全 文 ：






论 文 第 51卷 第 15期 2006年 8月
www.scichina.com 1787
nifA突变的苜蓿根瘤菌在根瘤中的转录组学分析
田哲贤①* 邹华松②* 李 健① 张远涛① 刘 影② 俞冠翘② 朱家璧②
Silvia Rüberg③ Anke Becker③ 王忆平①†
(① 北京大学生命科学学院, 蛋白质工程暨植物基因工程国家重点实验室, 北京 100871; ② 中国科学院上海生命科学学院上海植物
生理及生态研究所, 植物分子遗传国家重点实验室, 上海 200032; ③ Lehrstuhl für Genetik, Universität Bielefeld, Postfach 100131,
33501 Bielefeld, Germany. * 同等贡献. † 联系人, E-mail: wangyp@pku.edu.cn)
摘要 用全基因组微阵列比较了根瘤中苜蓿根瘤菌 1021的 nifA突变菌和野生菌的基因表达谱. 分析结
果表明, nifA的缺失引起 601个基因的表达发生变化. 这些基因分别属于生物大分子的合成代谢、三羧
酸循环及呼吸代谢以及结瘤固氮过程等多个功能组, 预示着根瘤中细菌的生长状态发生了显著的变化.
在根瘤中, fixK 以及受其激活的基因在 nifA 突变菌中的表达量显著高于野生菌. 定量实时 PCR 分析表
明, 根瘤中 fixLJ的转录水平在 nifA突变菌中显著高于野生菌. 通过统计学方法从 13个表达发生显著变
化的基因的上游调控序列中找到推测的 NifA结合位点.
关键词 转录组 NifA FixJ 根瘤细菌
中华苜蓿根瘤菌是革兰氏阴性土壤细菌 , 可以
在豆科植物的根瘤中与豆科植物共生固氮[1]. 建立有
效的共生体系需要细菌和宿主植物细胞相互特异识
别以及各自分化 . 有很多根瘤菌的基因与此过程有
关, 并有复杂的调控机制[2]. 根瘤菌在根瘤中分化成
能固氮的类菌体 . 在类菌体中 , 固氮过程相关基因
(nif)和微氧呼吸相关基因(fix)得到表达 [3]. 微氧信号
是 nif 和 fix 基因表达的重要调控因子[4]. fixL 和 fixJ
基因编码一个二组分调控系统 , 氧信号感应蛋白
FixL使应答蛋白 FixJ磷酸化. 磷酸化的 FixJ激活 fixK
和 nifA的转录[5~7]. FixK激活 fixNOQP的表达, 抑制
nifA的表达[8]. NifA是 fixABCX, nifN和 nifB基因以及
编码固氮酶的 nifHDK基因表达所必需的转录因子. 此
外, 在苜蓿根瘤菌中, NifA还对一些没有直接参与固
氮过程的基因进行表达调控, 如与竞争结瘤、结瘤素
合成、根瘤发育及类菌体的抗逆性有关的基因 [9].
NifA 结合到上游增强子类似的序列上, 通过 DNA-
环(DNA-looping)激活下游 Eσ54-依赖型启动子的转
录[10]. NifA形成二聚体后具有转录激活功能, 其在启
动子上的结合序列具有回文结构[11].
有研究表明, nif和 fix基因的突变对类菌体的分化
过程有影响[12~14]. nifA 突变菌株诱导产生不能固氮的
Fix−根瘤, 与野生菌诱导产生的根瘤在结构上有很大
差别. 由 nifA 突变菌株诱导产生的根瘤中类菌体少且
小. 由 fixJ突变菌株诱导产生的根瘤也有类似的特点.
由于苜蓿根瘤菌 1021 全基因组序列的解析[15~18],
研究人员可以利用 DNA微阵列来高通量地研究基因
表达调控, 如高渗[19]、微氧及共生[20]以及磷缺乏条件
下的基因表达谱分析[21]. 含有苜蓿根瘤菌 1021 全基
因组以及三叶草苜蓿 10000 个 EST 的双基因组芯片
被用来比较 fixJ 突变菌株及野生菌诱导产生的根
瘤[22].
尽管对共生固氮中基因表达调控的研究有较大
进展 , 但对其调控网络及其对根瘤中细菌的生理过
程的影响并不十分清楚. 本研究分析了 NifA 突变菌
株引起的根瘤中苜蓿根瘤菌的基因表达谱, 为与 NifA
有关的基因表达调控网络提供一些线索 , 同时也为
NifA对类菌体代谢及发育的调控作用提供新信息.
1 材料和方法
(ⅰ) 菌株. nifA突变的苜蓿根瘤菌 SmY[23]来源
于野生菌 1021[24]. 为了突变 nifA 基因, 将带有卡那
霉素抗性基因的 DNA 片段插入野生菌 Rm1021 的
nifA编码序列中. 插入位点是 nifA编码序列中惟一的
SalⅠ酶切位点, 在起始密码子下游 942 个碱基对处,
即在本研究中使用的 nifA寡聚核苷酸杂交探针(70个核
苷酸, 5′-cggcgagattcccccggcgttccaagcaaaactgctacgcgta-
atacaggaaggtgaatttgagcgagtc-3′)结合位点下游 24 个碱
基对处. 通过同源重组对野生苜蓿根瘤菌 1021 基因
组上的 nifA基因进行突变.
(ⅱ) 植物的培养. 用 0.1% HgCl2处理过的苜蓿
种子在根瘤菌培养液中浸润 30 min, 然后种在无菌







第 51卷 第 15期 2006年 8月 论 文
1788 www.scichina.com
的蛭石-珍珠岩(2:1)混合物中, 共种植 3 次, 每次间
隔 1 周. 每次接种野生菌 1021 的植株不少于 50 棵,
接种突变菌 SmY 的植株不少于 150 棵. 在无氮条件
下培养 4 周后收获根瘤, 并立即冻在液氮中, 于−80℃
保存备用.
(ⅲ) RNA 的纯化及 cDNA 的标记. 用 RNeasy
Mini Kit (Qiagen, 德国)分离纯化根瘤总 RNA. 由于
Sm6kOligo微阵列与植物根的 RNA的杂交很弱(结果
未显示), 故直接用根瘤的总 RNA. 在液氮中, 研磨
0.3 g冻存的根瘤, 用 4.5 mL RLT缓冲液进一步裂解
根瘤菌, 把裂解液分装到 6个 1.5 mL离心管中. 用酚-
氯仿反复抽提 , 最后用异丙醇沉淀 RNA. 污染的
DNA 用 DNaseⅠ处理 , 并通过 RNeasy Mini Kit
(clean-up 步骤)纯化. 将用同种根瘤菌接种的同一期
植物中得到的 RNA 合并在一起. 根据以前的报道,
取 15~30 µg总 RNA合成荧光标记的 cDNA探针[19].
(ⅳ) 微阵列杂交和图像的获得. Sm6kOligo 微
阵列包含所有苜蓿根瘤菌基因的特异探针, 即 6212 个
70 mer寡聚核苷酸和 3个 PCR片段(有关微阵列的设计
及相关参数可以参考 http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/,
数据库代码是 A-MEXP-230). 杂交按照文献[19]的方
法进行. 从 3个不同时期根瘤样品中获得的 cDNA分
别于 3个微阵列进行杂交. 微阵列用 GenePix 4000B
微阵列扫描仪(Axon Instruments, 美国)进行 10 µm像
素的扫描.
(ⅴ) 数据分析. 用 GenePix Pro 4.0 (Axon, 美
国)软件获取微阵列杂交图像, 并进行杂交点信号定
量. 用 TIGR ExpressConverter 1.4软件[25]把 GenePix
数据(gpr格式)转换成 TIGR MultiExperiment Viewer
文件格式(mev 格式). 在这个转换过程中, 每个杂交
点的信号强度都减去了背景强度. 用 TIGR MIDAS
2.17 软件[25]进行最低适配度(lowest fit)归一化处理.
MIDAS 软件的信噪比参数设为 2.0, 这样, 那些去除
背景后的信号强度低于背景信号的点就不再进行
分析. 计算 LOWESS 因子的 smooth 参数设为 33%.
归一化之后的信号强度比值的对数值 log2Ratio 用
TIGR MEV 2.2软件[25]计算得到. 每个实验组中, 将
每个基因在 3 个微阵列的 9 个数据合并在一起. 3
个或 3个以上的数据缺失的基因不再进一步分析. 利
用 Excel-Addin SAM 1.21 软件[26], 筛选出表达显著
上调或下调的基因 . 分析过程中回应格式 (response
format)设为‘one class’, delta值设为 1.2. 当 log2Ratio
不小于 1.00或不大于−1.00时, 基因的表达有显著的
差异.
(ⅵ) 根瘤细菌中 PfixN1::lacZ 和 PnifA::lacZ 的
β-半乳糖苷酶活性测定. 根据苜蓿根瘤菌的基因组
序列 , 设计了 fixN1 特异引物 (5′-cccaagcttccattgctt-
gtattttc-3′和 5′-cgggatccatctcgactgtgtgtttc-3′)和 nifA 特
异引物(5′-cccaagcttaaacctgctcgcg-3′和 5′-gaagatcttcaag-
acgagtgggggcc-3′). 将 PCR 产物克隆到广宿主质粒
pGD926[27]的 HindⅢ/BamHⅠ酶切位点之间. 通过三
亲杂交, 把这些质粒及对照空载体导入到 nifA 缺陷
的 SmY 及野生菌 Rm1021 中. 植物培养、根瘤菌接
种、根瘤收获等条件与微阵列实验中的条件一致. 根
瘤细菌的β-半乳糖苷酶的活性测定按照以前描述的
方法进行[28].
(ⅶ) 定量实时 PCR. 独立于微阵列实验, 从不
同批次的根瘤中分离纯化 RNA, 并用无 RNase 的
DNaseⅠ酶去除基因组 DNA 的污染. 定量实时 PCR
按文献[20]的方法进行. 所用的 PCR 引物为: fixK1,
5′-tgcaggagcgttcgcgggagctt-3′和 5′-gagcgcagcgcttccgg-
cttcat-3′; fixN1, 5′-cctctggctaacaatcgtctgggtt-3′和 5′-ga-
ccgggcggttcacctgtttcg-3′; fixL, 5′-ggcacaatcgtgtccttcaac-3′
和 5′-gccatttcgcccatctcat-3′; fixJ, 5′-ggttctcgtgacggacc-
tga-3′和 5′-gagcacctggcgttctctct-3′; 以及对照 16S rDNA,
5′-ttggacaatgggcgcaagcctgat-3′和 5′-agccgccttcgccactggtg-
ttcct-3′. 利用 Q-gene 软件[29]计算归一化之后的基因表
达强度比. 16S rDNA的 CT平均值作为归一化的参比.
(ⅷ) NifA 结合位点分析 . 根据 Berg 和 von
Hippel 的方法[30,31], 本室编写了一个计算机程序 LZ,
用来进行基于矩阵(matrix)的 DNA 上蛋白结合位点
的预测. 在 NCBI数据库中的 65个含有 NifA结合位
点的序列基础上, 得出了 22碱基对的NifA保守序列.
考虑到数据库中的 NifA 结合位点的差异能值
(discrimination energy, DE)都低于 12, 推测的 NifA结
合位点的差异能值不应高于 12.
2 结果
2.1 根瘤中 nifA突变菌和野生菌基因表达谱的差异
为了比较根瘤中 nifA 突变菌和野生菌的基因表
达谱, 从根瘤中分离纯化 RNA, 进行了微阵列杂交
实验. 用每个基因的表达差异倍数的对数值(M 值)对
该基因的杂交信号强度的对数值(A 值)进行作图(图
1(a)), 从这个分布图中可知, nifA 的突变导致了全基







论 文 第 51卷 第 15期 2006年 8月
www.scichina.com 1789
因组表达谱的巨大改变, 共有 601个基因表现出有显
著的表达差异. 在 nifA 突变菌中, 310 个基因的转录
水平高于野生菌, 291个基因的转录水平低于野生菌.
在 nifA突变菌中, 染色体、pSymA和 pSymB大质粒
中转录水平下降的基因数的比例大致与这 3 个复制
单元上的基因数目比例相符 , 转录水平上调的基因
主要分布在染色体上(图 1(b)). 在表 1 中列出了表达
量差异超过 5倍的基因.

图 1 nifA突变的根瘤细菌和野生的根瘤细菌的全基因组
表达谱比较
(a) 每个基因的表达差异倍数的对数值(log2(InifA/Iwt), M值)对该基因
杂交信号强度的对数值(log2(InifAIwt)0.5, A值)进行作图; (b) 上调和下
调的基因在 3个复制单元中的相对分布

表 1 在 nifA突变的根瘤细菌与野生根瘤细菌的基因表达
谱比较中有 5倍以上差异的基因
基因序号 基因产物
log2Ratio
(nifA− vs
野生型)
sma0011 SelA硒代半胱氨酸合成酶 2.76
sma0278 假拟蛋白 −2.43
sma0763 假拟蛋白 2.73
sma0769 FixP2细胞色素 c氧化酶 2.41
sma0771 假拟蛋白 2.33
sma0803 推测的 ABC转运 ATP结合蛋白 −3.56
sma0806 可能的类 SyrB调控子 −2.66
sma0816 FixX类铁氧还蛋白蛋白 −2.90
sma0817 FixC氧化还原酶 −4.21

续表 1
基因序号 基因产物
log2Ratio
(nifA− vs
野生型)
sma0819 FixB电子传递黄素蛋白α链 −5.43
sma0822 FixA电子传递黄素蛋白β链 −5.33
sma0825 NifH固氮酶 Fe蛋白 −4.25
sma0827 NifD固氮酶 Fe-Mo α 链 −3.54
sma0829 NifK固氮酶 Fe-Mo β链 −3.58
sma0831 NifX固氮蛋白 −4.01
sma0833 保守的假拟蛋白 −4.55
sma0872 假拟蛋白 ORF 110 −4.36
sma0873 NifN固氮酶 Fe-Mo辅因子生物合成蛋白 −4.49
sma1211 FixG硫铁膜蛋白 2.56
sma1220 FixN1血红素 b /铜细胞色素 c氧化酶亚基 2.38
smb20245 推测的 NDP-葡萄糖脱水酶差向异构酶蛋白 −2.44
smb20408 保守的假拟蛋白 −2.70
smb20449 推测的甲基转移酶蛋白 −2.60
smb20766 推测的 ISRm22转座酶蛋白 2.69
smb20847 推测的 lysR家簇转录调节子 −2.78
smb21108 保守的假拟蛋白 −2.46
smb21685 假拟蛋白 2.58
smc00320 RbfA核糖体结合因子 A, rRNA加工蛋白 3.09
smc00529 NifS磷酸吡哆醛依赖的转氨酶蛋白 2.68
smc00530 保守的假拟蛋白 3.59
smc00532 保守的假拟蛋白 2.51
smc00740 保守的假拟蛋白 2.37
smc01004 推测的 HisI磷酸核糖-AMP环化水解酶蛋白 2.68
smc01005 FolE可能 GTP环化水解酶 I蛋白 3.01
smc01030 PdhAa推测的脱氢酶α2亚基蛋白 3.28
smc01032 PdhB二氢硫辛酰胺 S乙基转移酶蛋白 2.69
smc01034 假拟蛋白 3.16
smc01142 可能的 HSP 2.39
smc01173 假拟蛋白 2.45
smc01260 可能转录调节子蛋白 2.37
smc01285 RpoA可能 DNA引导的 RNA聚合酶α链蛋白 2.34
smc01303 RpsC可能 30S核糖体蛋白 S3 2.76
smc01305 RpsS可能 30S核糖体蛋白 S19 2.42
smc01308 RplD可能 50S核糖体蛋白 L4 2.56
smc01313 RpsG可能 30S核糖体蛋白 S7 2.84
smc01451 保守的假拟蛋白 3.17
smc01453 TRm22可能的转座酶蛋白 2.94
smc01497 SmoF可能的转运山梨醇/甘露醇的内膜跨膜蛋白 2.34
smc01499 SmoK可能 ATP结合的转运蛋白 2.90
smc01856 推测的肌氨酸氧化酶蛋白 2.35
smc01864 MurD UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酸-D-谷氨酸连接酶 2.69
smc01917 NuoE1 NADH脱氢酶Ⅰ链 E蛋白 2.43
smc01918 NuoF1 NADH脱氢酶Ⅰ链 F蛋白 2.65
smc02109 ClpA可能的 ATP依赖的 Clp蛋白酶 ATP-结合亚 2.58
smc02110 保守的假拟蛋白 2.62
smc02435 HemK1推测的甲基转移酶蛋白 2.72
smc02654 AcpS可能的 holo-acyl-载体蛋白合成酶 2.33
smc02655 推测的跨膜蛋白 3.93
smc02756 推测传感器组氨酸激酶蛋白 2.66
smc02913 假拟蛋白 2.81
smc02983 推测的鸟氨酸, DAP或精氨酸脱羧酶蛋白 3.16
smc03249 假拟蛋白 2.97
smc03751 假拟蛋白 3.47
smc03817 推测的蔗糖激酶蛋白 2.37








第 51卷 第 15期 2006年 8月 论 文
1790 www.scichina.com
nifA突变的根瘤细菌中, 与 DNA复制(recR, ihfB
和 gyrB)及 RNA 转录(rpoA, rpoB, nusA, infB, rpoN,
rpoH1 及 nusG)有关的基因的表达量高于野生根瘤细
菌. 蛋白翻译过程在野生的根瘤细菌中明显受抑制,
因为 25 个核糖体蛋白的基因及另外 4 个与蛋白和多
肽合成修饰有关基因(tufA, tufB, infC和 fusA1)的表达
量在 nifA突变的根瘤细菌中较高. 另一方面, 与蛋白
或多肽的降解有关的基因(clpA, ctpA 和 hslV)在 nifA
突变的根瘤细菌中表达量比野生的根瘤细菌高 . 与
TCA循环有关的 4个基因(acnA, sucB, sucD和 mdh)、
丙酮酸脱氢酶复合体基因(pdhAa, pdhB和 lpdA1)及有
氧呼吸有关基因(nuoA1, nuoB1, nuoE1, nuoF1, nuoI,
nuoL, nuoJ, fbcC和 fbcF)在 nifA突变的根瘤细菌中表
达量也比野生的根瘤细菌高. 总而言之, 参与基础代
谢基因的表达量在野生根瘤细菌中比在 nifA 突变的
根瘤细菌中低.
6个与结瘤过程有关的基因(nodF, nodH, nodQ2,
nodB, nodD3和 nodE)在 nifA突变的根瘤细菌中表达
量比野生根瘤细菌低 . 不出所料 , 包括 fixABC 和
nifHDK 的大多数位于固氮基因簇的基因(sma0810~
sma0835)在根瘤中的表达是依赖 NifA的. 不过, nifA
自身的表达在 nifA 突变的根瘤细菌中要高于野生根
瘤细菌(因为 nifA 基因的微阵列杂交探针杂交的序列
位于插入失活位点的上游(参考材料与方法部分), 在
nifA 突变的根瘤细菌中可以测到 nifA 的转录信号).
出乎所料, 与固氮过程中电子传递有关的、位于第二
个固氮基因簇(sma1208~sma1229)的基因(fixG, fixP1,
fixQ1, fixO1, fixN1和 fixK1), 其表达量在 nifA突变的
根瘤细菌中大大高于野生的根瘤细菌. 进一步地, 另
一个拷贝的 fixNOPQ操纵子(sma0762~sma0769)以及
azu1和 smc02283等与电子传递有关的基因在 nifA突
变的根瘤细菌中大大高于野生的根瘤细菌.
2.2 通过报告基因融合系统验证 fixN1 和 nifA 在两
种根瘤细菌中的表达差异
为了验证微阵列分析中发现的 fixN1和 nifA在两
种根瘤细菌中的表达差异, 我们构建了启动子和β-半
乳糖苷酶报告基因融合系统, 并检测了其表达活性.
PnifA::lacZ 的表达活性在 nifA 突变的根瘤细菌中比
在野生的根瘤细菌中高两倍; 而 PfixN1::lacZ 的表达
活性在 nifA 突变的根瘤细菌中比在野生的根瘤细菌
中高 3 倍(图 2). 没有启动子的空载体对照在所检测
的条件下没有测出活性. 这些结果表明, 两个启动子
的表达活性在 nifA 突变的根瘤细菌中比在野生的根
瘤细菌中高, 与微阵列实验所得出的结果是一致的.


图 2 在 nifA突变的根瘤细菌及野生根瘤细菌中
PnifA::lacZ和 PfixN1::lacZ的表达活性
每个数据是 3个重复实验的平均值
2.3 在 nifA 突变的根瘤细菌中 fixLJ 的表达量有显
著上调
利用定量实时 PCR 实验, 检测了两种根瘤细菌
中 fixK1, fixN1, fixL和 fixJ的转录水平(图 3). 从定量
实时 PCR实验中计算出的 fixK1和 fixN1在两种根瘤
细菌中表达量的比值与微阵列分析中所得出的比值
相符. 考虑到微阵列实验和定量实时 PCR 实验中样
品的获得及归一化方法都是不同的 , 而且是独立进
行的, 因此 fixK1 和 fixN1 在 nifA 突变的根瘤细菌中
表达量显著上调得到了很好的验证. 不幸的是, 微阵
列实验中, 检测到的 fixL和 fixJ 的杂交信号很低, 因
此在显著性统计分析中排除了. 不过, 定量实时 PCR
实验结果表明, 两个基因在 nifA 突变的根瘤细菌中
表达量显著上调.

图 3 定量实时 PCR分析 nifA突变及野生根瘤细菌中 fixK1,
fixN1, fixL和 fixJ的转录水平
16S rRNA作为内部参照. 给出的比值是归一化之后的 nifA突变的根
瘤细菌和野生的根瘤细菌中的表达量比值. 相对误差在 15%以内







论 文 第 51卷 第 15期 2006年 8月
www.scichina.com 1791
2.4 在有显著表达差异的基因上游序列中可能存在
NifA结合位点的分析
依据 NCBI数据库中报道的 65个不同的 NifA结
合序列, 统计出了 NifA 保守结合序列. 接着, 利用
Berg 和 von Hippel 的方法 [30,31]对那些有可能带有
NifA 结合位点的基因的上游序列(起始密码子上游
500 碱基对以内)进行软件扫描分析. 在这个方法中,
差异能值(discrimination energy, DE)用来表征一个序
列与保守序列之间的差异度, DE 值越低, 成为 NifA
结合位点的几率越高. 在 fixL的上游序列中没有发现
可能的 NifA 结合位点. 这暗示着 NifA 缺失引起的
fixLJ 在根瘤细菌中的表达差异可能是间接的. 因此,
我们筛选出在两种根瘤细菌中表达有 5 倍差异的基
因以及表达有差异的转录调控因子基因 , 并对其上
游序列进行分析是否有可能的 NifA结合位点.
从表 2中可以看出, 在 fixA和 nifH的上游序列中
分析出很强的 NifA 结合位点, 与文献[32]报道的完全
一致. 同样地, 在 sma0872 上游序列中分析出的 NifA
强结合位点与文献[33]报道的一致. 有意思的是, 在
转录激活因子基因 nodD3 的上游序列中, 也分析出带
有较弱的 NifA结合位点. 有研究报道, 在苜蓿根瘤菌
的 nodD3 上游序列中有 3 个 NtrC 结合位点和下游的
σ54-依赖型启动子序列[34]. 本研究推测, NifA 结合位
点与第 2个 NtrC结合位点可能是重叠的.
在野生根瘤细菌中的表达量低于 nifA 突变根瘤
细菌中的表达量的基因中, 有 10 个基因的上游序列
中推测出有 NifA 结合位点. 在 nifA 的转录起始位点
和起始密码子之间[35]及 fixK1 的 FixJ 结合位点[36]的
上游, 发现有可能的 NifA结合位点.
3 讨论
微阵列研究表明 [20,22], 类菌体与自由生长的根
瘤菌相比, 整个基因组中将近 20%的基因发生显著
的表达差异 , 说明分化成类菌体需要经历巨大的生
理生化变化. 他们提出, 类菌体中与细胞结构、能量
代谢以及蛋白合成有关的基因的表达水平要低于自
由生长的细菌 , 说明类菌体中基础代谢水平是降低
的; 而类菌体中与固氮相关的基因的大量表达从另
一个角度说明类菌体中特殊的代谢状态 . 在本研究
中, 我们比较了野生根瘤细菌和 nifA 突变的根瘤细
菌的基因表达谱差异, 发现相似的现象, 即基础代谢
相关基因的表达水平总体下降 , 而固氮相关基因的
表达水平上调. 从基因表达分布(图 1(a))及表达差异
显著的基因数目中可以知道, NifA 的缺失导致了很
多功能组的基因发生了表达量的差异 , 可能把根瘤
细菌引入完全不同的生长状态. 不过, 尽管 nifA突变
的根瘤细菌与野生根瘤细菌相比有基础代谢加快的
特点 , 但却不能等同为自由生长的细菌 , 因为比较
nifA 突变的根瘤细菌和自由生长的细菌的转录组发

表 2 在两种根瘤细菌中表达有显著差异且上游序列含有推测的 NifA结合位点的基因
基因 推测的 NifA结合位点(5′→3′)a) DEb) 距离 c) log2Ratio
保守 CTTTGTCGGATATCCGACAAAG
fixAd) CTCTGTCGGCCCCTCGACAGAT 8.04 225 5.33
nifHe) CCTTGTCGGCTTAGCGACACGA 3.85 173 4.25
sma0872f) GTTTGTCAGGTCCGCGACAGAG 3.28 175 4.36
sma1409 GTTAGTTACTTACGCAACAAGA 10.00 14 2.32
smb20408 GGTTATCCGCAAGCCGACATCG 10.62 230 2.70
nodD3 AAATGTCAGGAATGCTCCACGC 11.99 262 1.37
smc01260 CTTTCTCGGCATCGCGACATGG 8.42 102 −2.37
smc00320 GTCCGTCTGGTACGCGACAACG 8.57 326 −3.09
smc02756 TCTTGTCGGACAGGCGGCAAAC 8.57 111 −2.66
fixK1 ACCTGTGGACTACGCGACACTA 8.95 145 −2.21
nifA CCCTGTCTGTACCTTCACAAAG 9.20 58 −1.08
smc02983 GGCTGTTGGAGAGCCGGCAGAC 10.17 268 −3.16
smc01453 GGTTGTCGAGACTCAGAAAAGG 11.46 9 −2.94
smb20766 GGTTGTCGAGACTCAGAAAAGG 11.46 9 −2.69
fixN1 GTTTGGCGCGTCGCGCACACGC 11.47 34 −2.38
smc01856 CTCGGTCGCGAAGCGAACATCG 11.63 9 −2.35
a) 阴影示最保守的碱基对; b) DE, 差异能值用来表征特定序列与保守的 NifA结合位点的差异; c) 距离, NifA结合位点(22碱基对)到起始
密码子的碱基对数目; d)~f) 以前报道的 NifA结合位点[40,41,33]








第 51卷 第 15期 2006年 8月 论 文
1792 www.scichina.com
现仍有很大的差异(结果未显示).
以前的研究表明 , 多个与结瘤有关的基因在根
瘤细菌中的表达要高于自由生长的细菌 [20]. 本研究
中 , 几个与结瘤有关的基因 (nodF, nodH, nodQ2,
nodB, nodD3和 nodE)在 nifA突变的根瘤细菌中的表
达要低于野生细菌. 我们推测, NifA对这些基因的表
达起调控作用可能是通过 nodD3, 因为 nodD3的上游
序列中有推测的较弱的 NifA结合位点(表 2), 但需要
进一步的证据来支持这一调控途径的存在 . 在分裂
根系统中的研究表明 , 结瘤因子对结瘤过程起负反
馈调节作用 [37]. 具有超级结瘤表型的植物突变中可
能缺失了这种负反馈机制[38]. 考虑到 nifA 突变导致
结瘤数目比野生菌显著增多 [13,39], 上述与结瘤有关
的基因在 nifA 突变的根瘤细菌中的表达下调可能与
结瘤数目控制能力的下降有关.
本研究观察到 2个拷贝的 fixNOQP表达量在 nifA
突变的根瘤细菌中要显著高于野生根瘤细菌 , 而大
多数与共生固氮有关的基因的表达量在 nifA 突变的
根瘤细菌中要低于野生根瘤细菌. 还有, 受 FixJ 调控
的 nifA, fixK1和 smc03253的表达量在无NifA时上调.
这种受 FixJ 调控的基因的上调, 在比较 nifA 突变的
根瘤细菌和质粒编码的 nifA 互补的 nifA 突变根瘤细
菌的基因表达谱时, 仍可以观察得到(结果未显示).
尽管 nifA和 fixK1的上游序列含有推测的NifA 结
合位点(表 2), 主要的调控机制可能是通过上调 fixLJ
的转录水平, 进而上调了受 FixJ 调控的基因, 如 nifA,
fixK, fixNOQP和 smc03253. 目前, 我们还没有看到有
关 fixLJ转录调控有关的报道. 需要进一步的证据来揭
示这种调控机制的存在.
考虑到表达差异显著的基因数目庞大 , 相对来
说直接受 NifA调控的基因数目较少, 我们推测 NifA
的调控作用是通过控制一些转录因子如 sigma因子、
激活蛋白或抑制蛋白的表达来得以扩展 . 除了前面
提到的 nodD3 以外, 一个编码未知功能转录因子的
基因 smc01260值得进一步分析, 因为在 nifA突变的
根瘤细菌中其表达量显著上调(表 1), 而当质粒编码
的 NifA 互补时表达量又恢复到野生菌的表达水平
(结果未显示 ), 另一方面其上游序列推测有较强的
NifA结合位点(表 2).
致谢 本工作为国家重点基础研究发展计划 (批准号 :
2001CB108901 和 2001CB108902)、国家自然科学基金(批
准号: 30470940)及德国 Bundesministerium für Bildung und
Forschung (批准号: 031U213D)和 Deutsche Forschungsge-
meinschaft (批准号: BIZ 7)资助项目.
参 考 文 献
1 Spaink H P. Root nodulation and infection factors produced by
rhizobial bacteria. Annu Rev Microbiol, 2000, 54: 257—288
2 Oke V, Long S R. Bacteroid formation in the rhizobium-legume
symbiosis. Curr Opin Microbiol, 1999, 2: 641—646
3 Kaminski P A, Batut J, Boistard P, et al. A survey of nitrogen fixa-
tion by rhizobia. In: Spaink H P, Kondorosi A, Hooykaas P J, et al,
eds. The Rhizobiaceae. Netherlands: Kluwer Academic Publisher,
1998. 431—460
4 Soupene E, Foussard M, Boistard P, et al. Oxygen as a key develop-
mental regulator of Rhizobium meliloti N2 fixation gene expression
within the Alfalfa root nodule. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92:
3759—3763
5 Gilles-Gonzalez M A, Ditta G S, Helinski D R. A haemoprotein
with kinase activity encoded by the oxygen sensor of Rhizobium
meliloti. Nature, 1991, 350: 170—172
6 Hertig C, Li R Y, Louarn A M, et al. Rhizobium meliloti regulatory
gene fixJ activates transcription of R. meliloti nifA and fixK genes
in Escherichia coli. J Bacteriol, 1989, 171: 1736—1738
7 de Philip P, Batut J, Boistard P. Rhizobium meliloti FixL is an
oxygen sensor and regulates R meliloti nifA and fixK genes differ-
ently in Escherichia coli. J Bacteriol, 1990, 172: 4255—4262
8 Batut J, Daveran-Mingot M L, David M, et al. fixK, a gene homo-
logous with fnr and crp from Escherichia coli, regulates nitrogen
fixation genes both positively and negatively in Rhizobium meliloti.
EMBO J, 1989, 8: 1279—1286
9 Fischer H M. Genetic regulation of nitrogen fixation in rhizobia.
Microbiol Rev, 1994, 58: 352—386
10 Hoover T R, Santero E, Porter S, et al. The integration host factor
stimulates interaction of RNA polymerase with NifA, the tran-
scriptional activator for nitrogen fixation operons. Cell, 1990, 63:
11—22
11 Ray P, Smith K J, Parslow R A, et al. Secondary structure and
DNA binding by the C-terminal domain of the transcriptional ac-
tivator NifA from Klebsiella pneumoniae. Nucleic Acids Res, 2002,
30: 3972—3980
12 Hirsch A M, Bang M, Ausubel F M. Ultrastructural analysis of in-
effective alfalfa nodules formed by nif::Tn5 mutants of Rhizobium
meliloti. J Bacteriol, 1983, 155: 367—380
13 Hirsch A M, Smith C A. Effects of Rhizobium meliloti nif and fix
mutants on alfalfa root nodule development. J Bacteriol, 1987, 169:
1137—1146
14 Vasse J, Debilly F, Camut S, et al. Correlation between ultrastruc-
tural differentiation of bacteroids and nitrogen-fixation in alfalfa
nodules. J Bacteriol, 1990, 172: 4295—4306
15 Barnett M J, Fisher R F, Jones T, et al. Nucleotide sequence and
predicted functions of the entire Sinorhizobium meliloti pSymA







论 文 第 51卷 第 15期 2006年 8月
www.scichina.com 1793
megaplasmid. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98: 9883—9888
16 Capela D, Barloy-Hubler F, Gouzy J, et al. Analysis of the chro-
mosome sequence of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti
strain 1021. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98: 9877—9882
17 Finan T M, Weidner S, Wong K, et al. The complete sequence of the
1683-kb pSymB megaplasmid from the N2-fixing endosymbiont Si-
norhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98: 9889—
9894
18 Galibert F, Finan T M, Long S R, et al. The composite genome of
the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science, 2001, 293:
668—672
19 Ruberg S, Tian Z X, Krol E, et al. Construction and validation of a
Sinorhizobium meliloti whole genome DNA microarray: Ge-
nome-wide profiling of osmoadaptive gene expression. J Biotech,
2003, 106: 255—268
20 Becker A, Bergáes H, Krol E, et al. Global changes in gene ex-
pression in Sinorhizobium meliloti 1021 under microoxic and
symbiotic conditions. Mol Plant Microbe Interact, 2004, 17: 292—
303
21 Krol E, Becker A. Global transcriptional analysis of the phosphate
starvation response in Sinorhizobium meliloti strains 1021 and
2011. Mol Genet Genomics, 2004, 272: 1—17
22 Barnett M J, Toman C J, Fisher R F, et al. A dual-genome Symbio-
sis Chip for coordinate study of signal exchange and development
in a prokaryote-host interaction. Proc Natl Acad Sci USA, 2004,
101: 16636—16641
23 杨成涛, 俞冠翘, 沈善炯, 等. 苜蓿中华根瘤菌 Sm NifA蛋白与
阴沟肠杆菌 Ec NifA 蛋白功能差异的研究. 中国科学 C 辑: 生
命科学, 2003, 33(5): 398—404
24 Meade H M, Signer E R. Genetic-Mapping of Rhizobium meliloti.
Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74: 2076—2078
25 Saeed A I, Sharov V, White J, et al. TM4: A free, open-source system
for microarray data management and analysis. Biotechniques, 2003,
34: 374
26 Tusher V G, Tibshirani R, Chu G. Significance analysis of mi-
croarrays applied to the ionizing radiation response. Proc Natl
Acad Sci USA, 2001, 98: 5116—5121
27 Ditta G, Schmidhauser T, Yakobson E, et al. Plasmids related to
the broad host range vector, pRK290, useful for gene cloning and
for monitoring gene expression. Plasmid, 1985, 13: 149—153
28 Wang Y P, Birkenhead K, Boesten B, et al. Genetic-analysis and
regulation of the Rhizobium meliloti genes-controlling C-4-dica-
rboxylic acid transport. Gene 1989, 85: 135—144
29 Muller P Y, Janovjak H, Miserez A R, et al. Processing of gene
expression data generated by quantitative real-time RT-PCR. Bio-
techniques, 2002, 32: 1372
30 Berg O G, von Hippel P H. Selection of DNA binding sites by
regulatory proteins. Trends Biochem Sci, 1988, 13: 207—211
31 Berg O G, von Hippel P H. Selection of DNA binding sites by
regulatory proteins.Ⅱ. The binding specificity of cyclic AMP re-
ceptor protein to recognition sites. J Mol Biol, 1988, 200: 709—
723
32 Szeto W W, Zimmerman J L, Sundaresan V, et al. A Rhizobium
meliloti symbiotic regulatory gene. Cell, 1984, 36: 1035—1043
33 Aguilar O M, Reilèander H, Arnold W, et al. Rhizobium meliloti
nifN (fixF) gene is part of an operon regulated by a nifA-dependent
promoter and codes for a polypeptide homologous to the nifK gene
product. J Bacteriol, 1987, 169: 5393—5400
34 Dusha I, Austin S, Dixon R. The upstream region of the nodD3
gene of Sinorhizobium meliloti carries enhancer sequences for the
transcriptional activator NtrC. FEMS Microbiol Lett, 1999, 179:
491—499
35 Agron P G, Ditta G S, Helinski D R. Mutational analysis of the
Rhizobium meliloti nifA promoter. J Bacteriol, 1992, 174: 4120—
4129
36 Galinier A, Garnerone A M, Reyrat J M, et al. Phosphorylation of
the Rhizobium meliloti FixJ protein induces its binding to a com-
pound regulatory region at the fixK promoter. J Biol Chem, 1994,
269: 23784—23789
37 van Brussel A A N, Tak T, Boot K J M, et al. Autoregulation of
root nodule formation: Signals of both symbiotic partners studied
in a split-root system of Vicia sativa subsp. nigra. Mol Plant Mi-
crobe Interact, 2002, 15: 341—349
38 Nishimura R, Hayashi M, Wu G J, et al. HAR1 mediates systemic
regulation of symbiotic organ development. Nature, 2002, 420:
426—429
39 Zimmerman J L, Szeto W W, Ausubel F M. Molecular characterization
of Tn5-induced symbiotic (Fix−) mutants of Rhizobium meliloti. J
Bacteriol, 1983, 156: 1025—1034
40 Earl C D, Ronson C W, Ausubel F M. Genetic and structural
analysis of the Rhizobium meliloti fixA, fixB, fixC, and fixX genes.
J Bacteriol, 1987, 169: 1127—1136
41 Weber G, Reilander H, Puhler A. Mapping and expression of a
regulatory nitrogen fixation gene (fixD) of Rhizobium meliloti.
EMBO J, 1985, 4: 2751—2756
(2006-04-20收稿, 2006-06-20接受)