全 文 ：收稿日期:2009-05-08;　修订日期:2009-11-25
基金项目:国家自然科学基金(No.30130220)
作者简介:付煊赫(1984-),男(汉族),辽宁沈阳人 ,现为大连工业大学生物
与食品工程学院在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事发酵工程研究工作.
＊通讯作者简介:张宗申(1968-), 男(汉族),河南郸城人 , 现任大连工业
大学生物与食品工程学院教授 ,博士学位 ,主要从事发酵工程研究工作.
鱼腥草蛋白酶抑制剂的分离和纯化
付煊赫1 ,刘同祥 2 ,张宗申1＊
(1.大连工业大学生物与食品工程学院 , 辽宁 大连　116034;　
2 .中央民族大学中国少数民族传统医学研究中心 ,北京　100081)
摘要:目的 以鱼腥草为材料 , 研究鱼腥草蛋白酶抑制剂(HCTI)的分离提取工艺。方法 HCTI的最佳粗提条件是采用
pH7.0的双蒸水为提取溶剂 , 在体积比为 1∶30, 45℃条件下浸提 2.0 h, 提取 2次。硫酸铵部分沉淀后 , 再经DEAE-52
离子交换层析柱纯化。结果 粗提液经 45% ～ 60%饱和度的硫酸铵沉淀比活力最高 , 经过 DEAE-52离子交换层析柱梯
度洗脱后 , 检测到 HCTI活性峰。结论 用 DEAE-52离子交换层析柱可分离纯化 HCTI, SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 计
算出该 HCTI的分子量约为 28 KDa。
关键词:胰蛋白酶抑制剂;　鱼腥草;　分离纯化
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)05-1047-02
TheExtractionandPurificationofTrypsinInhibitorfromHoutuyniacordataThunb
FUXuan-he1 , LIUTong-xiang2 , ZHANGZong-shen1＊
(1.SchoolofBiologyandFoodEnginering, DalianPolytechnicUniversity, Dalian, 116034, China;2.Mi-
norityTraditionalMedicalCenter, MinzuUniversityofChina, Beijing100081 , China)
Abstract:ObjectiveTostudytheisolationandpurificationprocedureofTIfromHouttuyniacordataThunb.MethodsTheopti-
malcriteriaofTIextractionwere45 ℃, 30 timesofsolventvolume, pH7.0 and2 h.Thecombinationofammoniumsulphate
precipitationandDEAE-celulosecolumnchromatographywasusedtopurifytheTI.ResultsThespecificactivitypeakofTIoc-
curredinthepartof45% ～ 60% (NH4)2SO4 precipitation, andwasconsequentlypurifiedbyDEAE-cellulosecolumngradient
elution, andtheactivityofTIcouldbedetected.ConclusionTheHCTIcanbepurifiedwithDEAE-celulosecolumn, andthe
molecularweightofHCTIisdeterminedbySDS-PAGEas28 KDa.
Keywords:Trypsininhibitor;　HoutuyniacordataThunb;　Isolationandpurification
　　胰蛋白酶抑制剂(Trypsininhibitor, TI)除了在临床上用来治
疗急性胰腺炎 、肺气肿 、脑水肿和脑缺血外 ,目前还发现它在 HIV
和肿瘤的治疗中也有重要意义 [ 1] 。化学合成的 TI生物利用度
低 、副作用大以及产生耐药性等缺点 , 植物来源的 TI具有兼容性
好 、安全和特殊的药物特性等优点。因此 , 从传统中药中筛选具
有 TI有活性的材料有很广阔的应用前景和市场价值。
鱼腥草为三白草科植物蕺菜 HouttuyniacordataThunb的地
上部分 , 具有清热解毒 、消痈排脓 、利尿通淋之功效 , 是临床应用
极其广泛的中药之一。本文在前期研究的基础上 , 对鱼腥草中
TI进行了分离纯化 ,获得的结果对开发植物来源的 TI具有重要
意义。
1　材料与仪器
1.1 　试剂 胰蛋白酶(北京麒麟宏伟公司), 苯甲酰 DL-精氨
酸对硝基苯胺(上海三杰生物技术有限公司), DEAE-纤维素
(Sigma),三 -羟甲基 -氨基甲烷 , 无水氯化钙 , 盐酸 , 三氯乙酸 ,
氢氧化钠等为国产分析纯。
1.2　仪器 可见光分光光度计 , 高速冰冻离心机 , 精密 pH计 ,数
显恒温水浴锅 , 精密电子天平 , 蛋白质电泳仪等。
2　方法
2.1　鱼腥草胰蛋白酶抑制剂抑制率的测定 参考杜旭东等 [ 2, 3]
的苯甲酰 DL-精氨酸对硝基苯胺(BAPNA)法。
2.2　鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的分离与纯化 参考康庄等 [ 4]的方
法进行 。
3　结果
3.1　硫酸铵分级沉淀 按照硫酸铵沉淀表 , 对样品浸提液添加硫
酸铵至 30%, 45%, 60%, 75%饱和浓度 , 分别测定各浓度下的体
积 、抑制活性和蛋白浓度。 pH值为 6.0的样品浸提液实验结果
见表 1, pH值为 8.0的样品浸提液实验结果见表 2。
表 1　pH 6.0条件下硫酸铵分级沉淀 TI的结果
饱和度 体积V/ml
蛋白浓度
C/mg· ml-1
活力
C/U· ml-1
总蛋白
m/mg
总活力
C/U
比活力
C/U· mg-1
0% ～ 30% 8.0 0.36 2.13 2.88 17.04 5.92
30% ～ 45% 15.3 0.21 5.36 3.21 82.01 25.62
45% ～ 60% 18.7 0.48 23.45 9.46 438.52 46.35
60% ～ 75% 10.6 0.28 4.68 2.97 49.61 16.70
　　硫酸铵分级沉淀前样品液 pH6.0,体积 20 ml,蛋白质浓度 1.23mg· ml-1 ,活
性 52.32U· ml-1
表 2　pH 8.0条件下硫酸铵分级沉淀 TI的结果
饱和度 体积V/ml
蛋白浓度
C/mg· ml-1
活力
C/U· ml-1
总蛋白
m/mg
总活力
C/U
比活力
C/U· mg-1
0% ～ 30% 9.4 0.32 2.64 3.01 24.82 8.25
30% ～ 45% 13.8 0.28 3.53 3.86 48.71 12.62
45% ～ 60% 16.5 0.51 30.26 8.42 499.29 59.30
60% ～ 75% 14.4 0.37 8.71 5.33 125.42 23.53
　　硫酸铵分级沉淀前样品液 pH8.0,体积 20 ml,蛋白质浓度 1.37mg· ml-1 ,活
性 58.75U· ml-1
从图 1可以看出 , 两种不同 pH体系活性析出均集中于 30%
～ 75%饱和度 , 但 45% ～ 60%饱和度下比活力最高 , 且 pH8.0体
系时比活力大。因此 , 在以后的纯化过程中 , 均采用 pH8.0溶液
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体系对样品液进行硫酸铵分级沉淀 , 加(NH4)2SO4至 40%饱和
度 , 以除去碱性或中性杂蛋白。再加(NH4)2SO4至 60%饱和度 ,
收集沉淀 , 溶解透析供下步离子交换层析用。抑制剂的析出在
pH6.0体系比 pH8.0体系要早 , 这说明抑制剂可能是一种酸性
蛋白。
图 1　不同 pH溶液体系下硫酸铵沉淀蛋白的抑制活力
3.2　DEAE-52离子交换分离纯化 取 pH8.0Tris-HCl缓冲液
透析后的粗提液 5 ml,上 DEAE-52离子交换柱(ф 2.5 cm×15
cm),流速为 0.75ml/min, 以 50 ml缓冲液洗脱 , 使样品液压实 ,
再分别用由缓冲液配制的 60 ～ 400 mmolNaCl溶液进行梯度洗
脱 , 所得各管洗脱液(每管收集 3 ml)在紫外光 280 nm下测其吸
光度 , 检测蛋白含量 ,其梯度洗脱曲线见图 2。
图 2　梯度洗脱曲线
根据图 2梯度洗脱曲线 ,选取 OD值较高的收集管 , 即蛋白
质含量较高的收集液 ,用方法 “ 2.1”进行胰蛋白酶活性检测。结
果见图 3。
图 3　HCTI活性曲线
由图 3可知 , 在 55 ～ 70号试管具有 HCTI活性 , 以 60 ～ 63
号活性最高。收集 60号试管及附近活性较高的试管保存 , 进一
步处理后进行 HCTI相对分子量的测定。洗脱液的浓度梯度与
试管号的对应关系见表 3。
3.3　鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的相对分子量的测定 DEAE-52
离子交换柱分离纯化后 HCTI液的活性峰经 SDS-聚丙烯酰胺凝
胶电泳。结果如图 4。
表 3　洗脱液的浓度梯度与试管号的对应关系
洗脱液浓度梯度 试管号 用量 /ml
60mmol/LNaCl溶液 1 ～ 17 50
120mmol/LNaCl溶液 18～ 34 50
180mmol/LNaCl溶液 35～ 51 50
240mmol/LNaCl溶液 52～ 68 50
300mmol/LNaCl溶液 69～ 85 50
400mmol/LNaCl溶液 86 ～ 100 50
Mark蛋白带从上到下依次为:磷酸酶 b(97kDa)、
牛血清蛋白(66kDa)、卵清蛋白(44kDa)、碳酸苷酶(29kDa)、
溶菌酶(14kDa);1.抑制剂粗提蛋白　2.经 DEAE-52纯化后的活性组分
图 4　HCTI的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图
由电泳图谱上测定的标准蛋白相对迁移率及其分子量 ,待测
蛋白的迁移率为 0.530。 经计算机处理数据后 , 得回归方程:
LogY=-1.355X+5.165 3如图 5所示 ,将待测的蛋白相对迁移
率带入方程 ,计算出 HCTI的分子量约为 28kDa。
□表示标准样 Marker;△代表待测蛋白;
标准蛋白的蛋白带从上到下依次为:磷酸酶 b(97kDa)、
牛血清蛋白(66kDa)、卵清蛋白(44kDa)、
碳酸苷酶(29kDa)、溶菌酶(14kDa)
图 5　蛋白质标准曲线及待测酶蛋白分子量
4　讨论
本实验在粗提过程中采用分级盐析法除掉了部分杂蛋白 , 分
离过程中用到了 DEAE-52离子交换层析法 , 并检测到活性峰。
说明分级盐析发挥了一定作用 , 从而简化了分离纯化过程 , 测得
HCTI分子量约为 28kDa。为该胰蛋白酶抑制剂的进一步深入研
究奠定了一定的理论基础。
参考文献:
[ 1 ] 　刘同祥 ,牛建昭 ,杜旭东 ,等.具有蛋白酶抑制剂活性成分中药的筛
选 [ J] .中国中药杂志 , 2007, 32 (7):643.
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剂的提取工艺 [ J].时珍国医国药 , 2007, 18(10):2337.
[ 3 ] 　杜旭东 ,刘同祥 ,张宗申 ,等.超声波法提取胰蛋白酶抑制剂 [ J] .时
珍国医国药 , 2008, 19(3):525.
[ 4 ] 　康　庄 , 王　竞 ,杜林方.菠菜种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与
部分性质研究 [ J].天然产物研究与开发 , 2005, 17(2):143.
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