全 文 ：第 22卷　第 3期
2001年 9月
内 蒙 古 农 业 大 学 学 报
Journal o f Inner Mongo lia Ag ricultural Univ er sity
Vo l. 22　 No. 3
Sep. 2001
文章编号: 1009- 3575( 2001) 03- 0074- 06
沙柳等位酶分析
乌云塔娜 ,　张胜利 ,　秦月明 ,　安守芹
(内蒙古农业大学生态环境学院 ,呼和浩特　 010019)
摘要:　本研究运用等位酶标记基因 ,通过 4种酶系统对 92个沙柳无性系进行优良基因型筛选 ,其中过氧化物酶
和天冬氨酸转氨酶采用凝胶系统Ⅰ 分离 ,酯酶和己糖激酶采用凝胶系统Ⅱ分离。 研究结果表明: 4种酶系统至少有
10个基因位点所控制 ;各位点表现高度杂合性 ;其中至少 3个位点有多态性 ; Pod- 2、 Pod- 3的重复位点和 Hex-
2位点 ;筛选出 Pod- 2b基因和 Hex- 2d基因为沙柳高生长性状的标记基因 ,其树高数量性状为同时含有 Hex- 2d
和 Pod- 2b> 只含有 Hex- 2d> 只含有 Pod- 2b> 不含有 Pod- 2b和 Hex- 2d ,筛选出 XIV- 08等 7个优良无性
系。
关键词: 　沙柳 ;　等位酶 ;　标记基因
中图分类号: 　 Q943· 2　　文献标识码:　 A
THE ANALYSIS OF THE ALLELIC ENZYME OF
Salix psammophila
Wuyuntana,　ZHANG Sheng- li,　 QIN Yue- ming,　AN Shou- qin
( Colleg e of Ecolog y and Env iv onment, Inne r Mongolia Ag ricultural Univ ersity, Huhho t　 010019)
Abstract: 　 In the article the gene of Sal ix psammophila was marked by allelic enzyme, and the excellent
clones w ere select f rom ninety jjj- tw o clones by four enzyme system. Among them peroxidase and aspa r-
tate t ransaminase w ere sepa ra ted by Ⅰ system of gelatin, and Esterase and hexokinase byⅡ system of
g ela tin. The resul t show ed that four enxyme system were controlled by ten gene si te in a t least , and every
si te show ed deeply hetero zy gosi ty. Th ree si tes at least have polymo rphism involving Pod- 2, pod- 3 repeat
si te and Hex- 2 si te, etc. . Pod- 2
b
and Hex- 2
d
were selected and regarded as marker g ene o f the high-
g row ing o f Sal ix psammophila. It s height quanti ty cha racter w ere o rder f rom high to low: hex- 2
d
and Pod
- 2b , Hex- 2
d , Pod- 2
b . The low est heigh t quanti ty cha racter hasn t Hex- 2
d
and Pod- 2
b . Sev en excellent
clones involvingⅪⅤ - 08, etc. w ere selected.
Key words:　 Sal ix psammophila;　 allelic enzyme;　 marker g ene
1　材料与方法
分析材料来自二年生沙柳植株 ,具体部位是从顶端数第 4片～ 9片叶子。 每个无性系分别做 2个～ 3个
收稿日期: 　2000- 09- 26作者简介: 　乌云塔娜 ( 1975- ) ,女 (蒙古族 ) ,硕士 ,在读博士 ,从事林木遗传育种研究 .
单株 ,取叶片 0. 5g ,加 1m l提取缓冲液 ,在预冷的研钵中研磨成匀浆 ,用高速离心机离心 ( 8000r /min) 10min,
取上清液备用 ,现用现研磨。提取缓冲液是: 0. 1mol /1 Tris—— HCl( pH7. 3):糖= 1: 1
采用垂直板连续聚丙烯酰氨凝胶电泳 ,过氧化物酶和天冬氨酸转氨酶由凝胶系统Ⅰ 分离 ,分离胶浓度
7. 0% ,酯酶和己糖激酶采用凝胶系统Ⅱ分离 ,分离胶浓度 7. 5% ;分离胶缓冲液 pH8. 9的 Tris— HCl,电极
缓冲液 pH8. 3的 Tri6—甘氨酸。进样量 25μl,采用稳压电流 ,先用 200V电压预电泳 1h,然后用 250V电压
继续电泳 ,待嗅芬兰移至凝胶板前沿 1cm处 ,停止电泳 ,剥胶染色。 0℃～ 4℃条件下电泳 3h～ 4h染色方法基
本参照胡能书 ( 1985)和王中仁 ( 1996)的配方。显色后作记录 ,照相或扫描。等位酶位点和等位基因的命名按
常规 ,以酶的缩写字母代表该酶系统 ,连字符后的数字代表酶的不同位点 (当有多个位点时 ) ,愈靠近正极 (迁
移值愈大 )的位点以愈小数字表示。每个位点的等位基因用小写英文字母代表 ,愈靠近正极最近 (迁移值最
大 )的等位基因以 a代表 ,其次以 b代表 ,依次类推。
等位基因频率按照 Nei ( 1987)的定义 , 1个二倍体居群中的基因位点 A的指定的等位基因 ( i )的频率
( qi )的计算公式
qi= ( 2nii+ nij ) / ( 2N)　　 ( i≠ j)
nij:具有纯合 aiai基因型个体数 , nij: 具有杂合基因型 ai aj:的个体数 , N:个体总数
2　结果与分析
2. 1　几种等位酶的分析
酶本身的 4级结构 ,组成多肽链 (亚基 )的数目 ,酶在细胞内各细胞器中的分布情况 ,酶表型和酶基因型
的关系是等位酶酶谱分析和解释的遗传学基础。
2. 1. 1　过氧化物酶 Peroxidase( PRX, PX, POD, PER, E. C. 1. 11. 1. 7)　该酶存在于植物细胞的细胞液和
细胞壁中 ,通常受 2个～ 4个位点控制 ,单体酶或二聚体酶 ,在沙柳电泳中采用凝胶系统Ⅰ ,可以检测出 3组
活性区。第 1组活性区 (见图版 1A— B,模式图 1. 1)着色浅而窄 , 1条～ 2条带 ,假定为 1个等位酶基因位点 ,
在供试群体中该位点酶带具有 4个不同的迁移值 ( Rf ) ,在 0. 68～ 0. 61之间 ,分别代表 1个等位基因 ,各无性
系中以纯合或杂合型位点存在 ,将其命名为 POD— 1;第 2组活性区 (图版 1B— C,模式图 1. 2)着色深浅和带
宽窄不一 ,迁移值幅度 ( 0. 32～ 0. 50)大 , 1条～ 4条带 ,群体中表现为 8个不同的迁移值 ( 0. 32～ 0. 50之间 ) ,
表现较复杂 ;第 3组活性区 (图版 1C— D,模式图 1. 3)着色较浅 ,带宽窄较一致 , 1条～ 2条带 ,判定为 1个等
位酶基因点 ,该群体中具有 2个不同的迁移值 ( 0. 21～ 0. 18) ,分别代表 1个等位基因 ,各无性系中以纯合或
杂合状态存在。由于蛋白质的 4级结构在进化过程中是比较保守的 ,不会轻易改变的 ,由第 1活性区和第 3
活性区酶表型可判定 POD在沙柳中是单体酶 ,则第 2活性区有可能是重复位点 ,群体中的表现符合单体酶
重复位点表型 ,因此第 2活性区假定存在 2个重复位点 , 8个等位酶基因 ,其命名为 PO D— 2和 POD— 3;第
3个活性区为 POD— 4;
2. 1. 2　酯酶 Esterase( Colo rimetric) ( EST, E. C. 3. 1. 1.—— )　该酶存在于植物细胞的细胞液中 ,通常由 2
个～ 10个位点控制 ,单体酶或二聚体酶。在凝胶系统Ⅱ下 ,表现为 3组活性区。第 1组活性区 (图版 2A— B,
模式图 2. 1)着色浅 ,带宽窄不一 , 1或 3(浓度比约 1: 2: 1)条带 ,假定为 1个等位酶基因位点 ,在群体中具有 3
个等位基因 ,迁移值在 0. 63～ 0. 58之间 ,其命名为 EST— 1;第 2组活性区 (图版 2B— C,模式图 2. 2)着色
深 ,带宽 , 1条或 3条带 ,判定为另一个等位酶基因位点 , 4个等位基因迁移值在 0. 43～ 0. 38之间 ,命名为
EST— 2;第 3组活性区 (图版 2C— D,模式图 2. 3)着色浅 , 1条或 3条带 ,判定为 1个等位基因位点 , 2个等
位基因 ,迁移值在 0. 21～ 0. 18之间 ,命名为 ES T— 3;根据谱带推测 EST— 3在沙柳中是二聚体酶。
2. 1. 3　天冬氨酸转氨酶 Aspaeta te amino t rnsferase ( AAT, GOT, E. C. 2. 6. 1. 1)　该酶存在于植物细胞的
细胞液 ,质体 ,线粒体 ,微粒体中 ,通常由 1个～ 4个基因位点控制 ,一般是二聚体酶 ,采用凝胶系统Ⅱ可以检
测出 2组活性区。第 1组活性区 (图版 3A— B,模式图 3. 1)着色深浅和带宽窄不一 ,在沙柳 92个无性系中均
75第 3期　　　　　　　　　　　　　　　乌云塔娜等:　沙柳等位酶分析
表现 3条带 ,上下两端颜色稍浅 ,迁移值分别为 0. 54, 0. 52, 0. 49,是杂合位点 , 2个等位基因编码 ,命名为
AA T— 1;第 2组活性区 (图版 3B— C,模式图 3. 2)着色浅 ,带窄 ,所有试验材料中只有 1条带 ,迁移值在 0. 38
左右 ,判定为 1个等位基因 ,并且是纯合位点 (只有 1个等位基因即单态 ) ,命名 AAT— 2。 由谱带 ,推测该酶
在沙柳中是二聚体酶。
2. 1. 4　己糖激酶 Hexokinase ( HEX, HEK, HE, E. C. 2. 7. 1. 1)　该酶存在于细胞的细胞液 ,质体 ,线粒体
中 ,通常由 2个～ 3个位点控制 ,单体酶。采用凝胶系统Ⅰ可检测出 3组活性区。第 1组活性区 (图版 4A— B,
模式图 4. 1)着色浅 ,带窄 , 1条带 ,迁移值在 0. 90左右 ,判定为 1个等位基因点 ,纯合型 ,由 1个等位基因编
码 ,命名 HEX— 1;第 2组活性区 (图版 4B— C,模式图 4. 2)着色深 ,带宽窄较一致 , 1条～ 2条带 ,命名为
HEX— 2,该群体中共有 4个不同的迁移值 ( 0. 78～ 0. 88之间 )受 4个等位基因控制 ,纯合或杂合位点。 第 3
组活性区 (图版 4C— D,模式图 4. 3)着色深浅不一 , 1条～ 2条带 ,迁移值在 0. 20～ 0. 18之间 ,纯合或杂合 ,
受 2个等位基因编码 ,其命名为 HEX— 3;对试验群体酶谱分析 ,推测该酶是单体酶。
2. 2　等位基因及基因频率
本文试验群体虽不是从某一个自然群体中抽取的样本 ,但它是从毛乌素沙地和库布齐沙漠沙柳面积较
大的一些地区搜集到的 ,在一定程度上也反映了该 4种酶系统的等位基因位点上的等位基因在沙柳种内的
分布情况 ,将其作为一总体样本计算各等位基因频率及相对应的迁移值 ,结果列于表 1。
等位基因频率统计结果表明 , 4种酶系统多数位点同一点上的各等位基因的频率相差不大 ,而少数位点
上的基因频率差异较大 ,如 POD— 2中的 b和 d, HEX— 2中的 a和 d;这表明 ,沙柳群体内存在较丰富的变
异。
表 1　各等位基因频率及相对应的迁移值 ( RF)
基因位点 等位基因及迁 移 值
等位基因
频 率 基因位点
等位基因及
迁 移 值
等位基因
频 率
POD- 1
a　 0. 68 0. 2311 AAT- 2 a　 0. 38 1. 0000
b　 0. 65 0. 3065
c　 0. 62 0. 2527 HEX- 1 a　 0. 90 1. 0000
d　 0. 61 0. 2097
POD- 2和
POD- 3
a　 0. 52 0. 1453
b　 0. 50 0. 1075
c　 0. 47 0. 2473
d　 0. 45 0. 3387
e　 0. 42 0. 1989
f　 0. 40 0. 3333
g　 0. 38 0. 2957
h　 0. 32 0. 3333
HEX- 2
a　 0. 88 0. 5376
b　 0. 86 0. 2097
c　 0. 82 0. 1505
d　 0. 78 0. 1022
HEX- 3
a　 0. 20 0. 5484
b　 0. 13 0. 4516
AAT- 1
a　 0. 54 0. 5000
b　 0. 49 0. 5000 EST- 1
a　 0. 63 0. 4086
b　 0. 60 0. 3387
c　 0. 58 0. 5227
ES T- 3
a　 0. 21 0. 5161
b　 0. 18 0. 4839 EST- 2
a　 0. 43 0. 2634
b　 0. 42 0. 2366
c　 0. 39 0. 2419
d　 0. 38 0. 2581
76 内 蒙 古 农 业 大 学 学 报　　　　 　　　　　　　　 2001年
2. 3　各无性系等位酶基因型及鉴别
实验中发现 ,同一无性系不同单株之间等位酶的带数和浓度较一致 ,说明等位酶在无性系以下分辨率
低 ,有利于无性鉴别。
92个无性系的等位酶基因型归纳整理如表 2。沙柳无性系杂合程度较高 ,如ⅩⅤ - 0. 8,Ⅸ - 02等 7个无
性系在 8个位点上杂合型 ,ⅩⅣ - 13,Ⅹ - 04等 8个无性系在 7个位点上杂合型 ,是进行基因位点连锁分析
的好材料。 92个无性系中没有 1个无性系 12个位点完全纯合。等位酶基因型进行比较 ,发现各无性系至少
在 1个以上的位点上存在差异 ,也就是说 ,利用等位酶标记可将上述无性系全部区分开来 ,可见 ,等位酶标记
可作为鉴别沙柳无性系的重要依据 ,现将优良无性系等位酶基因型列于表 2。
表 2　沙柳优良无性系的等位酶基因型
无性系 Pod- 1 Pod- 2 Pod- 4 Hex- 2 Hex- 3 Est- 1 Est- 2 Est- 3
ⅪⅤ - 08 a /b b /b /f /g a /b d /d a /b a /a a /d a /b
ⅪⅤ - 13 b /c a /b /c /f a /b a /d a /a b /b a /c b /b
Ⅴ - 02 c /b b /b /e /e a /a d /d a /b a /b a /a a /b
Ⅴ - 11 b /d b /b /f /f a /a d /d a /a a /a a /c a /b
Ⅸ - 05 c /d b /e /g /h a /b a /d a /a c /c b /b a /a
Ⅲ - 01 b /c b /c /c /g b /b b /d a /a b /c c /d b /b
达采 b /c b /b /f /f a /a d /d a /b a /b b /c b /b
2. 4　等位基因频率及生长性状的相关
树高和地径不同生长水平等位基因频率分布情况如表 3。多数位点基因频率在不同生长水平之间差异
不大 ,而少数位点基因频率差异较大 ,并且表现出较有规律的变化 ,如 POD- 2b和 HEX- 2d基因在树高
(368. 72cm～ 340. 10cm , 14个无性系 )较优良无性系中频率较高 (分别为 0. 2727, 0. 4546) ,而树高中等
( 315. 94cm～ 213. 40cm , 62个无性系 )和较差 ( 203. 13cm～ 103. 13cm , 15个无性系 )的无性系中频率较低 (不
超过 0. 05) ,说明这两个基因有可能与沙柳高生长有关 ,而且树高较优良的无性系往往是生物量较大 ,因此
POD- 2b和 HEX- 2d两个基因有利于生物量积累。初选的 10个优良无性系中有 9个无性系有以上两个基
因或其中 1个。入选的优良无性系中Ⅷ - 02不含有 POD- 2b和 HEX- 2d基因 ,它是以特殊性状 (干枝比 )作
为目标入选的 ,树高和生物量均中等。 另外 ,Ⅶ - 3,Ⅱ - 01,ⅪⅤ - 16,≫ - 02和Ⅲ - 02带有 POD- 2b和
HEX- 2
d 1个基因 ,树高较大 ,但生物量不高。 ⅩⅤ - 11等 14个无性系带有 POD- 2b基因 ,但其树高和生物
量均较低 ,可能是两个基因相互作用的结果 ,单独存在时生物量和树高较低 ,对此需要进一步研究和探讨。小
黄柳和乌柳均没有 POD- 2b和 HEX- 2d基因。 地径中未发现较有规律的基因频率分布。
表 3　不同生长水平各等位基因的频率分布
性状生长水平基因频率 　　　　　　树　高　　　　　　 　　　　　　地　径　　　　　　第一类 第二类 第三类 第一类 第二类 第三类
POD- 1a 0. 1818 0. 2203 0. 2500 0. 1167 0. 2353 0. 1579
POD- 1B 0. 2727 0. 3305 0. 3571 0. 4286 0. 3039 0. 3158
POD- 1C 0. 3182 0. 2627 0. 1786 0. 3039 0. 2647 0. 2105
POD- 1D 0. 2273 0. 1865 0. 2143 0. 0952 0. 1961 0. 3158
POD- 2a 0. 0455 0. 0932 0. 0536 0. 0476 0. 0882 0. 0789
POD- 2B 0. 2727 0. 0339 0. 0536 0. 1667 0. 0196 0. 0132
POD- 2C 0. 0909 0. 1271 0. 0714 0. 0714 0. 1471 0. 1053
POD- 2D 0. 0455 0. 1864 0. 3036 0. 0833 0. 1814 0. 1711
POD- 2E 0. 0681 0. 0932 0. 1964 0. 1190 0. 0735 0. 7890
POD- 2F 0. 1591 0. 1610 0. 1429 0. 1667 0. 1765 0. 1974
POD- 2G 0. 1818 0. 1441 0. 0714 0. 1786 0. 1373 0. 1447
POD- 2H 0. 1364 0. 1610 0. 1071 0. 1667 0. 1814 0. 2105
77第 3期　　　　　　　　　　　　　　　乌云塔娜等:　沙柳等位酶分析
　　　　　续表 3
性状生长水平基因频率 　　　　　　树　高　　　　　　 　　　　　地　径　　　　　　第一类 第二类 第三类 第一类 第二类 第三类
POD- 4a 0. 5000 0. 4322 0. 5357 0. 4048 0. 4804 0. 6053
POD- 4b 0. 5000 0. 5678 0. 4643 0. 5952 0. 5196 0. 3947
HEX- 2a 0. 3636 0. 5678 0. 5714 0. 4048 0. 5980 0. 5000
HEX- 2b 0. 0909 0. 2542 0. 2857 0. 1190 0. 2059 0. 2105
HEX- 2c 0. 0900 0. 1441 0. 1071 0. 0952 0. 1667 0. 2632
HEX- 2d 0. 4546 0. 0399 0. 0358 0. 3810 0. 0294 0. 0263
HEX- 3a 0. 5000 0. 5169 0. 5714 0. 5952 0. 1676 0. 4737
HEX- 3b 0. 5000 0. 4831 0. 4286 0. 4048 0. 3824 0. 5263
ES T- 1a 0. 3182 0. 3893 0. 3929 0. 4524 0. 4020 0. 2895
EST- 1b 0. 2727 0. 3559 0. 3928 0. 3571 0. 3235 0. 2895
ES T- 1c 0. 4091 0. 2543 0. 2142 0. 1095 0. 2745 0. 4210
ES T- 2a 0. 2727 0. 2797 0. 2143 0. 3333 0. 2255 0. 2386
EST- 2b 0. 1818 0. 2203 0. 4286 0. 2381 0. 2157 0. 2105
ES T- 2c 0. 4545 0. 2034 0. 2500 0. 2143 0. 2353 0. 3684
EST- 2d 0. 0910 0. 2966 0. 1071 0. 2143 0. 3235 0. 1843
ES T- 3a 0. 4545 0. 5339 0. 6071 0. 4286 0. 4902 0. 5000
ES T- 3a 0. 5455 0. 4661 0. 3929 0. 5714 0. 5098 0. 5000
　　为进一步明确 POD- 2b和 HEX- 2d基因与沙柳生长之间的关系 ,以不同生长水平无性系平均值为单
位 ,按树高和基因频率做相关分析 ,结果表明 (表 4) ,树高与 POD- 2b和 HEX- 2d频率相关显著 ,而且 PO D
- 2
b和 HEX- 2d之间相关系数达 0. 999,因此控制树高生长的基因有可能与 POD- 2b和 HEX- 2d组成 1
个较紧密的连锁基因群。
表 4　树高和基因之间的关系
树高 POD- 2b HEX- 2d
树高 1. 000 0. 720* * 0. 782* *
POD- 2b 0. 720* * 1. 000 0. 999* *
HEX- 2d 0. 782* * 0. 999* * 1. 000
　　以等位酶分析结果为依据 ,将 91个供试无性系 ,根据 HEX- 2d和 POD- 2b基因的有无 ,再次分成 4个
不同水平 (即同时含有 HEX- 2d和 POD- 2b ,含有 HEX- 2d ,含有 POD- 2b ,不含有 HEX- 2d和 POD- 2b
的 ) ,作树高的方差分析结果 (表 5)表明 ,树高在不同生长水平间差异显著。 树高平均值依次为同量含有
HEX- 2
d和 POD- 2b> 单独含有 HEX- 2d> 单独含有 POD- 2b> 不含有 HEX- 2d和 POD- 2b。地径在不
同水平间无显著差异。由此可见 , HEX- 2d和 PO D- 2b与沙柳生长有影响。树高和基因频率相关分析和不
同水平平均值直接比较来看 , HEX- 2d的基因对树高的作用比 POD- 2b基因大。
表 5　 4个不同水平的树高方差分析
误差来源 自由度 离差平方和 均方 F值 F
水平间 3 1052. 32 322. 13 9. 94* * F0. 05= 2. 30
水平内 87 213. 86 63. 86 F0. 01= 4. 13
合计 90 1266. 18
　　由田间试验初选的ⅤⅨ - 08,达采 ,Ⅴ - 02,Ⅸ - 05,Ⅲ - 01,ⅪⅤ - 13,Ⅴ - 11等 7个无性系同时含有
HEX- 2
d和 POD- 2b基因 ,长势良好 ,生物量高 ,为优良无性系。而Ⅸ - 04等无性系虽然也同时含有以上两
个基因 ,但病虫害较严重 ,长势中等 ,生物量较低 ,因此需要进一步研究和探讨。
78 内 蒙 古 农 业 大 学 学 报　　　　 　　　　　　　　 2001年
3　结论与讨论
3. 1　本试验确定出过氧化酶、酯酶和
己糖激酶在沙柳中的存在方式 ,基因
位点数、等位基因数等 ,这可为有关研
究提供材料 ,减少劳动量 ,同时根据
Cama. A和 Tsunenadid ( 1997)的理
论 ;酶带数越多 ,进化程度越高 ,确定
出种间进化程度为: 沙柳> 小黄柳 >
乌柳。
3. 2　计算出的各等位基因频率是进
一步遗传统计分析 (如杂合度、杂合性
基因多样度比率 )的基础资料。
3. 3　等位酶分析表明 , 4种酶系统至
少由 10个基因位点所控制 ,其中至少
3个位点有多态性: Pod- 2、 Pod- 3
的重复位点 Hex- 2位点。多数基因
位点 ( Hex- 1是单态 )存在 2或 2个
以上的等位基因 ,沙柳种内具有遗传
多样性。
3. 4　找出的 POD- 2b基因和 HEX
- 2d基因与树高、生物量为极显著相 图版 3 图版 4
关关系 ,且树高平均依次为同时含有 HEX- 2d和 POD- 2b> 含有 HEX- 2d> 含有 POD- 2b> 不含有 HEX
- 2d和 POD- 2b。因此 ,上述基因可作为沙柳高生长的基因标记 ,对于沙柳辅助选择早期预测具有指导意
义。
3. 5　基于以上试验结果 ,建议下一步实验应从生长水平优势的无性系进行遗传多样性度量 ,确定它们是否
真正具有环境造成的表型差异 ,这可以避免相同材料多次重复而造成的浪费。
参　考　文　献:
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[ 2]　安守芹 .北沙柳及几种柳树过氧化物酶同功酶遗传变异研究〔 J〕.内蒙古农业大学学报 (自然科学版 ) (原内蒙古林学院学
报 ) , 1998, 20( 3): 79- 87.
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79第 3期　　　　　　　　　　　　　　　乌云塔娜等:　沙柳等位酶分析