全 文 ：*通信作者
收稿日期:2006 - 01 - 27;修回日期:2006 - 04 - 28
基金项目:国家“ 973”计划资助项目(2001CB108905);国家
“ 863”计划资助项目(2001AA241164);安徽省教育厅资助项目
(2006KJ205B)
作者简介:何庆元(1978 -), 男 ,安徽宿松人 , 讲师 ,硕士 , 2004
年 6月毕业于西南农业大学 ,从事固氮研究 ,已发表论文 5篇.
文章编号:1673-5021(2006)04-0079-05
不同苜蓿—根瘤菌结瘤固氮能力变异的研究
何庆元1 , 2 , 玉永雄2 , * , 胡　艳2
(1. 安徽科技学院生命科学学院 , 安徽　凤阳　233100;2. 西南农业大学牧草与草食家畜重点实验室 ,重庆　400716)
　　摘要:从新疆 、重庆和北京 3 个地区收集了 7 株苜蓿 ,从每株苜蓿上分离和纯化出 1 个根瘤菌菌株。通过抗生素
筛选 ,得到了抗链霉素 、新霉素 、壮观霉素和卡那霉素的菌株 4 个 , 分别是 H Sm r 、ANeo r、Ⅰ Spr 和 XKm r 。 4 个菌株
和 7 个苜蓿品种做竞争结瘤实验和固氮能力实验结果表明:根瘤菌的竞争结瘤能力是根瘤菌本身的遗传因素和它
长期所处的生态环境共进化的结果。几个菌株同时接种时 , 双感染或多感染普遍发生 , 并且双感染或多感染发生率
受到多种因素的作用 ,培养条件 、苜蓿品种 、根瘤菌菌株以及培养条件与苜蓿品种相互作用都影响其发生率。苜蓿
的固氮能力受到菌株 、苜蓿品种以及两者相互作用的影响。菌株 XKm r 竞争结瘤能力最差 , 但固氮能力最强。
关键词:苜蓿根瘤菌;苜蓿品种;培养条件;结瘤;双感染;固氮能力
中图分类号:S144. 3　　　文献标识码:A
　　农业生产早已证明根瘤菌接种是豆科作物 、牧草
增产的一项农业措施 ,但成功接种并非易事。特别是
在多年种植豆科植物的土壤上 ,其效果往往不太理想。
研究表明 ,接种效果不佳的原因是土壤中含有大量固
氮效率差的土著根瘤菌群体 ,干扰和降低了高效商品
接种剂的占瘤率[ 1 , 2] 。随着畜牧业的迅猛发展 ,紫花苜
蓿的种植范围不断扩大 ,特别是近年来南方紫花苜蓿
引种与新品种的培育成功 ,其栽培区域进一步扩大 ,苜
蓿根瘤菌与宿主不断分化出适应各种环境条件的生态
型。不同生态环境来源的根瘤菌遗传特性 ,不同生态
环境来源的寄主品种以及所生长的环境条件在根瘤菌
竞争结瘤能力的影响中所处的地位以及这些因素是否
影响双感染的发生率 ,菌株的竞争能力和固氮能力是
否存在内在联系的研究 ,将为筛选高效 、具有强竞争能
力的根瘤菌提供理论依据。
1　材料和方法
1. 1　材料
本实验收集了不同生态条件下的苜蓿 7株 ,并
从这 7株苜蓿上分别分离了 7种根瘤菌菌株 ,见表
1。先将 8目石英砂用自来水冲洗干净 ,用 0. 1%的
盐酸浸泡 3h 以上 ,再用自来水冲洗至中性 ,用烘箱
烘干 ,然后将石英砂装满培养瓶(Ф =5. 5cm , h =
9. 5cm 的广口瓶),同时 ,加入 50m l蒸馏水 ,用塑料
薄膜密封后在 121℃下高温灭菌 1h;在封口膜上开
三个孔 ,将从不同品种苜蓿上取回的枝条剪成一叶
一心的插条 ,常规表面灭菌后 ,在每个培养瓶中插入
两个插条 ,在室温下培育 15d ,生根 ,成苗 。从不同
生态区的 1株苜蓿植株上取下 1 个大的粉红色根
瘤 ,按文献经划线分离并纯化得到根瘤菌纯培养[ 3] 。
表 1　苜蓿品种 、相应根瘤菌简称以及其来源地区
Table 1　Alfalfa varieties、 correspinding
rhizobium abbreviation and source of local
苜蓿品种
Alfalf a va rieties
苜蓿简称
Alfalfa abbreviation
根瘤菌简称
Rhizobium abbreviation
来源地区
Source o f lo cal
耐酸品种(阿尔冈金) MA A 重庆
耐湿品种(四季旺) MH H 重庆
西农 1号 M C C 重庆
当地野生苜蓿 M X X 新疆
新牧 1号 M Ⅰ Ⅰ 新疆
新牧 2号 MⅡ Ⅱ 新疆
盛世 M B B 北京
1. 2　抗药菌株的标记
将各菌株分别接种到不同浓度的抗生素:硫酸
链霉素(Sm)20μg /m l 、30μg /m l 、40μg /ml , 新霉素
(Neo)10μg /ml 、20μg /m l、30μg /m l ,硫酸壮观霉素
(Sp)100μg /ml 、200μg /ml 、300μg /ml , 硫酸卡那霉
素(Km)30μg /m l 、50μg /ml 、70μg /ml ,氯霉素(Cm)
—79—
第 28 卷　第 4 期　　　　　　　　　　中　国　草　地　学　报　　　　　　　　　　2006 年 7 月
Vo l. 28　No. 4　 　　　　　　　　　Chine se Journal o f Grassland　　　　　　　 　　　Jul. 2006
200μg /ml 、300μg /m l 、400μg /m l ,氨苄青霉素(Ap)
300μg /ml 、400μg /m l 、500μg /ml , 四环素 (Tc) 5
μg /m l 、10μg /ml 、15μg /ml平板上 ,选对菌株最不敏
感的抗生素标记该菌株。7个野生型菌株 A 、H 、C 、
X 、Ⅰ 、Ⅱ、B 液体培养基中(28℃、110r /min 、暗室)
培养 50h后 ,分别加入相应的抗生素 ,使菌液中的抗
生素浓度分别达到:Neo 25μg /ml 、Sm 50μg /ml 、A p
400μg /ml 、Sp 300μg /ml 、Km 60μg /ml 、Tc 5μg /ml
和Cm 350μg /ml;继续培养 3d 后 ,依次接种到含有
如下抗生素浓度 Neo 40μg /ml 、Sm 80μg /m l 、A p
700μg /ml 、 Sp 500μg /ml 、 Km 100μg /ml 、 Tc 10
μg /m l和 Cm 600μg /ml的固体培养基中。
1. 3　竞争结瘤实验
本研究为三因子(根瘤菌菌株 、苜蓿品种和培养
条件)试验 。紫花苜蓿品种 7个 ,分别是:MA 、MH 、
MC 、MX 、MⅠ、MⅡ、MB;培养条件 4个 ,分别是:(1)
常规培养条件 ,加入改良的 Broughton - Dilw o rth
无氮植物营养液[ 4] (以下简称 BD 液), 使 pH 为
6. 5 ,并保持瓶中水的高度 1 ～ 2cm ;(2)酸性培养条
件 ,使pH 为 5. 5 ,保持瓶中水的高度 1 ～ 2cm ;(3)干
旱培养条件 ,使 pH 为 6. 5 ,清晨有 1片叶子微微卷
曲时加 BD 液;(4)高湿培养条件 ,使 pH 为 6. 5 ,保
持瓶中水的高度在 9cm 以上。试验共 28个处理 ,
重复 6次 ,每瓶种植苜蓿 2株 ,共 168瓶 。
4个根瘤菌菌株分别在酵母甘露醇液体培养
基(YMB)中培养 4d ,用灭菌水将 4个根瘤菌液的
密度调至 108 个细菌 /ml ,按 1∶1∶1∶1的比例混
合成根瘤菌混合液 , 每瓶接种 2ml混合悬液 。在
白天 28℃、晚上 22℃,光 /暗为 14 /10h ,光照强度
3800lux 的条件下培养 40d后收获。从每瓶中取 1
株苜蓿 ,摘下 5个根瘤 ,按如下方法鉴定侵染各根
瘤的菌株:根瘤经表面灭菌后 , 每个根瘤单独压
碎 ,将同一根瘤的汁液分别接种到酵母甘露醇固
体培养基(YMA)、YMA+Sm(80μg /ml)、YMA+
Neo(40μg /ml)、YMA +Sp(500μg /m l )、YMA +
Km(100μg /ml)五种不同平板上 。在 28℃的暗室
中培养 8d ,只有被抗药菌株感染的根瘤才能在相
应的抗生素平板上长出菌落 ,用 SPSS 软件进行统
计分析 。
1. 4　固氮能力试验
本研究为两因子(苜蓿品种和根瘤菌菌株)试
验。紫花苜蓿品种 、根瘤菌菌株的种类和菌液的
浓度与竞争结瘤试验相同 ,不同苜蓿品种单独接
种各菌液 ,每瓶接种 2m l。 28 个处理 ,重复 6 次 ,
共 168 瓶 ,每瓶种植苜蓿 2 株。在白天 28℃、晚上
22℃,光照强度3800lux ,光照周期光 /暗为 14/10h ,常
规条件下无氮培养 40d 后收获 。在 80℃下烘干至
恒重 ,称量植株总干重 ,用 SPSS 软件进行统计分
析。
2　结果与分析
2. 1　抗药菌株的获得
7个菌株在不同抗生素平板上的耐药性见表 2。
用菌株最不敏感的抗生素来标记该菌株 ,获得了 A 、
H 、X 和 Ⅰ 的耐药性标记菌株 , 依次是 ANeor 、
HSmr 、XKm r 和ⅠSp r(表 2)。
2. 2　不同生态区苜蓿根瘤菌竞争结瘤能力的变异
对不同培养条件下不同苜蓿品种上各根瘤菌菌
株的占瘤率方差分析表明 ,不同根瘤菌菌株的占瘤
率存在显著差异(表 3), ⅠSp r的占瘤率最高 ,XKmr
的竞争能力最弱 ,并显著小于其它三个菌株;这表明
苜蓿根瘤菌本身的遗传地位对其竞争结瘤能力具有
显著性影响。
2. 3　不同生态区苜蓿根瘤菌的双感染或多感染发
生率的变异
双感染或多感染指在多个根瘤菌混合接种时 ,
两个或两个以上的菌株同时侵染一个根瘤的现象;
发生率是各菌株在根瘤上发生双感染或多感染的根
瘤数占总检测根瘤数的百分率。对不同生态区苜蓿
根瘤菌双感染或多感染发生率的方差分析表明 ,根
瘤菌的双感染或多感染发生率受到根瘤菌菌株 、苜
蓿品种 、培养条件以及培养条件与苜蓿品种相互作
用的影响 。
2. 3. 1　根瘤菌菌株对双感染或多感染的影响
从表 3中可以看出 ,双感染或多感染发生率最
高的是 ANeor 并显著大于其它三个菌株 ,双感染或
多感染的发生率和根瘤菌的竞争结瘤能力没有直接
相关性。
2. 3. 2　苜蓿品种对双感染或多感染的影响
从表 4可以看出 ,南方品种的苜蓿上根瘤菌的
双感染或多感染的发生率比北方品种高 ,并且 MH
显著高于 MC 、M Ⅱ、M Ⅰ 、MB 、MX;这可能是因为
适应逆境的苜蓿品种产生了更多种类的类黄酮物质
使两个或两个以上的根瘤菌菌种同时进入了同一个
根瘤内。
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中国草地学报　2006年　第 28 卷　第 4 期
表 2　野生菌株的耐药性
Table 2　Endurance antibiotic ability of wild strains
抗生素 Ant ibiot ic 浓度 Concent ration(μg /ml) H A Ⅰ X B C Ⅱ
Sm(硫酸链霉素) 20 + + + - + - +
30 + - - - - - -
40 - - - - - - -
Neo(硫酸新霉素) 10 + + + + + + +
20 - + + + + + -
30 - - - - - - -
Sp(壮观霉素) 100 + + + + + + +
200 - - + - - - -
300 - - - - - - -
Km(硫酸卡那霉素) 30 + + + + + + -
50 - - + + + - -
70 - - - + - - -
Cm(氯霉素) 200 + + + + + + +
300 - - - - + - +
400 - - - - - - -
Ap(氨苄青霉素) 300 + + + + + + +
400 + + - + - + +
500 - - - - - - -
Tc(四环素) 5 - - - - - - -
10 - - - - - - -
15 - - - - - - -
　　注:“ +”表示能正常长出菌落, “ -”表示不能正常长出菌落。
Note:“ +” indicate normal grow th of bacterial colony , “ -” indicate ab normal g row th of bacterial colony.
表 3　各根瘤菌菌株占瘤率及双感染或多感染发生率的多重比较
Table 3　Multiple comparison of occupancy nodulation
percent of and double or among infectious different strains
根瘤菌菌株
Rhizobi um strains
占瘤率(%)
Occupancy nodulation percent
双感染或多感染发生率(%)
Double and among infectious incidence
ⅠSpr 39. 4a 11. 7bc
HSm r 36. 2ab 10. 8c
ANeo r 31. 5b 16. 7a
XKm r 19. 3c 12. 5b
　　注:不同字母表示 P<0. 05差异显著。
No te:The different letters indicate significance at P <0. 05 level.
表 4　各苜蓿品种上双感染或多感染发生率的多重比较
Table 4　Multiple comparison of double or among
infectious incidence of different alfalfa varieties
苜蓿品种
A lfalfa varieties
双感染或多感染发生率(%)
Double or among infectious incidence
差异显著性
Significance
M H 20. 2 a
MA 15. 6 ab
MC 15. 2 b
MⅡ 14. 0 b
M Ⅰ 12. 9 b
MB 12. 9 b
MX 11. 9 b
2. 3. 3　培养条件对双感染或多感染的影响
从表 5可以看出 ,逆境条件可以增加双感染或
多感染的发生率 ,特别是高湿和干旱条件下 ,显著比
常规条件下的双感染或多感染的发生率要高 ,逆境
增加其发生率的原因可能是逆境降低了细胞膜的通
透性 ,使根瘤菌能同时进入细胞内。
表 5　不同培养条件下双感染或多感染发生率的多重比较
Table 5　Multiple comparison of double or among
infectious incidence in different culture condition
培养条件
Cult ure condi tion
双感染或多感染发生率
Double o r among infe ctious incidence
差异显著性
Significance
高湿 17. 3 a
干旱 16. 4 ab
酸性 13. 5 bc
常规 11. 5 c
2. 3. 4　培养条件和苜蓿品种的互作对双感染或多
感染发生率的影响
从 图 1可以看出 ,在高湿条件下MH 上双感染或
多感染发生率最高 ,常规条件下MB上的最小。
2. 4　不同根瘤菌的固氮能力
目前 ,对固氮能力的研究有三种方法 ,即乙炔还
原法 、N -差异法和15N同位素稀释法 ,在无氮培养
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何庆元　玉永雄　胡　艳　　不同苜蓿—根瘤菌结瘤固氮能力变异的研究
图 1　不同培养条件下不同苜蓿上的双感染或多感染的发生率
Fig. 1　Double o r among infectious incidence of different alfa lfa va rieties in different culture conditions
条件下 ,苜蓿干物质的增长量与氮的增长量高度正
相关 。也有研究表明 ,在无氮培养条件下 ,苜蓿的总
干重与根瘤的固氮能力高度相关 ,因此我们可以用
总干重作为指标来衡量固氮能力[ 5] 。不同苜蓿品种
接种不同根瘤菌的干物质产量见表 6 ,方差分析表
明 ,苜蓿品种 、根瘤菌菌株以及苜蓿品种和根瘤菌菌
株相互作用都显著影响苜蓿的固氮能力 ,这与以往
的研究结论是相一致的[ 6] 。
表 6　不同苜蓿品种与根瘤菌菌株组合平均总干草重 (mg /株)
Table 6　Average DM of different alfalfa varieties with inoculated different strains(units:mg /plant)
根瘤菌菌株 Rhizobium s t rains MC M B MA MH M Ⅰ M Ⅱ MX 平均
ANeo r 127. 7b 50. 2d 35. 5e 68. 2d 64. 0d 52. 0d 95. 8c 70. 5a
H Sm r 109. 1b 44. 7d 27. 3e 79. 5c 76. 0b 79. 7c 74. 8c 70. 2a
XKm r 110. 3b 63. 2d 42. 8d 71. 8c 120. 7b 102. 3b 94. 2c 86. 5b
ⅠSpr 180. 0a 40. 5e 52. 7d 84. 8c 57. 3d 63. 0d 65. 7d 77. 7 ab
平均 131. 8c 49. 6a 39. 6a 76. 1b 79. 5b 74. 3b 82. 6b
3　结论与讨论
3. 1　不同生态区来源苜蓿根瘤菌的竞争结瘤能力
不同 ,其基因型能够决定根瘤菌的竞争结瘤能力。
3. 2　两个或两个以上的苜蓿根瘤菌同时接种同一
株苜蓿时 ,双感染或多感染普遍发生。以往的研究
表明 ,苜蓿同时接种两个有效菌株 ,其产量高于苜蓿
接种这两个中的任一菌株[ 7] ,这和双感染是否存在
一定的相关性需做进一步的研究 。逆境条件能够提
高双感染或多感染的发生率 ,这和杨江科等的结论
相一致[ 8] 。双感染或多感染受到多重因素的影响 ,
但这些因素是如何影响其发生值得进一步探讨。
3. 3　根瘤菌的固氮能力受到苜蓿品种 、根瘤菌以及
两者的相互作用的影响;比较根瘤菌的固氮能力和
竞争能力发现 ,固氮能力最强的菌株 XKmr ,它的竞
争结瘤能力最弱 ,可能是根瘤菌所携带的固氮能力
—82—
中国草地学报　2006年　第 28 卷　第 4 期
基因和竞争结瘤基因是连锁在一起的;这必然使高
效菌株的筛选工作更加困难。
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Study on Variation of Nodulation and Nitrogen Fixing
Capacity of Different Rhizobium meliloti
HE Qing-yuan1 , 2 , YU Yong-xiong2 , HU Yan2
(1. Li fe S cience Col lege o f Anhui Science and Technology Universi ty , Fengyang 233100 ,China;
2.Key Laboratory of Forage and Herbivore , Southwest Agricultural University , Chongqing 400716 ,China)
Abstract:Seven individual plants o f alfalfa w ere collected f rom Xinjiang , Chongqing and Beijing , a rhizobi-
um strain w as isolated and purified f rom each plant. HSm r , ANeo r , ⅠSpr and XKmr of endurance antibio t-
ic st rains w ere obtained. Seven varie ties of alfalfa w ere obtained from the se plants by clonal breeded. Abil-
i ty of competitive nodulation and fixation ni trog en w ere studied by hereinbefo re describing materials. Re-
sult show ed that competit iveness of rhizobial st rains had been af fected by rhizobial genotypes and envi ron-
ment , bo th infect ion generally o ccur red when the same plant w as inoculated w ith a mixture of st rains.
Their f requency w as af fected by cul tivated condi tions , varieties of alfalfa , rhizobial geno types and reciproc-
i ty of cul tivated condi tions and varieties of alfalfa. Abili ty of ni tro gen fix ation w as af fected rhizobial geno-
ty pes , varieties of alfalfa and their reciproci ty. XKm r was the poo rest at competi tiveness , but i t has the
st rongest ability of ni tro gen fix ation.
Key words:Rhizobium meli lot i;Alfalfa varie ties;Culture condit ion;Nodula tion;Double infect ious;Ni-
t rogen f ixing capaci ty
【责任编辑　胡卉芳】
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何庆元　玉永雄　胡　艳　　不同苜蓿—根瘤菌结瘤固氮能力变异的研究