全 文 ：收稿日期:2007-03-13;　修订日期:2007-05-15
基金项目:国家自然科学基金项目(No.30130220;No.30371775)
作者简介:杜旭东(1981-),男(汉族),内蒙古乌兰察布人 ,现为大连工业
大学在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事中药有效成分提取研究工作.
＊通讯作者简介:张宗申(1968-), 男(汉族),河南周口人 , 现任大连工业
大学教授 ,博士学位 ,主要从事细胞工程研究工作.
正交实验法优选鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的提取工艺
杜旭东 1 , 刘同祥2 , 张宗申 1＊ , 牛建昭 2 , 王继峰2
(1.大连工业大学生物与食品工程学院 , 辽宁 大连　116034;
2.北京中医药大学基础医学院 ,北京　100029)
摘要:目的 研究鱼腥草中胰蛋白酶抑制剂活性成分的最佳提取条件。方法 以提取液对胰蛋白酶的抑制率为指标 , 采
用正交试验法对提取温度(A)、溶剂用量(B)、pH值(C)、提取时间(D)4个因素进行优选研究 , 并以优选出的提取方案
进行验证实验。结果 因素 B对提取效果有极显著的影响 ,因素 A、C均有显著的影响 ,因素 D影响不显著。结论 鱼腥草
中胰蛋白酶抑制活性成分有效部位的最佳提取工艺为 A1B2C3D2。
关键词:鱼腥草;　胰蛋白酶抑制剂;　正交实验
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2007)10-2337-01
OptimizetheExtractionProcedureofTrypsinInhibitorofHoutuyniacordataThunb.by
OrthogonalDesign
DUXu-dong1 , LIUTong-xiang2 , ZHANGZong-shen1＊ , NIUJian-zhao2 , WANGJi-feng2
(1.ColegeofBiologyandFoodTechnology, DalianPolytechnicUniversity, Dalian116034 , China;2.School
ofBasicMedicalSciences, BeijingUniversityofChineseMedicine, Beijing, 100029, China)
Abstract:ObjectiveTooptimizetheextractionprocedurefortrypsininhibitorfromHouttuyniacordataThunb..MethodsThe
inhibitionrateoftrypsinactivitywasusedasscreeningparameter, weemployedtheorthogonaldesignmethodtotesttheefectsof
fourfactors, includingtemperatureofextractionsolution(A), volumeofextractionsolution(B), pHvalueofextractionsolution
(C)andtimeofextraction(D), ontheextractionoftrypsininhibitor.ResultsFactorBperformedthemostsignificanteffecton
theextraction, andfactorsAandCcamethenextandfactorDthelast.ConclusionTheoptimumextractiontechnologyis
A1B2C3D2 whentheinhibitionratiooftrypsinactivityisconsideredaspreferentialparameter.Keywords:HoutuyniacordataThunb.;　Trypsininhibitor;　Orthogonaldesign
　　蛋白酶抑制剂(proteinaseinhibitor, PI)是一类能够抑制蛋白
水解酶活性的物质 , 广泛存在于动植物和微生物中 [ 1] 。其中胰
蛋白酶抑制剂(Trypsininhibitor, TI)具有重要的药用价值 , 对急
性胰腺炎 、肺气肿 、抗休克 、防治脑水肿和脑缺血等都有很好的临
床治疗效果 , 还有研究表明对 HIV和肿瘤的治疗也有重要意
义 [ 2] 。因此 , 从传统中药中筛选具有 TI活性的材料有很广阔的
应用前景和市场价值 。
鱼腥草为三白草科植物蕺菜 HouttuyniacordataThunb.的地
上部分 , 具有清热解毒 、消痈排脓 、利尿通淋之功效 , 是临床应用
极其广泛的中药之一 [ 3] 。 本实验根据前期筛选的结果 , 利用鱼
腥草为材料对从鱼腥草中提取 TI的工艺进行优化 , 找出最佳的
提取条件 , 为今后的工业化生产 TI提供基础性数据。
1　仪器与试剂
1.1　试剂 胰蛋白酶(北京麒麟宏伟公司)、大豆蛋白酶抑制剂
(国药集团化学试剂有限公司)、苯甲酰 DL-精氨酸对硝基苯胺
(BAPNA)(上海三杰生物技术有限公司)、三 -羟甲基 -氨基甲
烷 、无水氯化钙 、盐酸 、三氯乙酸 、氢氧化钠等为国产分析纯;鱼
腥草。
1.2　仪器 可见光分光光度计(7202B)、离心机(LD-4)、精密
pH计 、水浴锅 、精密电子天平(FA2004N)。
2　方法
2.1　鱼腥草中胰蛋白酶抑制活性成分提取的正交实验设计 根
据文献 [ 4～ 6]及预实验结果 , 本实验采用双蒸水作为提取 TI的溶
剂。称取干燥的鱼腥草全草 5 g, 粉碎 , 在平行操作条件下 , 选用
L9(34)正交实验表进行提取实验 , 以胰蛋白酶活性大小为指标 ,
进行 9次实验 , 每次实验重复 3次(正交因素水平见表 1), 然后
过滤并收集滤液 ,减压浓缩到 100 ml。
表 1　因素水平
水平 A温度 /℃ B溶剂用量 /倍 CpH Dt/h
1 60 10 5 1
2 70 30 7 3
3 80 50 9 5
2.2　鱼腥草中胰蛋白酶抑制活性成分对胰蛋白酶的抑制率测定
方法 采用苯甲酰 DL-精氨酸对硝基苯胺(BAPNA)法 [ 7]:取胰
蛋白酶液 1 ml,加药材提取液 1 ml在 37℃水浴保温 5 min,加入
BAPNA溶液 5 ml, 37℃水浴保温 10 min后 , 立即加 1 ml三氯乙
酸(30%)终止反应 , 用分光光度法在 410 nm条件下测定吸光
度。按 下列 公式 计 算 样品 提 取液 的 抑 制百 分 率:i=
(Ar-Abr)-(As-Abs)
(Ar-Abr) ×100%
式中:i—抑制百分率;Ar—标准溶液的吸光度;Abr—含标准
溶液的空白对照液的吸光度;As—样品溶液的吸光度;Abs—含样
品溶液的空白对照液的吸光度。
3　结果与方差分析
结果见表 2, 表 3。由方差分析可知 , 各因素对提取效果的影
响程度依次为 B>A>C>D,其中因素 B为高度显著 ,因素 A, C
影响显著 ,因素 D没有统计学意义 , 对试验结果的影响很小 。由
R值可知 , 各因素对试验结果的重要次序为 B>C>A>D。考虑
到规模化生产中经济 、效率等因素 ,本文优选工艺 A1B2C3D2 , 即
在 60℃, 用 30倍量水 , pH值为 9, 3h/次为最佳提取工艺。按照
此工艺条件进行 3次平行实验 , 测定提取液对胰蛋白酶的抑制
率 , 结果平均抑制率为 58.27%, 表明本实验确定的工艺路线稳
定可靠 。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2007VOL.18NO.10 时珍国医国药 2007年第 18卷第 10期
表 2　L9(34)正交实验结果
实验号 A B C D 抑制率(%)
1 1 1 1 1 16.57
2 1 2 2 2 32.32
3 1 3 3 3 38.05
4 2 1 2 3 11.44
5 2 2 3 1 30.06
6 2 3 1 2 21.61
7 3 1 3 2 18.46
8 3 2 1 3 23.26
9 3 3 2 1 22.73K
1 86.94 46.47 61.44 69.36K2 63.11 85.64 66.49 72.39K3 64.45 82.39 86.57 72.75R 7.94 13.15 8.38 1.13
表 3　正交实验的方差分析
方差来源 偏差平方和 自由度 方差 F值 显著性 P
A 39.83 2 19.92 51.08 >0.05
B 105.01 2 52.51 134.64 >0.01
C 39.27 2 19.64 50.35 >0.05
D(误差) 0.77 2 0.39
　　F
0.05(2, 2)=19, F0.01(2, 2)=99
4　讨论
因素 A对实验结果有显著的影响 , 60℃时提取活性最高 ,随
着温度的上升抑制率有下降的趋势 , 说明随着温度的上升对 TI
有失活的作用。因素 B对实验有高度显著的影响 , 在所有因素
中影响最显著 , 说明随着溶剂量的增加会提高 TI的提取效率 ,但
从变化趋势看当 30倍量时继续增加溶剂量 , TI的提取率增幅不
是很明显 ,因此考虑生产成本和效益用 30倍量是最好的。因素
C对实验结果也有显著影响 , 随着 pH值的增加 ,提取活性成分的
提取率增加 ,这说明在碱性条件下提取效率升高。
本实验通过正交实验法对提取工艺条件进行了优化 , 并按
最佳工艺进行了验证试验 , 结果证明用该工艺作为鱼腥草中 TI
的有效部位的粗提取 , 具有工艺简单 、提取率高 、操作控制容易 、
稳定性好的特点。
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文献综述
收稿日期:2007-03-13;　修订日期:2007-05-15
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30170095);
　　　　 重庆市自然科学基金资助项目(No.8621);
　　　　 重庆三峡学院资助项目(No.2005-sxxyyb-0020)
作者简介:罗　凯(1979-),男(土家族), 湖北恩施人, 现任重庆三峡学院
生物系讲师 ,硕士学位 ,主要从事生物工程研究工作.
＊通讯作者简介:胡廷章(1965-), 男(汉族),四川简阳人 , 现任重庆三峡
学院教授 ,博士学位 ,主要从事生化与分子生物学研究工作.
植物细胞培养生产次生代谢产物的研究进展
罗　凯1 , 胡廷章 1＊ , 罗建平2
(1.重庆三峡学院 ,重庆 万州　404000;
2.合肥工业大学生物与食品工程学院 ,安徽 合肥　230009)
摘要:利用植物细胞培养生产代谢产物具有十分广阔的前景。文章就植物细胞培养生产次生代谢产物过程中各种理化
条件优化以及植物细胞培养过程相关模型建立的研究进行了综述。
关键词:植物细胞培养;　条件优化;　模型
中图分类号:R34　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2007)10-2338-03
　　植物细胞培养始于本世纪初 , 并不可争议地具有工业化潜力。
目前植物细胞培养生产的化合物很多, 包括糖类、酚类 、脂类 、蛋白
质 、核酸以及帖类和生物碱等初生和次生代谢产物 ,植物细胞培养
的应用主要包括以下 3个方面:有用物质(次生代谢产物)的生产;
植物无性系的快速繁殖和遗传突变体的筛选;植物细胞遗传 、生
理 、生化和病毒方面的深入研究。但是由于植物细胞大规模培养
技术的局限性使得植物细胞仍难以实现大规模工业化生产 ,迫切
需要进一步研究和发展细胞培养条件的优化控制及其工艺。目
前 ,世界上众多研究工作集中在优化细胞培养环境 、改变细胞特
性 、提高目标产物的产率并保证其生产稳定性上。
1　植物细胞悬浮培养条件的优化
1.1　植物细胞培养过程中物理因素的优化控制 对于植物细胞
培养来说 , 环境中的许多物理因素对细胞的生长以及目标次生代
谢产物的合成具有很大的影响。如通过温度 、光照 、电场 、磁场电
磁辐射 、机械力以及超声波等对于植物细胞培养过程都有着十分
重要的作用。植物细胞的生长 、繁殖和次生代谢物的生产需要一
定的温度条件 , 在一定的温度范围内细胞才能正常生长 、繁殖和
维持正常的新陈代谢 ,植物细胞培养的最适温度一般为 25℃, 但
不同的植物种类略有差异 ,而且植物细胞生长和次生代谢产物的
合成所需的温度并不一致 ,因此选择合理的培养温度并进行相应
的调控对于细胞生长以及产物合成十分关键 , H.J.G.tenHoopen
等 [ 1]曾对 Catharanthusroseus细胞的培养过程 、ToshiyaTakeda
等 [ 2]对 Strawberry细胞的培养过程分别进行温度的阶段性调控 ,
结果都在很大程度上提高了产物的产率;培养基的 pH值与细胞
生长繁殖以及次生代谢产物的生产关系密切 , 与培养温度相似 ,
细胞的生长繁殖与次生代谢产物合成时所需的 pH值通常并不
一致 , 需要在不同的阶段控制不同的 pH值;目前关于电场的作
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时珍国医国药 2007年第 18卷第 10期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2007VOL.18NO.10