全 文 ：Apoptosis effect of Siraitia grosvenorii extracts on lung cancer
cells A549 and its mechanisms
LIU Can1，2，CAI Tian-yu1，ZHAO Xiao-meng1，MA Lan-qing1，DOU De-quan1，SUN Yuan-xia2
［1． Key Laboratory of Urban Agriculture ( North) of Ministry of Agriculture，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China;
2． Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China］
Abstract: Aim To study the apoptosis effect of Sir-
aitia grosvenorii extract on human lung cancer cells
A549 and its mechanisms． Methods MTT assay was
applied to determine A549 cell proliferation． Hoechst
33258 staining was applied to investigate morphological
changes in A549 cells． To find out the cause of cell
growth inhibition，several experiments on cell cycle
distribution and apoptosis were performed by flow cy-
tometry analysis． The expression of p21 and Bcl-2 was
determined by Western blot． Ｒesults Flow cytometry
analysis showed that treatment with mogrol arrested
A549 cells in the G0 /G1 phase and induced apoptosis．
After treatment with Siraitia grosvenorii extract，West-
ern blot experiment showed cell cycle regulator p21 was
up-regulaed，while the apoptosis inhibitor Bcl-2 was
down-regulated． Conclusion Treatment with Siraitia
grosvenorii extract arrests the A549 cells at G0 /G1
phase and induces apoptosis that may contribute to the
anti-proliferation activity of mogrol through the regula-
tion of p21 and Bcl-2 expression．
Key words: Siraitia grosvenorii; lung cancer cells A549;
medicinal and edible; apoptosis; p21; Western blot
网络出版时间: 2015 － 8 － 10 14: 37 网络出版地址: http: / /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． Ｒ． 20150810． 1437． 026． html
UPLC-MS法测定大鼠血浆中荭草花的 3 个
指标成分及其药动学研究
黄 勇1，3，胡 杰1，陆 苑1，3，郑 林1，3，兰燕宇2，3，李勇军2，3
( 贵阳医学院 1．贵州省药物制剂重点实验室，2．民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，3．药学院，贵州 贵阳 550004)
doi: 10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2015． 09． 026
文献标志码: A 文章编号: 1001 － 1978( 2015) 09 － 1314 － 05
中国图书分类号: Ｒ-332; Ｒ282. 71; Ｒ284. 1; Ｒ969. 1
摘要:目的 建立 UPLC-MS 法测定大鼠口服荭草花提取物
后血浆中原儿茶酸、山柰素 －葡萄糖、槲皮苷的分析方法，并
用该方法研究原儿茶酸等 3 个指标成分的药物代谢动力学。
方法 血浆样品选择酸化后甲醇沉淀蛋白，Waters BEH C18
( 2. 1 mm × 100 mm，1. 7 μm) 柱，流速: 0. 30 mL·min －1，流动
相: 0. 1%甲酸乙腈 － 0. 1%甲酸水梯度洗脱，采用电喷雾电
离源( ESI) ，扫描方式为多反应离子监测( SIＲ) 。结果 3 种
收稿日期: 2015 － 04 － 29，修回日期: 2015 － 06 － 20
基金项目: 国家自然科学基金资助项目( No 81360664 ) ; 贵州省中药
现代化科技产业研究开发专项项目 ( 黔科合重 G 字
［2013］4001) ;贵州省高等学校创新能力提升计划 ( 黔教
合协同创新字［2013］04)
作者简介:黄 勇( 1976 － ) ，男，教授，研究方向:中药活性成分及新
药开发，Tel: 0851-6908899，E-mail: hujie51619@ sina． cn;
李勇军( 1973 － ) ，男，教授，研究方向:中药药效物质基础
及新药开发，通讯作者，Tel: 0851-6908899，E-mail: 759843
553@ qq． com
成分分别在 2. 74 ～ 677、0. 69 ～ 186、0. 82 ～ 200 μg·L －1呈良
好线性关系。提取回收率、精密度、准确度和稳定性均良好
达到测定要求。原儿茶酸、山柰素 －葡萄糖和槲皮苷 3 个指
标成分的 Tmax ( h) 分别为 0. 46 ± 0. 1、0. 79 ± 0. 33 和 2. 63 ±
4. 6，Cmax ( μg·L
－1 ) 分别为 463. 8 ± 207. 81、18. 53 ± 7. 82 和
137. 38 ± 71. 09。结论 建立的 UPLC-MS 检测方法具有特
异、快速、准确和灵敏的特点，能够同时测定生物样品中原儿
茶酸等 3 种成分的血药浓度，并成功应用于荭草花在正常大
鼠体内这 3 个指标成分的药动学研究。
关键词:荭草花; 大鼠; UPLC-MS; 原儿茶酸; 山柰素 － 葡萄
糖;槲皮苷;药代动力学
荭草花为蓼科植物荭蓼 ( Polygonum orientale
L． ) 的花序，又名水荭花; 荭草花具有行气活血，消
积，止痛的功效，用于治疗头痛、心胃气痛、腹中痞积
等。课题组在对荭草各部位药理筛选实验中发现，
荭草花水煮醇沉后的正丁醇萃取部位有较强的抗心
肌缺血，减少心肌梗死面积作用。化学成分研究表
明，主要含有酚酸类的原儿茶酸及黄酮类的山柰素
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－葡萄糖苷、槲皮苷等成分，文献报道该类化合物为
主要活性成分［1］。
为此，课题组以原儿茶酸、山柰素 －葡萄糖苷和
槲皮苷为指标性成分，研究大鼠灌胃荭草提取物后
体内的药代动力学特征，考察 3 个指标成份在大鼠
体内的经时过程，获得其动力学参数，为进一步研究
开发荭草及其制剂奠定基础［2 － 3］。
1 材料与方法
1． 1 药品与试剂 原儿茶酸对照品 ( 批号 809 －
200102，纯度≥0. 98，中国药品生物制品鉴定所) ;葛
根素( 批号 0752 － 9605，纯度≥0． 98，中国药品生物
制品鉴定所) ;槲皮苷对照品、山柰素 －葡萄糖对照
品对照品( 均自制，纯度≥0. 98) ;甲醇、乙腈和甲酸
等试剂均为色谱纯。
1． 2 仪器 WATEＲS ACQUITY UPLC 超高压液相
三重四级杆质谱联用仪( 二元梯度泵，真空脱气机，
柱温箱，Masslynx 4． 1 质谱工作站，自动进样器) ; Al-
legra 64Ｒ低温高速离心机( 美国 Beckman Coulter公
司) ; AE240 十万分之一电子天平( 梅特勒 －托利多
仪器上海有限公司) ; MTN-2800D氮吹浓缩装置( 天
津奥特塞恩斯仪器有限公司) ; CQ 250A-TS 超声波
清洗机( 上海跃进医用光学器械厂) ; ZH-2 涡旋混合
器( 天津药典标准仪器厂) 。
1． 3 实验动物 健康Wistar大鼠♀♂兼用，体质量
为( 230 ± 20 ) g，由贵阳医学院动物中心提供［批号
SCXK( 黔) 2002 － 0001］。
1． 4 药代动力学数据处理 采用 DAS2． 0 数据处
理软件进行药代动力学参数计算和数据拟合，选取
最小 AIC值拟合房室模型，AUC0 － t，MＲT 等参数选
用统计矩方法计算。并对 AUC0 － t，MＲT进行方差分
析确定其动力学模型。
1． 5 标准溶液的配制
1． 5． 1 原儿茶酸等 3 种物质系列标准溶液的配制
精密称取原儿茶酸、槲皮苷和山柰素 －葡萄糖适
量，用甲醇定容至 10 mL。获得原儿茶酸 ( 1. 202 g
·L －1 ) 、槲皮苷( 1. 200 g·L －1 ) 和山柰素 －葡萄糖
( 1. 216 g·L －1 ) 的储备液。分别精密量取原儿茶酸
等 3 种对照品储备液适量，用甲醇按梯度稀释成所
需浓度，得混合系列标准溶液。置冰箱( － 20 ℃ ) 保
存，备用。
1． 5． 2 内标溶液的配制 精密称取葛根素( 10. 33
mg) ，用甲醇定容至 25 mL。获得葛根素( 0. 4 132 g
·L －1 ) 的储备液。取内标储备液适量至 10 mL 容
量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成 2 mg·L －1的内
标溶液，置冰箱( － 20 ℃ ) 保存，备用。
1． 6 色谱条件 色谱柱Waters BEH C18 ( 2. 1 mm ×
50 mm，1. 7 μm) 柱，保护柱: Waters Van Guard BEH
C18 ( 2. 1 mm ×5 mm，1. 7 μm) ，柱温: 45 ℃，流动相:
0. 1%甲酸乙腈 － 0． 1%甲酸水梯度洗脱。进样体积
为 1 μL。液相梯度见 Tab 1。
Tab 1 Four components chromatographic conditions
Time /
min
Flow velocity /
mL·min －1
Organic
phase /%
Aqueous
phase /%
Curve
0 0． 35 12 88 －
0． 5 0． 35 12 88 6
0． 8 0． 35 20 80 6
3． 0 0． 35 25 75 6
4． 0 0． 35 90 10 6
5． 0 0． 35 12 88 1
1． 7 质谱条件 采用电喷雾电离源( ESI) ，毛细管
电离电压: 3 kV，离子源温度: 120 ℃ ;喷雾气与反吹
气:氮气，去溶剂气流速: 650 L·h －1，扫描方式为选
择性离子监测( SIＲ) ，原儿茶酸等 3 种成分及内标
用于定量分析的监测离子，见 Tab 2。
Tab 2 Three components mass spectrometric conditions
Components
Mass spectrometric conditions
Parent( m/z) Cone( V) ES
protocatechuic acid 153． 0 30 －
kaempferol-3-O-β-D-glucoside 449． 3 40 +
quercitrin 449． 2 20 +
puerarin 417． 2 30 +
1． 8 血浆样品处理方法 取大鼠血浆 100 μL，置
1. 5 mL塑料离心管中，补加 50 μL甲醇，依次加入 2
mg·L －1内标溶液 20 μL，50 μL 1%甲酸，400 μL
甲醇，涡混 1 min，超声 5 min，离心 10 min ( 4℃、
15 000r·min －1 ) ，取上清液置离心管中，48 ℃下氮
气吹干，残留物加 500 μL甲醇复溶，超声 10 min，涡
混 1 min，离心 10 min( 4 ℃、15 000 r·min －1 ) ，取上
清液 48 ℃下氮气吹干，残留物 200 μL 初始流动相
溶解，取上清液进样 UPLC-MS分析。
1． 9 实验方案与样品检测 健康 Wistar大鼠 6 只，
♀♂兼用，体质量为 ( 230 ± 20 ) g，给药剂量分别为
2． 5 g·kg －1，给药前 12 h 禁食，自由饮水。口服灌
胃荭草花提取物溶液。于给药后 5、10、15、30、60
min，2 h、3 h、5 h、7 h、9 h、12 h、24 h、36 h经尾静脉
取血约 0. 4 mL置涂有肝素的塑料离心管中，4 500 r
·min －1离心 8 min，分离血浆于 － 20 ℃冰箱中保
存，直至分析。
2 结果
·5131·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2015 Sep; 31( 9)
2． 1 UPLC-MS分析方法的确证
2． 1． 1 专属性 在其选定的色谱条件和质谱条件
下原儿茶酸、山柰素 －葡萄糖苷、槲皮苷 3 种物质及
内标葛根素监测离子反应分别为 m/z 153. 0、m/z
449. 3、m/z 449. 2、m/z 417. 2。空白血浆、空白血浆
外加原儿茶酸等 3 种物质和内标以及大鼠给药后血
浆样品色谱图，原儿茶酸等 3 种物质及内标的保留
时间分别为 ( 1. 25、2. 70、2. 78 和 1. 73 min) ，各成
分间分离良好，未见血浆中杂质干扰。
Fig 1 Typical UPLC-MS chromatograms of rat blank plasma ( A ) ;
blank plasma spiked with three components and IS ( B) ; the rat plasma
sample collected at 30 min after i． g of 2． 5 g·kg －1 of the flower of Poly-
gonumorientale L． extract to rat ( C) ; 1． protocatechuie acid; 2． puerarin
( IS) ; 3． kaempferol-3-O-β-D-glucoside; 4． quercitrin
2． 1． 2 线性范围和灵敏度 取大鼠空白血浆 100
μL，依次加入混合标准溶液 50 μL，配制成相当于大
鼠血浆药物浓度为见 Tab 3，按“1. 8 血浆样品处理
方法”项下操作，建立标准曲线。以待测物的峰面
积与内标峰面积之比( A /Ai) 为纵坐标 Y，各物质浓
度( C) 为横坐标 X进行直线回归，权重系数为 1 /X，
求的直线方程，即为标准曲线。大鼠血浆中原儿茶
酸等 3 种成分在其线性范围内线性关系良好，各成
分标准曲线相关系数( r) 均大于 0. 99。典型大鼠标
准曲线和线性范围见 Tab 4。
Tab 3 Concentrations of the four standard
calibration samples( μg·L －1 )
Serial
number
Components
Protocatechuie
acid
Kaempferol-3-O-
β-D-glucoside
Quercitrin
1 2． 74 0． 69 0． 82
2 8． 23 2． 07 2． 47
3 24． 7 6． 22 7． 41
4 74． 11 18． 67 22． 22
5 222． 33 56 66． 67
6 667 168 200
Tab 4 Mean values of regression equation of the analytes in rat plasma
Name Equation r2
Linear range /
μg·L － 1
protocatechuie acid Y^1 = 1． 471 × 10 － 5X + 1． 830 × 10 － 1 0． 997 74 ～ 677
kaempferol-3-O-β-D-glucoside Y^2 = 1． 799 × 10 － 5X + 3． 320 × 10 － 2 0． 998 0． 69 ～ 186
quercitrin Y^3 = 1． 131 × 10 － 5X + 3． 780 × 10 － 2 0． 998 0． 82 ～ 200
2． 1． 3 准确度和精密度按 “2． 1． 2 标准曲线”项下
分别配制 3种成分大鼠血浆高、中、低 3 个浓度的质
量控制样品( QC) ，按“1. 8 血浆样品处理方法”项下
平行操作，每个浓度进行 6 样本分析，日内连续进样，
并与标准曲线同时进行。每个系列浓度做 6 份，计算
日内精密度; 3 种浓度连续测定 5 d，计算日间精密
度。结果表明原儿茶酸等 3 种成分日内和日间精密
度 ＲSD( % ) 均小于 20 %，准确度范围为 88. 28% ～
109. 51%，提示该方法准确、可靠、重现性好。
2． 1． 4 提取回收率 取大鼠空白血浆 100 μL，按
“2． 1． 2 标准曲线”项下分别配制 3 种成分的大鼠血
浆低、中、高 3 个浓度的质量控制样品( QC) ，每个浓
度进行 6 样本分析，以 200 μL 初始流动相溶解，记
录其峰面积。另取空白血浆，按“1． 8 血浆样品处理
方法”项下操作。离心后获得上清液，加入与上述
相应浓度的标准溶液( 每个浓度进行 6 样本分析) ，
于 48 ℃氮气吹干，以 200 μL初始流动相溶解，获得
相应峰面积值。以每一浓度的两种处理方法的峰面
积比值计算提取回收率，对原儿茶酸等 3 种成分线
性范围内高、中、低 3 个浓度的血浆样品提取回收率
进行了考察。结果表明原儿茶酸等 3 种成分的回收
率分别为: 104. 55 % ～ 107. 45 %、92. 45 % ～
100. 82 %、93. 36 % ～97. 39 %，提示该方法可行。
2． 1． 5 稳定性考察 按“2． 1． 2 标准曲线”项下分
别配制原儿茶酸等 3 种成分的大鼠血浆低、中、高 3
个浓度的质量控制样品( QC) ，样品处理后至自动进
样器中，在 6 h 分别进样，以每一浓度 3 样本分析。
结果表明原儿茶酸等 3 种成分的处理后血浆样品在
自动进样器中 6 h均稳定。同法配制低、中、高 3 个
浓度血浆样品( QC) ，分别在室温( 约 20℃ ) 下放置
6 h，4 ℃下冷藏 8 h，冻融 3 次，经处理后进样测定浓
度，以每一浓度 3 样本分析。结果表明，3 种成分血
浆样品在室温下放置 6 h，4 ℃下冷藏 8 h 和经 3 次
冻融循环均很稳定。
2． 2 大鼠给药后血浆浓度及药物动力学参数 大
鼠口服荭草花提取物后，原儿茶酸等 3 种物质的浓
度测定结果见 Tab 5，平均血药浓度 －时间曲线( Fig
2) 。采用 DAS2. 0 软件计算药动学参数并对药物在
大鼠体内的动力学过程进行房室模型拟合并计算其
相关药动学参数见 Tab 6。
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Tab 5 Mean plasma concentrations ( μg·L －1 ) of three
components after i． g of 2． 5 g·kg －1 of the flower of
Polygonumorientale L． extract to rat ( 珋x ± s，n = 6)
Time /h
Protocatechuie
acid
Kaempferol-3-O-
β-D-glucoside
Quercitrin
0． 083 154． 12 ± 132． 75 6． 30 ± 1． 69 45． 23 ± 18． 38
0． 17 257． 70 ± 190． 98 8． 61 ± 4． 53 48． 19 ± 22． 58
0． 25 361． 04 ± 259． 28 13． 15 ± 9． 87 90． 64 ± 68． 22
0． 5 386． 29 ± 114． 37 13． 73 ± 6． 43 98． 02 ± 46． 88
1 263． 71 ± 45． 90 10． 31 ± 3． 80 73． 22 ± 31． 43
2 193． 35 ± 47． 23 5． 35 ± 2． 17 39． 96 ± 4． 82
3 126． 57 ± 69． 20 5． 20 ± 0． 71 42． 82 ± 10． 66
5 39． 04 ± 20． 73 4． 24 ± 2． 14 39． 61 ± 9． 08
7 15． 97 ± 10． 86 2． 23 ± 1． 47 33． 66 ± 22． 21
9 5． 82 ± 7． 49 3． 07 ± 3． 31 35． 92 ± 27． 74
12 2． 15 ± 1． 08 3． 38 ± 2． 88 38． 47 ± 20． 80
24 3． 90 ± 1． 77 1． 66 ± 1． 48 19． 70 ± 8． 02
36 5． 11 ± 2． 36 2． 30 ± 2． 83 16． 80 ± 15． 29
Tab 6 Pharmacokinetic parameters of three components
afteri． g of 2． 5 g·kg －1 of the flower of
Polygonumorientale L． extract to rat ( n = 6)
Parameter
Components
Protocatechuie
acid
Kaempferol-3-O-
β-D-glucoside
Quercitrin
AUC( 0 － t) /μg·L －1·h 1181． 20 ±418． 70 105． 20 ±54． 32 1327． 30 ±677． 20
AUC( 0 －∞ ) /μg·L
－1·h 1373． 30 ±624． 60 287． 20 ±423． 39 1624． 80 ±710． 50
MＲT( 0 － t) /h 4． 73 ±1． 15 10． 53 ±4． 98 13． 47 ±2． 42
MＲT( 0 －∞ ) /h 13． 11 ±9． 97 46． 20 ±78． 74 21． 38 ±10． 72
Tmax /h 0． 46 ±0． 1 0． 79 ±0． 33 2． 63 ±4． 6
Cmax /μg·L －1 463． 8 ±207． 81 18． 53 ±7． 82 137． 38 ±71． 09
CLz /F /L·h －1·kg －1 20． 88 ±16． 23 32． 11 ±53． 62 13． 47 ±4． 90
Vz /F /L·kg －1 2083． 40 ±733． 60 25582． 20 ±18379 1751． 40 ±602． 70
T 1
2
/h 8． 33 ±2． 91 13． 70 ±3． 38 12． 01 ±2． 84
3 讨论
生物样品检测方法的建立和验证是整个药代动
力学研究的基础，由于进行药代动力学研究的生物
样品存在浓度较低，基质环境复杂等难题，因此，如
何建立快速有效、灵敏可靠的生物样品分析方法将
是本课题拟解决的关键问题之一，以实现高通量生
物样品分析过程，满足药代动力学研究大样本量的
要求［4］。
实验中对流动相进行了考察，发现使用乙腈比
甲醇各物质的峰形较好。待测成分基本大多是黄酮
类的成分，在实验中有机相和水相均加入了 0． 1%
的甲酸，甲酸的加入可以有利于它们以游离状态存
在。同时实验最开始用的是 Waters C18 ( 2. 1 mm ×
50 mm) 的色谱柱，分离效果不理想，山奈素 －葡萄
糖苷与槲皮苷的分离难度较大，后用 2. 1 mm × 100
mm的色谱柱进行替换，两者能得到较好的分离。
实验中发现采用负离子检测模式线性不理想，可能
Fig 2 Concentration-time profiles of three components after i． g of
2. 5 g·kg －1 of the flower of Polygonumorientale L． extract to rat ( n
=6)
是管道中存留的磷酸的影响，最后 3 种黄酮类成分
选择正离子检测模式，酚酸类的原儿茶酸选择负离
子检测模式，结果良好。
被测成分原儿茶酸、山奈素 －葡萄糖苷和槲皮
苷均为极性较大的弱酸性化合物，在酸性条件下处
于非解离状态，有利于被测成分的提取。因此我们
对在血浆样品处理中是否加酸及加酸的种类进行了
考察，实验结果表明，加酸后明显有利于被测成分的
提取;同时不同的酸( 甲酸、盐酸、磷酸) 对其提取效
·7131·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2015 Sep; 31( 9)
率也不同，其中甲酸的效果最好，因此我们在样品处
理时加入了 50 μL 1%甲酸［5 － 7］。
( 致谢:本实验在贵州省药物制剂重点实验室和民族药
与中药开发应用教育部工程研究中心联合完成。真诚感谢
贵州省药物制剂重点实验室和民族药与中药开发应用教育
部工程研究中心为本实验开展提供相关实验耗材与仪器设
备。真诚感谢实验室各位同事、老师在实验中给予我的指导
与帮助。)
参考文献:
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Pharmacokinetics of three index components in flower of
Polygonumorientale L． in rat plasma by UPLC-MS
HUANG Yong1，3，HU Jie1，LU Yuan1，3，ZHENG Lin1，3，LAN Yan-yu2，3，LI Yong-jun2，3
( 1． Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics，School of Pharmacy，Guiyang Medical University，Guiyang 550004，China;
2． Engineering Ｒesearch Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM ( Ministry of Education) ，
Guiyang Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China; 3． School of Pharmacy，
Guiyang Medical University，Guiyang 550004，China)
Abstract: Aims To establish a UPLC-MS method for
quantifying protocatechuie acid，kaempferol-3-O-β-D-
glucoside and quercitrin and to investigate the pharma-
cokinetics of three indix components in flower of Poly-
gonumorientale L． in rat plasma． Methods The anal-
ysis was achieved by BEH C18 column ( 2. 1 mm × 100
mm，1. 7 μm) with a mobile phase composed of 0. 1%
formic acid using step gradient elution． A TQD tandem
mass spectrometry equipped with electrospray ionization
source was used as detector and operated by selected
ion recording ( SIＲ ) mode． Ｒesults In the selected
linear range，calibration curves of the three markers
components showed good linearity． Extraction recovery
rate，precision，accuracy and stability reached the de-
termination request． The parameters of Tmax ( h ) in
three index components were 0. 46 ± 0. 1，0. 79 ± 0. 33
and 2. 63 ± 4. 6，respectively; Cmax ( μg·L
－1 ) in three
index components were 463. 8 ± 207. 81，18. 53 ± 7. 82
and 137. 38 ± 71. 09，respectively． Conclusion The
fully validated UPLC-MS method has been successfully
applied to the pharmacokinetic study of the three index
components in flower of Polygonumorientale L． in rat
plasma．
Key words: flower of Polygonumorientale L． ; rat; UP-
LC-MS; protocatechuie acid; kaempferol-3-O-β-D-glu-
coside; quercitrin; pharmacokinetics
·8131· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2015 Sep; 31( 9)