全 文 ：生 物 灾 害 科 学 2012, 35(3): 258－260 http://xuebao.jxau.edu.cn
Biological Disaster Science, Vol. 35, No. 3, 2012 swzhkx@163.com

收稿日期：2012-08-15
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30960213）
作者简介：梁艳，女，硕士，主要从事植物病害综合治理研究；* 通信作者：蒋军喜，男，江西湖口人，教授，博士，主
要从事植物病害综合治理研究，E-mail：jxjiang64115@yahoo.com.cn。
DOI：10.3969/j.issn.2095-3704.2012.03.006
车前草穗枯病菌分子鉴定
梁 艳 1，涂怀妹 2，崔朝宇 1，蒋军喜 1*
（1. 江西农业大学 农学院，江西 南昌 330045；2. 江西省安义县农业局，江西 安义 330500）

摘要：采用真核生物通用引物 ITS1/ITS4，对来自江西省吉安县 2 个车前草穗枯病菌菌株进行 rDNA-ITS 区段的
PCR 扩增，对扩增产物进行测序，结果获得 2 个长度均为 579 nt 且序列完全一致的 rDNA-ITS 序列，该序列与
GenBank 中当归间座壳菌(Diaporthe angelicae)及其无性态拟茎点霉菌(Phomopsis subordinaria)对应序列的同源性
高达 99.0%，根据以 rDNA-ITS 序列同源性大小划分种类的标准，将车前草穗枯病菌鉴定为当归间座壳菌。
关键词：车前草穗枯病；当归间座壳菌；分子鉴定
中图分类号：S432.1 文献标志码：A 文章编号：2095－3704（2012）03－0258－03

Molecular Identification of Pathogen of Plantain Head Blight
LIANG Yan1, TU Huai-mei2, CUI Chao-yu1, JIANG Jun-xi1*
(1. College of Agronomy, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China;
2. Agricultural Bureau of An’yi County, An’yi 330500, China)
Abstract: In the paper, two isolates of pathogen of plantain head blight from Ji’an county in Jiangxi province
were molecularly identified. RDNA-ITS region of each of the two isolates was amplified by PCR, and the PCR
products were sequenced. Both of them are 579 nt in length, and they have a consensus sequence. The sequence
shares 99.0% homology with sequence of either Diaporthe angelicae or its anamorph Phomopsis subordinaria.
Based on the criterion of rDNA-ITS sequence homology in fungus species classification, pathogen of plantain
head blight was identified as Diaporthe angelicae.
Key words: plantain head blight; Diaporthe angelicae; molecular identification

车前草穗枯病(plantain head blight)是危害车前
草(Plantago asiatica L.)生长最严重的病害之一[1-2]，
该病主要为害穗部和叶片，造成病部迅速坏死直至
全株枯死现象，发病严重时常常导致全田枯死，颗
粒无收。2004-2005年，我们对该病病原进行了病菌
分离和形态鉴定，初步鉴定为一种壳梭孢属真菌
(Fusicoccum sp.)[3]。近来，我们通过测定核糖体基
因转录间隔区（rDNA-ITS）序列对该病菌进行了分
子鉴定，结果发现该病菌不是壳梭孢属真菌，而是
间座壳属（无性态为拟茎点属）真菌。根据分子鉴
定结果以及重新对形态观察结果进行分析，我们认
为车前草穗枯病的病原应确定为间座壳菌，之前将
其病原鉴定为壳梭孢属真菌的结论是错误的，需要
纠正。现将对其分子鉴定结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 菌株
供试菌株2个，即Yonghe-1和Yonghe-2，分别
从江西省吉安县永和镇林洲村不同自然村田块的车
前草穗枯病病株中分离得到，前者分自病穗，后者
2012 年第 3 期 梁艳等：车前草穗枯病菌分子鉴定 ·259·
分自病叶。
1.2 寡聚核苷酸引物
采用真核生物的通用引物ITS1和ITS4[4]，扩增
车前草穗枯病菌的rDNA-ITS区段。
ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3
ITS4：5- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3
引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.3 病菌培养
将4 ℃冰箱中保存的供试菌株移至PSA平板上
进行活化，25 ℃黑暗条件下培养2~3 d，从菌落边
缘切取直径2~3 mm的菌饼，移至盛有150 mL PS液
体培养基的三角瓶中，每瓶5个菌饼，25 ℃振荡培
养4~5 d。
1.4 菌丝预处理
将液体培养菌丝用双层尼龙网过滤，用无菌水
洗涤2次，以去除菌丝内的培养液，收集菌丝，吸干
水分，用液氮研磨成粉末，备用。
1.5 车前草穗枯病菌 DNA 提取
取0.05 g研磨好的菌丝样品，加入 1 mL提取液
(50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、100 mmol/L
EDTA)，振荡混匀，再加入100 μL 20%SDS混匀，
然后将离心管置于摇床内37 ℃缓慢摇动1 h，每管加
入5 mol/L NaC1溶液150 μL，缓慢混匀，加入130 μL
CTAB/NaC1溶液(10%CTAB、0.7 mol/L NaCl)，混
匀，65 ℃水浴20 min，每隔5 min摇动1次，后冷却
置室温，加人等体积氯仿：异戊醇，在摇床内剧烈
摇动5 min，10 000 r/min离心12 min，上清12 000
r/min离心5 min；上清液移入新管中，加入等体积预
冷的异丙醇，-20 ℃放置半小时，10 000 r/min离心
12 min；弃上清液，倒置使管壁液体流尽，70%乙
醇洗沉淀，室温放置干燥5~10 min，溶于20 μL dd
H2O中，加入RNase A(10 μg/μL)1 μL，37 ℃水浴30
min，-20 ℃保存备用。
1.6 rDNA-ITS 区段的 PCR 扩增
PCR反应在20 μL体系中进行，含DNA模板1
μL，10 pmol/μL上、下游引物各2 μL，10×PCR Buffer
2 μL，25 mmol/L MgCl2 2 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，
1U/μL Taq DNA聚合酶0.4 μL，dd H2O 8.6 μL。扩增
程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，55℃
退火30 s，72 ℃延伸l min，30个循环；72 ℃补平10
min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.7 PCR 产物测序及序列同源性比较
回收PCR产物，将产物送至上海生工生物工程
有限公司进行序列测定。所得序列递交NCBI网站进
行核苷酸序列同源性搜索，根据同源性大小对车前
草穗枯病菌进行种类鉴定。
2 结果与分析
2.1 车前草穗枯病菌 rDNA-ITS 区段的 PCR 扩增
采用真核生物通用引物ITS1/ITS4扩增车前草
穂枯病菌rDNA-ITS序列，结果从供试的车前草穗枯
病菌2个菌株中均扩增出一条长约550 bp的DNA片
段(图-1)。
2.2 车前草穗枯病 ITS 序列测定
将PCR产物进行测序，获得长度为579 nt的
rDNA-ITS序列，2个菌株序列完全一致，序列依次
覆盖部分18 S、ITS1、5.8 S、ITS2和部分28 S等5个
区段，该序列在Genebank中的登录号为EU512922。
2.3 车前草穗枯病 ITS 序列同源性比较
利用 blsat 程序，将测定的 579 nt rDNA-ITS 序
列与 GenBank 中已有序列进行同源性比较，发现车
前草穂枯病菌与间座壳属(Diaporthe)中的当归间座
壳菌(D. angelicae)以及与间座壳属的无性态拟茎点
属(Phomopsis)中的拟茎点霉菌(P. subordinaria)的核
苷酸序列同源性最高，均达到 99%。
3 讨论
ITS 序列是介于 18S rDNA、5.8S rDNA 和 28S
rDNA 之间的区域，该区域进化速度较编码区快[4]。
已有的研究表明 ITS 在真菌的种间存在着丰富的变
异，而在种内不同菌株间却高度保守，其序列同源
性可作为真菌鉴定的重要依据 [5-8]。本研究获得了
车前草穂枯病菌 579 nt rDNA-ITS 序列，该序列与
当归间座壳菌和拟茎点霉菌的序列同源性最高，达
99%，如此高的同源性足可以将车前草穗枯病菌鉴
定为当归间座壳菌或拟茎点霉菌。当归间座壳菌与
茎点霉菌实际上为同一种真菌，它们分别为该菌的
有性世代和无性世代。当归间座壳菌与拟茎点霉菌
目前在国内尚未见报道，但前者已在奥地利、葡萄
牙有发生报道，主要危害中草药茴香，后者在荷兰、
芬兰、德国、波兰、新西兰等国家有发生报道，引
起长叶车前(Plantago lanceolata)穗枯病[9-11]，看来车
前草穗枯病菌很可能是一种世界性分布和多寄主的
病原菌。
·260· 生 物 灾 害 科 学 第 35 卷第 3 期















1. DNA Marker；2. 菌株 Yonghe-1; 3. 菌株 Yonghe-2; 4. 空白对照
图 1 车前草穗枯病菌 rDNA-ITS 序列 PCR 扩增电泳图
本文将车前草穗枯病菌的 rDNA-ITS 序列与壳
梭孢属真菌的对应序列也进行了同源性比较，结果
其同源性只有 72%，因此，可以肯定车前草穗枯病
菌不属于壳梭孢属真菌。之前，我们主要是根据车
前草穗枯病菌在分生孢子器中产生梭形的分生孢
子，分生孢子形状及大小符合壳梭孢属真菌的描述，
而将车前草穗枯病菌鉴定为壳梭孢属真菌，未将其
鉴定为拟茎点霉菌的原因是通常认为拟茎点霉菌能
产生梭形（或椭圆形）和钩丝状两种类型的孢子。
通过大量查阅文献后发现，虽然大多数拟茎点霉菌
产生椭圆形和钩丝状两种类型分生孢子，但也有部
分种只产生椭圆形分生孢子。据此可知，车前草穗
枯病菌很可能就属于只产生椭圆形分生孢子拟茎点
霉菌的那一类。
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