全 文 ：３２卷０５期
Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．０５
草　业　科　学
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ
７１１－７１８
０５／２０１５
ＤＯＩ：１０．１１８２９＼ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－０６２９．２０１４－０４９１
张淑卿，李剑峰，陈力玉，师尚礼，苗阳阳．苜蓿根瘤菌ｃｆｐ荧光标记株的构建及筛选方法［Ｊ］．草业科学，２０１５，３２（５）：７１１－７１８．
ＺＨＡＮＧ　Ｓｈｕ－ｑｉｎｇ，ＬＩ　Ｊｉａｎ－ｆｅｎｇ，ＣＨＥＮ　ＬＩ－ｙｕ，ＳＨＩ　Ｓｈａｎｇ－ｌｉ，ＭＩＡＯ　Ｙａｎｇ－ｙａｎｇ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎ　ｏｆ　Ｃｙａｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌａｂｅｌｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ｒｈｉｚｏｂｉａ［Ｊ］．Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５，３２（５）：
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７１１－７１８．
植物
生产层
苜蓿根瘤菌ｃｆｐ荧光标记株的　　
构建及筛选方法　　
张淑卿１，２，李剑峰２，陈力玉３，４，师尚礼３，苗阳阳３
（１．贵州师范学院 地理与旅游学院，贵州 贵阳５５００１８；
２．贵州师范学院 喀斯特生境土壤与环境生物修复研究所，贵州 贵阳５５００１８；
３．甘肃农业大学 草业生态系统教育部重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；４．中国草学会，北京１００１９３）
摘要：荧光标记根瘤菌在研究根瘤菌侵染宿主形成结瘤时具有良好的示踪效果。本研究以辅助菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ　ｐＲＫ２０７３，受体菌苜蓿中华根瘤菌Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１和苜蓿根瘤菌Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５，及
ｃｆｐ青色荧光基因供体菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＭＰ４５１７９为供试菌株，以三亲本杂交法进行结合转导，并以无氮培养基和ＴＹ
培养基对标记菌株进行荧光表达及固氮特性的遗传稳定性检测，再对初选菌株以甘农５号紫花苜蓿为宿主进行
回接验证，测定了回接植株的生物量，结瘤数和标记菌的占瘤率等指标。结果表明，１）三亲本杂交转导法适用于
苜蓿根瘤菌ｃｆｐ标记菌株的构建，获得大量Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１和Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５的荧光标记株；２）经逐层筛选
获得的荧光标记菌中，Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ６和Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮｆ－ｃｆｐ５遗传稳定性好，荧光表达量高，结瘤促生
能力强；３）与现有抗生素平板分离筛选相比，无氮培养基结合耐药平板筛选能显著提高荧光标记根瘤菌株的甄别
筛选效率；４）三亲本杂交法获得的苜蓿根瘤菌荧光标记株个体间差异较大，对标记株固氮及荧光表达能力遗传稳
定性的验证和对宿主植物的结瘤促生能力的检测是ｃｆｐ荧光标记根瘤菌筛选的必要手段。
关键词：苜蓿根瘤菌；荧光标记；三亲本杂交；菌种筛选；根瘤
中图分类号：Ｓ５５１＋．７０８；Ｓ４３５．４；Ｑ９３９．１１＋４　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００１－０６２９（２０１５）０５－０７１１－
０７＊
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎ　ｏｆ　Ｃｙａｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｌａｂｅｌｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ｒｈｉｚｏｂｉａ
ＺＨＡＮＧ　Ｓｈｕ－ｑｉｎｇ１，２，ＬＩ　Ｊｉａｎ－ｆｅｎｇ２，ＣＨＥＮ　ＬＩ－ｙｕ３，４，ＳＨＩ　Ｓｈａｎｇ－ｌｉ　３，ＭＩＡＯ　Ｙａｎｇ－ｙａｎｇ３
（１．Ｓｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｇｅｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　Ｔｏｕｒｉｓｍ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｃｏｌｅｇｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ　５５００１８，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｓｏｉｌ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　Ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｋａｒｓｔ　ｈａｂｉｔａｔｓ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｃｏｌｅｇｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ　５５００１８，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ　Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｇａｎｓｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ；４．Ｃｈｉｎａ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００１９３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌａｂｅｌｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｂｉａ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｂｏｕｔ　ｔｈｅ
ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ　ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｎｏｄｕｌｅｓ，ａｓ　ｗｅｌ　ａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．
Ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｓｔｕｄｙ，ａｓｓｉｓｔａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｓｔｒａｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｐＲＫ２０７３，ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｓｔｒａｉｎｓ　Ｓｉｎｏ－
ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１ａｎｄ　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５，ａｎｄ　ｄｏｎｏｒ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｓｔｒａｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＭＰ４５１７９ｗｈｉｃｈ
＊ 收稿日期：２０１４－１１－０４　　接受日期：２０１５－０３－１９
基金项目：国家自然科学基金项目（３１３００３８９）；贵州省科学技术基金项目（黔科合Ｊ字［２０１４］２１３６号）；贵州师范学院博士项目
（１４ＢＳ０２０）；贵州环境科学省级特色重点学科专项基金
第一作者：张淑卿（１９８２－），女，甘肃民勤人，副教授，博士，主要从事内生根瘤菌方面的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｍａｒｔｃｌｏｖｅｒ＠ｆｏｘｍａｉｌ．ｃｏｍ
通信作者：师尚礼（１９６２－），男，甘肃会宁人，教授，博士，主要从事牧草种质资源方面的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｉｓｈｌ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．０５） ０５／２０１５
ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｃｙａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｒｉ－ｐａｒｅｎｔａｌ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ
ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｆｉｘａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｓｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ
ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｏｎ　Ｎ－ｆｒｅｅ　ａｎｄ　ＴＹ　ｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｓｔａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｔｏ　ａｌｆａｌｆａ　ｃｖ．
Ｇａｎｎｏｎｇ　Ｎｏ．５ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅｉｒ　ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｒｉ－ｐａｒｅｎｔａｌ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｆｅａ－
ｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｆｐ　ｌａｂｅｌｅｄ　ｒｈｉｚｏｂｉａ　ｓｔａｉｎｓ　ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｃｆｐ　ｌａｂｅｌｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１ａｎｄ　Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５．Ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ６ａｎｄ　Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮｆ－ｃｆｐ５
ｈａｄ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｗｉｔｈ　ｍｏｒｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｅｔｔｅｒ　ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｎ－ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉ－
ｕｍ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｈａｖｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｔｈｅ　ｌａｒｇｅ
ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ　ｅｘｉｓｔｅｄ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅｓｅ　ｌａｂｅｌｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｈｉｃｈ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｉｔ　ｗａｓ　ｎｅｃｅｓｓａｒｙ　ｔｏ　ｃｏｎｆｉｒｍ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｎ－ｆｉｘａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆｏｒ　ｃｆｐ　ｌａｂｅｌｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｍａｒｋｅｒ；ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ｓｔｒａｉｎｓ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｒｏｏｔ　ｎｏｄ－
ｕｌｅｓ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＳＨＩ　Ｓｈａｎｇ－ｌｉ　Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｉｓｈｌ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
　　细菌间ＤＮＡ的转移方式主要有转化、转导、接
合及原生质体的细胞融合。三亲本杂交是基于双亲
本杂交的接合转移，应用较为广泛。青色荧光蛋白
ｃｆｐ是绿色荧光蛋白ｇｆｐ 的突变体，编码基因表达
后不损伤宿主细胞也无需底物，适用于活体检测［１］，
且耗能低，能产生更明亮的蓝－绿色或青色荧光［２］，
用于检测根瘤菌的占瘤率和示踪根瘤菌侵染结瘤，
过程直观、精确而易于操作［３］。凌瑶［４］指出携带
ｃｆｐ基因的质粒适用于构建豌豆（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｒｈｉｚｏ－
ｂｉａ）根瘤菌荧光标记株，且能稳定表达。在接合子
的分离和甄选过程中［５］，目前多以含抗生素选择平
板来分离ｃｆｐ供体菌和荧光标记根瘤菌株。而对
“假接合子”，则以检测结瘤能力，以及根瘤是否发荧
光予以排除［６］，大量标记菌株的甄选验证存在一定
的困难。
为探讨以三亲本杂交法构建苜蓿根瘤菌ｃｆｐ荧
光标记株的可行性和适用性，简化后期筛选验证流
程，提高标记菌株选育效率并获得优良的荧光标记菌
株。本研究拟在三亲本杂交法构建ｃｆｐ荧光标记苜
蓿根瘤菌的基础上，通过抗生素选择平板和无氮培养
基对标记株进行筛选和甄别，对优良菌株进行遗传稳
定性验证和宿主回接鉴定，并通过测定回接植株的生
物量、结瘤特性和发光根瘤的数量探讨优良标记株的
促生能力和荧光表达能力，为苜蓿根瘤菌荧光标记株
的构建，甄选和验证方法的优化和改进提供参考和依
据，并为苜蓿根瘤菌竞争结瘤及菌体在宿主体内的迁
移研究提供优良的标记菌株。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　供试菌株
供体菌株为含ｃｆｐ荧光基因质粒的大肠杆菌
Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐＭＰ４５１７；辅助菌株为大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ－
ｉａ　ｃｏｌｉ　ｐＲＫ２０７３。均由教育部草业生态系统重点实
验室提供。
受体菌株为苜蓿根瘤菌 Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ
ＧＮ５，分离自甘农５号紫花苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ
ｃｖ．Ｇａｎｎｏｎｇ　Ｎｏ．５）种子，由教育部草业生态系统
重点实验室提供，经中科院微生物鉴定与保藏中心
鉴定［６］；苜蓿中华根瘤菌标准菌Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅ－
ｌｉｌｏｔｉ　１２５３１，购自中科院微生物保藏中心［７］。
１．１．２　培养基　ＹＭＡ培养基参照殷爱华和韩素
芬［８］的方法配制，用于根瘤菌的增殖培养。
ＴＹ（Ｙｅａｓｔ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ　Ａｇａｒ）培养基参照袁全
等［９］的方法配制，用于标记菌株荧光表达能力的观
察检测。
ＬＢ（Ｌｕｒｉａ　Ｂｅｒｔａｎｉ）培养基参照胡元森等［１０］的
方法配制，用于供体菌及辅助菌的增殖培养。
ＳＭ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）培养基参照陈力
玉［１１］的方法配制，用于菌体的分离培养。
Ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙ无氮液体培养基参照Ｉｓｌａｍ等［１２］
的方法配制，用于接合子固氮能力的快速检测。
上述培养基均以１２１℃湿热灭菌２６ｍｉｎ。
含抗生素固体培养基的配制：抗生素溶液壮观
２１７
０５／２０１５ 草　业　科　学 （第３２卷０５期）
霉素（Ｓｐｅ）和庆大霉素（Ｇｍ）各０．００５ｇ，各加入１００
ｍＬ去离子水溶解后经０．２２μｍ的无菌滤膜过滤，
制成浓度为５０μｇ·ｍＬ
－１的溶液。待配制的固体培
养基冷却至４０℃左右时加入，制成ＴＹ／ＬＢ／ＳＭ 含
药固体平板。
１．１．３　植物材料　甘农５号紫花苜蓿种子由教育
部草业生态系统重点实验室提供，种子发芽率
９０．６％，净度９８．５％。
１．２　荧光标记根瘤菌的构建及筛选
１．２．１　感受态细胞的制备　参照杨坤等［１３］的方
法，将４℃下保存的受体菌Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５和Ｓ．
ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１转接于 ＹＭＡ固体培养基，２８℃活
化２４ｈ后转接于５０ｍＬ　ＹＭＡ液体培养基。２８℃、
２００ｒ·ｍｉｎ－１振荡培养３～４ｈ，至菌液ＯＤ６００为０．４
时置于盐水冰上预冷，１５ｍｉｎ后将预冷菌液转入已
在－１．５ ℃预冷的５０ｍＬ离心管中，４ ℃、３　０００
ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ，弃去上清液并加入１５ｍＬ预
冷（－１．５℃）的０．１ｍｏｌ·Ｌ－１的无菌ＣａＣｌ２ 溶液，
使菌体重新悬浮后于盐水冰块上处理２０～３０ｍｉｎ
后４℃、３　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ。弃上清液，在
菌体沉淀中加入－１．５℃预冷的０．１ｍｏｌ·Ｌ－１无菌
ＣａＣｌ２ 溶液，振荡至菌体充分悬浮后加入适量预冷
ＣａＣｌ２ 溶液至菌液ＯＤ６００为０．５。
１．２．２　三亲本杂交法荧光标记根瘤菌的构建及筛
选　混合菌体准备：在凌瑶［４］的方法基础上予以改
进，即在含庆大霉素（Ｇｍ）５０μｇ·ｍＬ
－１和壮观霉素
（Ｓｐｅ）５０μｇ·ｍＬ
－１的ＬＢ固体培养基活化供体菌
Ｅ．ｃｏｌｉ　４５１７和辅助菌Ｅ．ｃｏｌｉ　２０７３。２８ ℃培养
１６～１８ｈ，分别转接菌株到含５０μｇ·ｍＬ
－１　Ｇｍ和
５０μｇ·ｍＬ
－１　Ｓｐｅ的ＬＢ液体培养基中，３７℃、１２０
ｒ·ｍｉｎ－１振荡培养至菌体生长对数期（ＯＤ６００ ＝
０．５）。将以上供体菌、辅助菌、受体菌（Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ
ＧＮ５和Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１的感受态细胞）的菌液各
１．５ｍＬ混合，８　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ得到混合
菌体沉淀，弃上清后向沉淀加入１ｍＬ无抗生素ＴＹ
液体培养基，振荡打匀并８　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心５
ｍｉｎ，弃去上清后留混合菌体沉淀。
混合培养：取０．２２μｍ无菌滤膜贴于ＴＹ固体
平板表面，每皿贴３片；取菌体沉淀加１ｍＬ无菌水
打散成浓菌液，在滤膜中央加０．２ｍＬ浓菌液，２８℃
正置２ｈ后倒置培养。２～３ｄ后取已长出培养物的
滤膜置入无菌西林瓶，加５ｍＬ无菌水洗下菌体，再
用无菌水稀释１０倍后取０．２ｍＬ菌液在ＳＭ＋Ｇｍ
固体平板上进行涂抹，２８℃培养７ｄ后在平板上挑
取５０个单菌落，编号后分别点接于无抗生素ＴＹ培
养基和无氮培养基上，２８℃培养至菌落出现（每菌
株３次重复）。在 ＷＦＨ－２０４紫外分析仪３３６ｎｍ下
检测菌落，选择可发青色荧光单菌落的培养物转接
于 Ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙ无氮培养基，无氮平板上能正常生
长的菌株则为荧光标记根瘤菌（接合子）。
１．３　标记根瘤菌的遗传稳定性检测
将筛选得到的Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５和Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ
１２５３１接合子重新编号后接种于不加抗生素的ＴＹ
固体培养基上，２８℃培养２～３ｄ后记为第１代。再
转接至ＴＹ固体斜面培养基２８℃培养，每隔３６ｈ
传代一次，连续转接７次计８代，检测每代菌株形成
单菌落的荧光表达状况并计算荧光质粒的丢失率。
１．４　标记根瘤菌的回接鉴定
参照李剑峰等［１４］的方法以甘农５号紫花苜蓿对
筛选出的荧光标记菌进行回接鉴定。回接试验参照
张志芳和夏叔芳［１５］的方法，采用随机区组设计［１６］进
行盆栽试验，每菌株４次重复，以不接菌的处理为对
照。以单个无菌沙培盆栽作为一次重复、每盆栽内播
种表面灭菌的苜蓿种子４粒，出苗３ｄ后留苗１株。
盆栽标号后加托盘在光照培养室内随机排列摆放，参
照李剑峰等［１４］的方法进行日常管理。处理４５ｄ后测
定植株的生物量、株高、根长、单株结瘤数和根瘤重。
根瘤固氮酶活性测定：参照 Ｈａｒａ等［１７］的方法进
行。测定参数：柱温１７５℃，进样温度１５０℃，ＦＩＤ
１７０℃，进样５０μＬ，每处理３次重复。
标记菌占瘤率的测定：以蒸馏水无损清洗回接
苗根系，无菌水冲洗３～５次，每单株收集全部根瘤，
根瘤表面灭菌后参照张淑卿［１８］的方法用 ＷＦＨ－２０４
紫外分析仪在３３６ｎｍ下检测，产生青色荧光的根
瘤即为荧光标记株侵染形成［１１］。根据以上步骤，逐
步筛选出荧光表达能力强、荧光质粒遗传稳定、占瘤
率高、固氮酶活性高且能使苜蓿植株生物量增加的
荧光标记菌株。
１．５　数据分析
参照 Ｍｕｈａｍｍａｄ等［１９］以ＳＰＳＳ　１３．０统计软件
对数据进行单因素方差分析，用Ｄｕｎｃａｎ法进行数
据的多重比较；采用Ｅｘｃｅｌ　２００７制图。
３１７
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．０５） ０５／２０１５
２　结果与分析
２．１　荧光标记根瘤菌接合子的构建和初选
两种根瘤菌从ＳＭ＋Ｇｍ平板上选出的各５０个
能在ＴＹ培养基上形成菌落的接合子，３３６ｎｍ紫外
光照射下均出现青色荧光（图１）。但Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ
１２５３１菌株的接合子中，８个菌株的３次重复均能在
无氮固体培养基上正常生长（表１），Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ
ＧＮ５的１１个菌株的３次重复能在无氮固体培养基
上正常生长（表２），表明菌株的固氮能力能够稳定
遗传；综合接合子的生长和发光特性，筛选出
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１菌株的８个接合子，Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ
ＧＮ　５菌株的１　１个接合子。可见在ＳＭ＋Ｇｍ上获
图１　荧光标记根瘤菌及其原始菌在
长波紫外灯（３３６ｎｍ）下的荧光表达
Ｆｉｇ．１　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍａｒｋｅｄ
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｔｒａｉｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎａｌ　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｔａｉｎｓ
ｕｎｄｅｒ　ｐｏｒｔａｂｌｅ　ｌｏｎｇ　ｗａｖｅ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ｌａｍｐ（３３６ｎｍ）
表１　Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１菌株接合子的筛选
Ｔａｂｌｅ　１　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｎｊｕｇａｎｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１
接合子编号
Ｃｏｎｊｕｇａｎｔ
Ｎｕｍｂｅｒ
无氮生长情况
Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｎ
Ｎ－ｆｒｅｅ
接合子编号
Ｃｏｎｊｕｇａｎｔ
Ｎｕｍｂｅｒ
无氮生长情况
Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｎ
Ｎ－ｆｒｅｅ
１ － ＋ ＋ ２６ ＋ － ＋
２ ＋ － ＋ ２７ ＋ － ＋
３ ＋ － ＋ ２８ － － －
４ － ＋ － ２９ － － －
５ ＋ ＋ ＋ ３０ － － －
６ ＋ ＋ ＋ ３１ － － －
７ ＋ ＋ ＋ ３２ － － －
８ ＋ ＋ ＋ ３３ － － －
９ － － － ３４ － － ＋
１０ ＋ － － ３５ － － ＋
１１ － － ＋ ３６ － － －
１２ ＋ ＋ ＋ ３７ － － －
１３ ＋ ＋ － ３８ － ＋ －
１４ ＋ ＋ ＋ ３９ ＋ ＋＋
１５ － － － ４０ － － －
１６ ＋ ＋ ＋ ４１ － － －
１７ － － ＋ ４２ － － －
１８ － － － ４３ － － －
１９ － － － ４４ － ＋ －
２０ － ＋ － ４５ － － －
２１ － － － ４６ － ＋ －
２２ － － － ４７ － － －
２３ － － － ４８ － － －
２４ － － ＋ ４９ － － －
２５ － － ＋ ５０ － － －
注：“＋”指各接合子能形成单菌落，“－”表示菌株不能生长，各接合
子重复３次，下同。
Ｎｏｔｅ：“＋”ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｃｏｎｊｕｇｏｎｓ　ａｒｅ　ｇｒｏｗａｂｌｅ，ａｎｄ‘－’ｉｎｄｉｃａｔｅｓ
ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｃｏｕｌｄ　ｎｏｔ　ｇｒｏｗ　ｅａｃｈ　ｃｏｎｊｕｇａｎｔ　ｒｅｐｅａｔ　３ｔｉｍｅｓ．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ
ｂｅｌｏｗ．
得的大部分接合子在传代过程中固氮性能并不稳
定，仅约１６％～２２％的菌体可稳定遗传。因此，若
未经无氮培养基复筛，则可能会有部分固氮性能缺
失的菌体进入后期的筛选流程，而３次重复以上的
无氮培养基复筛对获得稳定的荧光标记固氮菌株是
必要的。
２．２　荧光标记根瘤菌的遗传稳定性
初选获得的接合子在无抗生素的ＴＹ固体培养
基上连续传代８次后，荧光质粒的丢失率均低于
４１７
０５／２０１５ 草　业　科　学 （第３２卷０５期）
表２　Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５菌株接合子的筛选
Ｔａｂｌｅ　２　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｎｊｕｇａｎｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５
接合子编号
Ｃｏｎｊｕｇａｎｔ
Ｎｕｍｂｅｒ
无氮生长情况
Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｎ
Ｎ－ｆｒｅｅ
接合子编号
Ｃｏｎｊｕｇａｎｔ
Ｎｕｍｂｅｒ
无氮生长情况
Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｎ
Ｎ－ｆｒｅｅ
１ ＋ ＋ ＋ ２６ ＋ ＋ ＋
２ ＋ ＋ ＋ ２７ ＋ ＋ ＋
３ ＋ ＋ － ２８ － － －
４ － － － ２９ － ＋ ＋
５ ＋ ＋ ＋ ３０ － － －
６ － ＋ ＋ ３１ ＋ ＋ －
７ － － ＋ ３２ － ＋ ＋
８ ＋ － ＋ ３３ － － －
９ － ＋ ＋ ３４ － ＋ ＋
１０ － － － ３５ － － ＋
１１ ＋ ＋ ＋ ３６ ＋ ＋ －
１２ ＋ ＋ ＋ ３７ － － －
１３ － ＋ ＋ ３８ － ＋ －
１４ － ＋ ＋ ３９ － ＋ ＋
１５ ＋ ＋ ＋ ４０ － － －
１６ － ＋ ＋ ４１ ＋ ＋ ＋
１７ － － － ４２ ＋ ＋ ＋
１８ － － － ４３ － － －
１９ － ＋ ＋ ４４ － ＋ ＋
２０ ＋ ＋ － ４５ － － －
２１ ＋ － ＋ ４６ － ＋ －
２２ ＋ ＋ ＋ ４７ － － －
２３ － － － ４８ ＋ ＋ －
２４ ＋ ＋ － ４９ － － ＋
２５ － － － ５０ － － －
１０％（表３），可见ｃｆｐ荧光质粒随宿主菌的传代能
进入下一代菌体，并在次代菌体细胞中稳定复制。
表明固氮能力稳定的菌株与荧光质粒的结合能力较
好，其中丢失率为 ０ 的Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ６、
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ８、Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５－ｃｆｐ５及
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５－ｃｆｐ９荧光表达能力也最强，最终
作为荧光标记株进行宿主植株回接试验。说明稳定
的固氮能力对菌株维持自身细胞内ｃｆｐ标记质粒
的荧光表达和质粒伴随宿主继代有积极的作用，这
可能与充足的氮素供应有利于蛋白、核酸和酶类合
成、进而促进菌体细胞及ｃｆｐ基因标记质粒的正常
分裂和增殖相关，其具体机理有待进一步研究确定。
２．３　荧光标记根瘤菌的回接鉴定和筛选
接种标记菌的苜蓿幼苗的生物量和株高与未接
种植株（ＣＫ）有明显差异（表４）。其中回接Ｓ．ｍｅ－
ｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ６、Ｓ． ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ８ 及
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５－ｃｆｐ５ 菌 株 的 生 物 量 高 出 对 照
９０．５％～１０４．８％，与对照差异显著（Ｐ＜０．０５）。
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ６、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ８和
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５－ｃｆｐ５回接植株的株高较对照高出
５６．３６％～６９．１６％，与对照差异显著。４株标记菌
回接植株的根长与对照无显著差异（Ｐ＞０．０５），因
此苜蓿根瘤菌荧光标记株能有效促进幼苗地上部分
的生长，增加其生物量和干物质积累。可见优良的
标记菌尽管具备荧光表达特性，额外的标记质粒需
要消耗部分菌体及菌体宿主植物的碳水化合物，但
并未显著影响菌体对植株的促生作用。故优良的标
记菌中，携带ｃｆｐ荧光标记基因的质粒其荧光表达
效率较高而能耗较低。
　　侵染寄主植株形成有效根瘤是根瘤菌的主要
特性。尽管未接种的对照处理也出现根瘤，但数
量和鲜重等均较低，且无发光根瘤（表５）。４株荧
光标记菌回接植株的根瘤数、单个根瘤鲜重及固
氮酶活性均显著高于对照，紫外光下根瘤的荧光
表达强度较高（图２）。其中，Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－
ｃｆｐ６、Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ８、Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５－
ｃｆｐ５及Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５－ｃｆｐ９的根瘤数高出对照
１２５％～３５０％，单个根瘤鲜重高出对照３００％～
７５０％，固氮酶活性为对照的１４．７～３０．９倍。除
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ６处理占瘤率高于Ｓ．ｍｅ－
ｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ８处理１８．６％外，其他根瘤指标与
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ８ 处 理 差 异 不 显 著 （Ｐ＞
０．０５），Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５－ｃｆｐ５处理的所有根瘤指
标测定结果均显著高于Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５－ｃｆｐ９处
理（Ｐ＜０．０５）。根据植物促生能力、结瘤情况和占
瘤率，Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ６及Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５－
ｃｆｐ５可分别作为Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１和Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ
ＧＮ５的标记菌株用于进一步的研究。上述结果可
知，同一出发菌株的三亲本杂交后代中，结瘤及固
氮能力差异存在着显著的差异。这说明三亲本杂
交时，质粒通过转导进入受体菌株的数量可能是
随机的，对菌体能量的消耗也不同。因此，为获得
优良的标记菌株，对接合子进行宿主植物的回接
验证是必要的。
５１７
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．０５） ０５／２０１５
表３　Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１及Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５菌株接合子荧光质粒丢失率
Ｔａｂｌｅ　３　Ｌｏｓｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ　ｏｆ　Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１ａｎｄ　Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５
接合子
Ｃｏｎｊｕｇａｎｔ
发光菌落数
Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ
总菌落数
Ｔｏｔａｌ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ
荧光质粒丢失百分率
ｃｆｐｐｌａｓｍｉｄ　ｌｏｓｅ　ｒａｔｅ／％
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１ｃｆｐ１　 ９７　 １００　 ３
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１ｃｆｐ２　 ９１　 １００　 ９
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１ｃｆｐ３　 ９３　 １００　 ７
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１ｃｆｐ４　 ９０　 １００　 １０
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１ｃｆｐ５　 ９８　 １００　 ２
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１ｃｆｐ６　 １００　 １００　 ０
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１ｃｆｐ７　 ９５　 １００　 ５
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１ｃｆｐ８　 １００　 １００　 ０
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１ｃｆｐ９　 ９９　 １００　 １
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５ｃｆｐ１　 ９４　 １００　 ６
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５ｃｆｐ２　 ９１　 １００　 ９
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５ｃｆｐ３　 ９５　 １００　 ５
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５ｃｆｐ４　 ９３　 １００　 ７
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５ｃｆｐ５　 １００　 １００　 ０
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５ｃｆｐ６　 ９７　 １００　 ３
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５ｃｆｐ７　 ９４　 １００　 ６
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５ｃｆｐ８　 ９９　 １００　 １
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５ｃｆｐ９　 １００　 １００　 ０
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５ｃｆｐ１０　 ９０　 １００　 １０
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５ｃｆｐ１１　 ９９　 １００　 １
表４　标记根瘤菌对苜蓿幼苗生长的影响
Ｔａｂｌｅ　４　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍａｒｋｅｄ　Ｒｈｉｚｏｂｉａｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
标记菌株
Ｍａｒｋｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ
单株生物量
Ｂｉｏｍａｓｓ／ｇ·ｐｌａｎｔ－１
株高
Ｈｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ／ｃｍ
根长
Ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈ／ｃｍ
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ６　 ０．４２±０．０３ａ １７．８３±１．８２ａ １５．３０±４．６２ａ
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ８　 ０．４０±０．０５ａ １８．１０±２．４０ａ １３．２０±１．０８ａ
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５－ｃｆｐ５　 ０．４３±０．０４ａ １６．７３±３．０２ａ １５．４７±１．５５ａ
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５－ｃｆｐ９　 ０．２４±０．００ｂ １２．３７±１．３６ｂ １３．２３±１．０５ａ
ＣＫ　 ０．２１±０．０３ｂ １０．７０±１．１５ｂ １５．５７±０．９６ａ
注：同列不同小写字母表示同一生长指标接种不同标记菌的处理间差异显著（Ｐ＜０．０５），ＣＫ为接种无菌水的对照。下同。
Ｎｏｔｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｏｗｅｒ　ｃａｓｅ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ｓｈｏｗ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｍｏｎｇ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｍｅ
ｇｒｏｗｔｈ　ｐａｒａｍｅｔｅｒ　ａｔ　０．０５ｌｅｖｅｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＫ）ｗａｓ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｓｔｉｌｅｄ　ｗａｔｅｒ．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｂｅｌｏｗ．
表５　标记根瘤菌对苜蓿幼苗根瘤的影响
Ｔａｂｌｅ　５　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍａｒｋｅｄ　Ｒｈｉｚｏｂｉａｏｎ　ｎｏｄｕｌｅｓ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
标记菌株
Ｍａｒｋｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ
根瘤数
Ｒｏｏｔ　ｎｏｄｕｌｅ
ｎｕｍｂｅｒｓ／ｐｅｒ　ｐｌａｎｔ
单个根瘤鲜重
Ｎｏｄｕｌｅ　ｆｒｅｓｈ
ｗｅｉｇｈｔ／ｇ
根瘤固氮酶活性
Ａｃｅｔｙｌｅｎｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ
ｎｏｄｕｌｅｓ／μｍｏｌ　Ｃ２Ｈ４ｈ
－１·ｇ－１
占瘤率
Ｎｏｄｕｌｅ
ｏｃｃｕｐａｎｃｙ／％
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ６　 １８±１．７３ａ ０．０１０±０．００１ｂ ２３．２７±２．０８ｂ ７０
Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ８　 １６±１．５３ａ ０．０１０±０．００１ｂ １９．９９±０．３１ｂ ５９
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５－ｃｆｐ５　 １５±３．２１ａ ０．０１７±０．００４ａ ２８．１３±１．４２ａ ７８
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５－ｃｆｐ９　 ９±１．７３ｂ ０．００８±０．００２ｂ １３．３７±０．３９ｃ ６６
ＣＫ　 ４±１．５３ｃ ０．００２±０．００１ｃ ０．９１±０．１５ｄ －
６１７
０５／２０１５ 草　业　科　学 （第３２卷０５期）
图２　荧光标记菌侵染形成的发光根瘤
Ｆｉｇ．２　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｒｏｏｔ　ｎｏｄｕｌｅｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｍａｒｋｅｄ　Ｒｈｉｚｏｂｉａｓｔｒａｉｎｓ
３　讨论与结论
ｃｆｐ荧光基因借助宿主范围较广的接合质粒，
通过受体菌与质粒供体菌细胞间的紧密接触由供体
细胞转移至受体细胞［２０］。三亲本杂交是在双亲本
杂交的基础上，使质粒在辅助菌的协助下进入受体
菌，如将ｃｆｐ荧光基因导入到豌豆根瘤菌后能够稳
定表达［４］。本研究中，三亲本杂交法可高效构建遗
传稳定的ｃｆｐ荧光标记苜蓿根瘤菌，构建的标记根
瘤菌在ＴＹ固体培养基上连续传代８次后，ｃｆｐ荧
光质粒的丢失率均低于１０％。
三亲本杂交法中，难以区分选择培养基上出现
的根瘤菌耐药突变株和供体菌、辅助菌的营养缺陷
回复突变株，即“假接合子”。本研究中，假接合子或
丧失固氮能力的标记菌株比例较高，若以反复的形
态观察和宿主回接试验，以是否结瘤，以及根瘤是否
产生荧光来区分，则复杂耗时［１１］。因此，借助根瘤
菌株在无氮培养基上正常生长的特性，用无氮和
ＴＹ固体培养基同步验证菌种的固氮和发光特性，
简化了筛选验证流程，提高了标记菌选育效率，具有
良好的应用前景。
外源质粒对菌株共生固氮能力的影响可能是促
进、也可能是抑制［２１］。一些根瘤菌在导入外源质粒
后侵染结瘤和共生固氮能力会有显著提升［２２］，可使
宿主植株的根瘤鲜重、生物量及植株含氮量增
加［２３］。李杰等［２２］以ｌｕｘＡＢ和ｐａｒＣＢＡ 基因重组质
粒ｐＨＮ２０８标记的根瘤菌株，其竞争结瘤能力没有
负面影响，遗传性状稳定。一些ｌｕｘＡＢ基因标记的
根瘤菌占瘤率可达６１．３％，显著优于土著根瘤
菌［２４］。本研究也发现，源于同一出发菌株的荧光标
记株，其结瘤能力和固氮酶活性存在较大差异。因
此除荧光表达强度外，对标记菌株的结瘤及促生能
力进行验证也是必要的。
通过初选、复选和回接验证，本研究最终获得了
理想的标记根瘤菌，其培养物和形成根瘤的荧光表
达能力强，与出发菌株易于区分（图１、２）并有良好
的促生能力，能使甘农５号紫花苜蓿植株生物量高
出对照９０．５％～１０４．８％、株高高出对照５６．３６％～
６９．１６％，根瘤数高出对照１２５％～３５０％，根瘤鲜重
高出对照３００％～７５０％，固氮酶活性达到对照的
１４．７～３０．９倍。其中的Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　１２５３１－ｃｆｐ６和
Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＧＮ５－ｃｆｐ５荧光表达强度，占瘤率、根瘤
的固氮酶活性等均高出其他标记菌株，可用于进一
步的根瘤菌示踪研究。
致谢：该论文是第二届全国草业生物技术大会
评选出的优秀论文，并得到中国草业生物技术专业
委员会提供的版面费支持。
７１７
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．０５） ０５／２０１５
参考文献
［１］　周俊初，史巧娟，谢波．绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ）在华癸中生根瘤菌与紫云英共生固氮作用研究中的应用［Ｊ］．中国科学
基金，２００１（５）：４８－５１．
［２］　Ｈｅｉｍ　Ｒ，Ｔｓｉｅｎ　Ｒ　Ｙ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｏｒ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ，ｌｏｎｇｅｒ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓ　ａｎｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６，６（２）：１７８－１８２．
［３］　王浩，绳志雅，隋新华．陈文新．用ｇｆｐ基因标记法研究大豆根瘤菌在大豆根部定殖结瘤情况［Ｊ］．微生物学杂志，２００６，
２６（２）：１－４．
［４］　凌瑶．用ｃｆｐ标记基因法研究菜豆根瘤菌的竞争性和有效性［Ｄ］．雅安：四川农业大学硕士论文，２００５：４８－５２．
［５］　沈凤英，李亚宁，刘力强，吴伟刚，刘大群．生防链霉菌 Ｍｅｎ－ｍｙｃｏ－９３－６３遗传转化体系的建立和优化［Ｊ］．中国农学通报，
２００９，２５（１３）：１９７－２０１．
［６］　张淑卿，师尚礼，陈力玉，苗阳阳，李剑峰，霍平慧．ＬａＣｌ３，ＩＡＡ及植物体液对荧光标记根瘤菌生长和增殖的影响［Ｊ］．草原
与草坪，２０１３，３３（２）：５７－６１．
［７］　Ｌｉ　Ｊ，Ｚｈａｎｇ　Ｓ，Ｓｈｉ　Ｓ，Ｍｉｃｈａｌｋ　Ｄ，Ｈｕｏ　Ｐ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｆｏｒ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ　ｏｆ　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ
［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｂａｓｅｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ，２０１２，６（６）：６９８－７０３．
［８］　殷爱华，韩素芬．豆科树种凝集素和根瘤菌胞外多糖结合反应与结瘤的关系［Ｊ］．南京林业大学学报：自然科学版，２００５，
２９（５）：８８－９０．
［９］　袁全，杨梦华，郑会明，钟增涛，朱军．中慢生型华癸根瘤菌Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｈｕａｋｕｉｉ　ＡＳ９自体诱导物合成酶基因的筛选及
其功能分析［Ｊ］．土壤，２００９，４１（３）：４５９－４６３．
［１０］　胡元森，李翠香，孙富林，吴坤，贾新成．不同培养基组合提高土壤细菌可培养性的研究［Ｊ］．微生物学报，２００７，４７（５）：
８８２－８８７．
［１１］　陈力玉．基于三亲本杂交的荧光标记根瘤菌的构建及其稳定性检测研究［Ｄ］．兰州：甘肃农业大学硕士论文，２０１３：２９－３３．
［１２］　Ｉｓｌａｍ　Ｍ　Ｓ，Ｋａｗａｓａｋｉ　Ｈ，Ｎａｋａｇａｗａ　Ｙ，Ｈａｔｔｏｒｉ　Ｔ，Ｓｅｋｉ　Ｔ．Ｌａｂｒｙｓ　ｏｋｉｎａｗｅｎｓｉｓ　ｓｐ．ｎｏｖ．ａｎｄ　Ｌａｂｒｙｓ　ｍｉｙａｇｉｅｎｓｉｓ　ｓｐ．ｎｏｖ．，
ｂｕｄｄｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｈａｂｉｔａｔｓ　ｉｎ　Ｊａｐａｎ，ａｎｄ　ｅｍｅｎｄｅｄ　ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ　Ｌａｂｒｙｓ　ａｎｄ　Ｌａｂｒｙｓ
ｍｏｎａｃｈｕｓ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ａｎｄ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，５７（３）：５５２－５５７．
［１３］　杨坤，巩振辉，李大伟．大肠杆菌高效感受态细胞的制备及快捷转化体系的建立［Ｊ］．北方园艺，２０１０，１４：１２７－１３．
［１４］　李剑峰，张淑卿，师尚礼．微波诱变选育高产生长素及耐药性根瘤菌株研究［Ｊ］．核农学报，２００９，６：９８１－９８５．
［１５］　张志芳，夏叔芳．几种豆科牧草根瘤的分离与接种试验［Ｊ］．草业科学，１９９４，１１（５）：２９－３３．
［１６］　高永革，李黎，刘祥，李和平，朱伟然，王磊，王彦华．黄河滩区紫花苜蓿生产性能比较研究［Ｊ］．草业科学，２００８，２５（７）：
５９－６４．
［１７］　Ｈａｒａ　Ｓ，Ｈａｓｈｉｄｏｋｏ　Ｙ，Ｄｅｓｙａｔｋｉｎ　Ｒ　Ｖ，Ｈａｔａｎｏ　Ｒ，Ｔａｈａｒａ　Ｓ．Ｈｉｇｈ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ｎ２ｆｉｘａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｅａｓｔ　ｓｉｂｅｒｉａｎ　ｃｒｙｏｐｈｉｌｉｃ　ｓｏｉｌ　ｂａｃｔｅ－
ｒｉａ　ａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ａｃｅｔｙｌｅｎｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｐｏｏｒ　ｍｅｄｉｕｍ　ｓｏｌｉｄｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇｅｌａｎ　ｇｕｍ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｅｎｖｉ－
ｒｏｎｍｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，７５：２８１１－２８１９．
［１８］　张淑卿．根瘤菌在苜蓿植株体内的运移及影响因素［Ｄ］．兰州：甘肃农业大学博士论文，２０１２：３７－４２．
［１９］　Ｍｕｈａｍｍａｄ　Ｚ，Ａｓｉｆ　Ｔ，Ａｔａ　Ｃ　Ｚ，Ａｓｈｒａｆ　Ｍ．Ｗｅｅｄ－ｃｒｏｐ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｓｕｇａｒｃａｎｅ　ｐｌａｎｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ
ｔｗｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｐａｋｉｓｔａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ，２０１０，４２（２）：８１５－８２３．
［２０］　Ｅｌｈａｉ　Ｊ，Ｖｅｐｒｉｔｓｋｉｙ　Ａ，Ｍｕｒｏ－Ｐａｓｔｏｒ　Ａ　Ｍ，Ｆｌｏｒｅｓ　Ｅ，Ｗｏｌｋ　Ｃ　Ｐ，Ｆｌｏｒｅｓ　Ｅ，Ｐｅｔｅｒ　Ｗｏｌｋ　Ｃ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｎｊｕｇａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｅｆ－
ｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｂｙ　ｔｈｒｅｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ａｎａｂａｅｎａ　ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ　ＰＣＣ　７１２０［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９７，１７９（６）：１９９８－
２００５．
［２１］　朱光富，周俊初，陈华癸．外源质粒（基因）导入花生根瘤菌的行为分析［Ｊ］．遗传学报，１９９６，２３（２）：１３１－１４１．
［２２］　李杰，陈丽华，李希臣，朱延明．一种应用ｌｕｘＡＢ基因标记大豆根瘤菌的新方法［Ｊ］．大豆科学，２００３，２２（３）：１７２－１７５．
［２３］　李友国，周俊初．导入ｄｃｔＡＢＤ和ｎｉｆＡ 基因对费氏中华根瘤菌共生固氮的影响研究［Ｊ］．遗传学报，２００２，２９（２）：１８１－
１８８．
［２４］　罗明云，张小平，李登煜，陈强，周俊初．用发光酶基因（ＬｕｘＡＢ）标记法研究慢生型花生根瘤菌的竞争结瘤能力［Ｊ］．生
态学报，２００３，２３（２）：２７８－２８３．
（责任编辑　张瑾）
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