 (碱 )不是绝对的 ,它与培养基的成分有
关 [ 7] 。
总之 ,苜蓿根瘤菌具有一定的产酸(碱 )能力和改善环境 pH值的作用 。若要将苜蓿根瘤菌具体运用于
盐碱地土壤的改良 ,对于有关根瘤菌的生理生化 、遗传及其在土壤中的生理活性和生长情况等有待于进一步
研究。
参考文献:
[ 1] 　康金花 , 关桂兰 ,沈艳芳 .苜蓿根瘤菌耐盐碱性实验. 干旱区研究 [ J] . 1996, 13(3):75 ～ 77.
[ 2] 　吴健 , 杨苏声 ,李季伦. 苜蓿根瘤菌的耐盐性研究. 微生物学报 [ J] . 1993, 33(4):260 ～ 267.
[ 3] 　何庆元 , 胡艳 ,王永雄. 生态环境对根瘤菌竞争结瘤影响的研究进展 [ J] .大豆科学 , 2004, 23(1):66 ～ 70.
[ 4] 　陈文峰 , 陈文新.我国豆科植物根瘤菌多样性及应用基础研究 [ J] . 生物学通报 , 2003, 38(7):1 ～ 4.
[ 5] 　陈丹明 , 曾昭海 ,隋新华等.紫花苜蓿高效共生根瘤菌的筛选 [ J] .草业科学 , 2002, 19(6):27 ～ 31.
[ 6] 　V ince.t J. M.上海植物生理研究固氮室译.根瘤菌实用研究手册 [ M ] . 上海:上海人民出版社 , 1970.
[ 7] 　顾素芳 , 吴晓辉 ,张红等 . N itro苜蓿和鹰嘴云英根瘤菌的分离与鉴定 [ J] .四川师范大学学报 , 1997, 20(6):79 ～ 83.
[ 8] 　陈华奎 , 樊庆笙主编.微生物学 [M ] . 北京:农业出版社 , 1979.
The Influence ofRhizobium M elilo ti on Environm ent pH
DA IM in,WANG X iong-q ing, LUO Ying
(Institute ofApplied AnimalTechnology, M ianyang NormalUniversity, M ianyang, S ichuan　621000)
Abstract:S ix strains ofRh izobium meliloti were iso lated that grew in the env ironment of 1% ～ 8%N aC l, or
1% ～ 8% K2 SO4 , or pH7 ～ 13. They have a characteristic of strong saline-a lkali to le rance . Except one strain o f
Rhizobium meliloti that produces a lkali, the o ther 5 iso lates produce acid. W ith the increase o f pH , and concentra-
tions of NaC l and K2 SO4 , correspond ing capacities o f producing acid /alkali of Rh izobium meliloti gradually de-
scend. Rhizobium meliloti can improve Environment pH by producing acid and alkal.i Therefore, Rh izobium meliloti
canme lio rate a lkaline land w ith h igh pH to a ce rta in deg ree.
Key words:Rhizobium meliloti;acid;alka line land
87
代　敏 ,王雄清 ,罗　英 苜蓿根瘤菌对环境 pH影响的试验研究