全 文 ：　林业科技开发　2008年第 22卷第 2期 19　
金丝慈竹愈伤组织培养及植株再生研究
吴涛 1 ,卢娟娟2 ,丁雨龙 1＊
(1.南京林业大学竹类研究所 ,南京 210037;2.新疆农业大学林学院)
摘　要:通过正交试验筛选出金丝慈竹愈伤诱导的最佳配方 MS+2, 4-D5mg/L+6-BA(0.2 ～ 0.5)mg/L;记录了
愈伤发生过程中不同类型愈伤的发生时间及生长状态 ,并通过对健康的 I型愈伤组织进行增殖培养筛选出最佳增
殖配方 MS+2, 4-D(2 ～ 3mg/L)+6-BA0.2mg/L+NAA 0.5mg/L。通过对增殖后健康的 I型愈伤组织的诱导分
化 ,实现了器官再生 , 并获得最佳芽体分化配方 MS+6-BA5mg/L+NAA0.2mg/L及不定根系发生诱导配方 MS+6
-BA1mg/L+NAA(0.5 ～ 2mg/L)。
关键词:金丝慈竹;愈伤培养;植株再生
APrimaryStudyonCalusInductionandPlantRegenerationofBambusaafinis`viridiflavus ∥WU
Tao, LUJuan-juan, DINGYu-long
Abstract:ThecalusinductioncultureandplantregenerationofBambusaafinis`viridiflavus wereinvestigatedinthispa-
per.TheresultsshowedthattheoptimummediumforcallusinductionculturewereMS+2, 4-D5mg/L+6-BA(0.2 ～
0.5)mg/L.Thedifferenttypesofcalluswereobservedduringthedifferentculturestages, amongwhichthetypeIcalus
couldbefurtherinducedwiththeoptimummediumofMS+2, 4-D(2 ～ 3mg/L)+6-BA0.2mg/L+NAA0.5mg/Lfor
callusmultiplication.Accordingtotheexperiment, itwasfoundthatthebetermediumofbuddiferentiationwasMS+6-
BA5mg/L+NAA0.2mg/L, andtheoptimummediaofadventitiousrootwasMS+6-BA1mg/L+NAA(0.5 ～ 2)mg/L.
Keywords:Bambusaaffinis` viridiflavus ;Calusinduction;Plantregeneration
Firstauthor saddress:BambooResearchInstitute, NanjingForestryUniversity, 210037, Nanjing, China
收稿日期:2007-12-10
基金项目:国家 “十一五”科技支撑课题资助(编号:2006BAD19B02)。
第一作者简介:吴涛(1982-),女 ,硕士生 ,研究方向为植物发育学。
通讯作者:丁雨龙 ,男 ,教授。 E-mail:ylding@njfu.com.cn
　　竹子是一类特殊的经济植物 ,它很少开花结籽 ,
最常见的传统繁育方式是母竹分株或者利用竹秆 、竹
枝扦插 ,这些方法存在消耗种竹多 、种苗运输不方便 、
劳动强度大 、繁殖系数低等问题 ,很大程度上制约了
竹林资源的有效利用 。针对这些问题 ,随着对竹类研
究的深化 ,人们开始研究竹类植物新的繁殖方法 ,其
中最直观有效的就是竹类组织培养获得再生植株 。
对于竹类植物的组织培养 ,最早开始于 1968年 Alex-
ander和 Rao关于成熟种胚离体培养的报道 [ 1] 。此
后 ,对于竹类植物的离体快繁研究内容层出不穷 ,对
于竹类植物的快速繁殖技术逐渐受到重视。 1975年
Tseng等首次从竹叶分离出原生质体 [ 2] 。 1982年
Metha等 、1985年 Rao等先后分别对印度箣竹(Bam-
busaarundinacea)和牡竹(Dendrocalamusstrictus)种子
成熟胚进行诱导 , Metha直接从印度箣竹种子获得胚
起源的愈伤组织 , 并获得再生植株 [ 3] 。 1983年 ,
Huang和 Murashige以簕竹属 (Bambusa)、刚竹属
(Phylostachys)、箬竹属 (Indocalamus)和箣竹属
(Bambusa)生长活跃的侧芽和顶芽的芽尖作外植体 ,
对诱导愈伤组织产生的条件作了详细的研究 [ 4] 。此
后的几十年间 ,国内外先后对 18个属 70多个竹种进
行过组织培养研究 ,其中的 60种获得成功。自 90年
代起 ,试管苗开花诱导成为竹子组织培养研究新的热
点 ,并有一些成功的报道[ 5 ～ 7] 。 2000年 ,吴益民等对
孝顺竹(Bambusamultiplex)的顶芽和节侧芽外植体
进行诱导获得愈伤组织 ,并建立悬浮细胞系 [ 7] 。 2002
年 ,王光萍等以金镶玉竹等 11种观赏竹新萌发的嫩
芽为材料 ,进行组织培养 ,获得了 7种观赏竹的再生
植株[ 8] 。近年来 ,就目前已有的报道来看 ,不少关于
竹类组织培养的最新报道都将侧重点放在了愈伤组
织诱导进而得到植株再生方面[ 9 ～ 14] ,其中也不乏通
过愈伤组织实现器官发生进而实现植株再生的 。金
丝慈竹(Bambusaafinis`viridiflavus ),慈竹属 ,竹秆
分枝一侧具浅黄色条纹 ,为优美的庭园观赏竹种 ,南
亚热带北部或中亚热带地区 ,如四川 ,湖南 ,江西北部
等均有分布。南京林业大学竹类研究所从各产地中
筛选出一个耐寒性较好的种质 ,经过 8a的栽培观
察 ,该种质在南京可以安全露天越冬 , 竹秆直径达
6cm、高达 12m, 秆先端弯曲下垂 , 形态极其优美 。
　应用研究
20　 林业科技开发　2008年第 22卷第 2期
与长江中下游地区常见的丛生观赏竹———孝顺竹相
比 ,观赏价值更高 。鉴于传统繁育方式所需耗费大量
人力物力 ,本实验旨在建立由愈伤组织培养进行植株
再生的一个完整体系 ,为金丝慈竹新种质繁育开辟一
条新的途径 。
1　材料与方法
供实验的材料来自南京林业大学竹类研究所竹
子快繁实验室中的快繁无菌苗 。选取无菌快繁体系
中健康茁壮的无菌苗 ,以试管苗无污染 、无玻璃化现
象 、体系稳定 、繁育出的新芽饱满为最好。具体步骤:
(1)将快繁无菌体系竹苗发出的饱满新芽由原
植株体上切下 ,切割时保证芽体饱满 ,用无菌水清洗
去原有培养基 ,将芽体外部的较老箨片剥去 ,留下芽
体和幼嫩的箨片 ,然后将材料接种到愈伤诱导培养基
上进行愈伤诱导;
(2)根据第一阶段诱导出的不同类型的愈伤组
织 ,选取合适类型的愈伤接种到愈伤增殖培养基上进
行增殖;
(3)将增殖后的健康的愈伤组织接种到诱导分
化培养基上进行器官诱导分化 ,因竹类愈伤组织诱导
极易生根 ,故在此以诱导芽体为主;
(4)待实现愈伤组织器官发生后 ,将已有分化出
的芽体从愈伤组织上切下 ,接种到生根培养基上进行
生根诱导 ,根发生后移植到基质中进行炼苗 ,实现再
生体系的完整化 。
进行上述操作之后 ,隔日进行观察 ,记录愈伤组
织诱导率和生长状态 ,并对愈伤生长状态进行评价 ,
采用正交实验对各阶段所需的最佳激素配比进行分
析 ,筛选出最佳的愈伤诱导配方 ,愈伤增殖配方 ,诱导
分化配方和诱导生根配方 。
因金丝慈竹稳定的快繁(以芽繁芽)体系培养基
为 MS培养基 ,为维持芽体的稳定 ,故以上实验中的
基础培养基都为 MS培养基 ,蔗糖浓度均为 3%,愈伤
诱导阶段和增殖阶段均为暗培养 ,诱导分化阶段前期
为暗培养 ,后期和诱导生根阶段 ,每日辅助光照 10h,
光照强度约 1 600lx。防褐化剂采用抗坏血酸 ,温度
控制为 25 ～ 28℃。
2　结果与分析
2.1　愈伤组织的诱导
以激素 2, 4-D(0.5 ～ 7)mg/L分别与 KT(0.1 ～
1)mg/L和 BA(0.1 ～ 1)mg/L进行配比组合 ,通过实
验观察可以得出随着 2, 4-D浓度的升高 ,愈伤组织
的发生率和致密程度都呈上升趋势 ,愈伤诱导率最高
可达 100%。但当超过一定量的时候 ,诱导而出的愈
伤组织就会褐化死亡。 2, 4-D浓度偏低时 ,基本不出
愈 ,或者愈伤比较水渍化且具粘性 ,不利于愈伤的进
一步增殖和分化 ,经过一段时间的继代培养后就会褐
化死亡 。 2 , 4-D和 6-BA两种激素的配比对于愈伤
组织类型(见图 1)的决定和发生率都起着重要作用 。
当 2, 4-D浓度太低时愈伤发生时间延长 ,愈伤粘性 ,
量少且容易发生水渍化;随着浓度增加 ,愈伤粘性程
度逐渐降低;但若 6-BA浓度过高时 ,就会加速愈伤
的分化 ,存在发出的愈伤还未进行增殖培养就已分化
的现象 ,不利于愈伤状态的统一 。
就已发生的愈伤来看 ,通过这几种激素配比培养
诱导出的愈伤组织主要可分为 3种类型:I型为增殖
和分化的最佳愈伤 ,松散颗粒状 ,结构致密 ,色泽鲜
亮 ,多为黄绿色;II型为白色或浅褐色的粘性愈伤 ,此
类愈伤在出愈的最初阶段多易发生 ,愈伤为团状 ,水
渍化 ,无法分离;II型为白色半透明愈伤 ,其含水率
很高 ,以松散状态存在 。此 3类愈伤 , II型愈伤多发
生于诱导最初阶段 , I型和 II型愈伤多在其后产生 ,
根据激素配比组合不同 ,产生出不同的愈伤 。总体来
说 ,除 I型愈伤外其他两种愈伤褐化程度都较轻 ,尤
其是 I型愈伤 ,基本无褐化现象 ,是状态最好的愈伤 ,
因此判定金丝慈竹愈伤诱导的最佳激素配比组合为
2, 4-D5mg/L+6-BA(0.2 ～ 0.5)mg/L或者 2, 4-D
5mg/L+KT1mg/L。
2.2　愈伤组织的增殖
愈伤组织的增殖是决定是否能实现愈伤状态的
初步统一化比较关键的一个阶段。以上实验发生的
3种类型愈伤 ,因 II类型愈伤到愈伤发生后期阶段基
本都已褐化 ,故不在考虑到增殖范围。将剩余两种类
型的愈伤接种到增殖培养基上进行增殖培养。
在增殖阶段 ,愈伤对 2, 4-D的依赖不再像诱导
阶段一样高 ,但仍需维持在一定浓度 ,低浓度的 6-BA
和适中浓度的 NAA对愈伤的增殖都有良好的效果 。
在 2, 4-D(1 ～ 5)mg/L与 6-BA(0.2, 1)mg/L以及
NAA(0.1 ～ 0.5)mg/L激素浓度范围的配比实验下 , I
型愈伤和 II型愈伤都有所增殖 ,且所增殖的愈伤都
维持在原状态 ,基本没有分化现象 。 I型愈伤所增殖
的愈伤黄白色 ,致密 ,含水率相对其他两种愈伤来说
较低 ,无水渍化现象 ,结构致密 ,用镊子拨开可分散成
颗粒状;II型白色松散愈伤增殖后仍然为白色松散
状 ,含水率高 ,用镊子轻轻挤压会有水分产生 ,愈伤松
散成粉团状。
应用研究　
　林业科技开发　2008年第 22卷第 2期 21　
1.愈伤诱导起的金丝慈竹芽体 ,示刚出愈的愈伤;2.示 I型愈伤 ,黄绿色 ,致密 ,可剥落为颗粒状;3.示 II型愈伤 ,白色或浅褐色的粘性愈伤 ,团状 ,
水渍化;4.示 II型白色半透明愈伤 ,可见其含水率很高 ,愈伤松散;5.体视解剖镜下的 I型愈伤 ,示开始分化的芽点;6.开始分化的愈伤长出芽体;
7.示愈伤芽丛产生的同时 ,其余部分的愈伤褐化死亡;8.示分化出的芽丛;9、10.植株体根系发生;11.炼苗后移栽成活。
图 1　愈伤诱导及再生体系
　　当激素配比在 2, 4-D(2 ～ 3mg/L)+6-BA
0.2mg/L+NAA0.5mg/L这个浓度范围时 ,愈伤增
殖倍数可以维持在原有体积 2 ～ 3倍 ,最高可达 4倍 ,
并且可以维持愈伤基本处于发育及分化较为统一的
最佳状态。
2.3　诱导器官分化
愈伤组织的分化是通过愈伤组织的培养实现植株
再生的重要步骤 ,包括诱导芽体的产生和根系的发生。
选取增殖情况良好的 I型愈伤将其植入诱导分化培养
基 ,诱导芽体或者体胚产生的培养基 ,诱导植株再生。
在芽丛的诱导阶段 ,对于 6-BA和 NAA两种激
素配比较为敏感 ,故实验浓度范围设定在 6-BA(1 ～
6)mg/L和 NAA(0.1 ～ 1)mg/L。健康 I型愈伤诱导
植株分化 30d左右都有芽丛产生 ,但当 NAA用量偏高
以后 ,容易诱发根的产生 ,根据实验观察 ,当愈伤组织
在产生芽之前先产生根 ,愈伤块很快就会褐化死亡。
因此 ,在诱导愈伤进行分化时应尽量控制 NAA的用
量。根据实验 ,诱导金丝慈竹愈伤块分化出再生植株
最佳的配方为 MS+6-BA5mg/L+NAA0.2mg/L。
愈伤诱导分化过程中 ,褐化现象严重 ,有的愈伤
块严重褐化死亡 ,对于激素用量非常敏感。且在愈伤
产生芽丛的同时 ,会有部分由黄转绿的绿色点状愈伤
　应用研究
22　 林业科技开发　2008年第 22卷第 2期
块剥落 ,疑似体胚 ,但需进一步进行的切片和电镜观
察佐证 。
2.4　再生植株诱导生根
诱导再生植株生根 ,是实现无菌体系循环 ,实现
大棚移栽的必要步骤。将诱导分化出的健康芽丛长
成的小植株转入生根培养基进行生根诱导 ,激素浓度
范围设定在 NAA(0.5 ～ 2)mg/L和 6-BA1mg/L。
金丝慈竹再生植株诱导生根是个相对其他过程
较为容易的步骤 ,多数植株对生根配方均有反应 ,区
别只在于发根量的多少及根系的状态 ,当 NAA浓度
达到一定量(≥0.5mg/L)后 ,植株的根系都有所发
生 ,最高发根率可达 100%。在 NAA的基础上再添
加 6-BA则会促进发根量的增加。根据发根量 ,再生
植株诱导生根最佳配方为 MS+6-BA1mg/L+NAA
(0.5 ～ 2)mg/L。
将生根后的健康植株(根系达 10条以上)由培
养瓶取出置于自然散射光 、有一定昼夜温差的实验室
内 , 3 ～ 5d后除去封口膜 ,再炼苗 3 ～ 5d,从瓶中取出
竹苗 ,洗净培养基 ,寄栽于育苗箱的基质上(蛭石∶珍
珠岩∶砂壤土 =1∶1∶1),浇足定根水 ,定期喷洒营养
液 ,用塑料膜调节温度 、湿度和光照 ,后统计成活率及
竹苗生长状况 ,待新发健壮根系后移往大棚。
3　讨　论
(1)金丝慈竹的愈伤组织诱导单纯从激素因素
来考虑 ,可以通过 2 , 4-D和 6-BA、KT组合来实现 ,
实验中可以产生 3种不同类型的愈伤:I型为增殖和
分化的最佳愈伤 ,松散颗粒状 ,结构致密 ,色泽鲜亮 ,
多为黄绿色;I型为白色或浅褐色的粘性愈伤 ,此类
愈伤在出愈的最初阶段多易发生 ,愈伤为团状 ,水渍
化 ,无法分离;II型为白色半透明愈伤 ,其含水率很
高 ,以松散状态存在 。其中 I型愈伤是诱导增殖和进
一步分化的优质愈伤 ,在适当的继代培养后 ,愈伤可以
进一步增殖 ,并且诱导器官发生 ,从而形成新的植株。
通过对新植株的移栽 ,完成无菌体系向栽培体系转化。
(2)此次实验中通过对金丝慈竹愈伤组织的诱
导 ,增殖并实现植株体再生 ,完成了植物体组织培养
脱分化到再分化的整个过程 ,就其本身而言是具有生
物学意义。建立竹子愈伤诱导再生植株体系 ,不仅为
新竹繁育开辟出一条新的途径 ,同时也有助于竹林育
种研究 。世界范围内基因工程育种在禾本科进行了
广泛的应用研究 ,但绝大多数集中在禾亚科的农作物
中 ,同为禾本科的竹亚科几乎没有基因工程育种成功
的报道 。其原因是多方面的 ,竹子主要分布在发展
中国家 ,经济因素 ,技术因素 ,环境因素都起极大的制
约作用。组织培养是基因工程育种的基础 ,愈伤组织
诱导和通过体细胞胚胎获得再生植株已成为竹子遗传
改良的技术关键。通过对愈伤发育发生阶段的统一 ,
进而为竹类基因工程育种后续阶段提供适宜的材料 ,
使此次实验在育种方面又具有了另一番重要的意义。
参考文献
[ 1] AlexanderMP, RaoTC.Invitrocultureofbambooembryos[ J] .Cur
Sci, 1968, 37:415.
[ 2] TsengTC, LiuDF, ShaioSY.Isolationofprotoplastsfromcrop
plants[ J] .BotBulAcadmiaSinica, 1975(16):55-60.
[ 3] MethaU, RaoHY, MohanR, etal.Somticembryogenesisinbamboo
[J].PlantTissueCelCult, 1982(Proceeding5thInternationalCorg):
109-110.
[ 4] RaoU, RaoI.V.Ramanuja, NarangV.Somticembryogenesisandre-
generationofplantsinthebamboo[ J].PlantCelReports, 1985(4):
191-194.
[ 5] NadgaudaRS, ParasharamiVA, MascrenhasAF.Precociousflower-
ingandseedingbehaviourintissue-culturedbamboos[ J] .Nature,
1990, 344(6264):335-336.
[ 6]张光楚 ,陈富枢 ,王裕霞 , 等.麻竹离体快速繁殖技术的研究 [ J] .
竹子研究汇刊 , 1993, 12(4):7-15.
[ 7]吴益民 ,边红武 , 王君晖 , 等.竹子悬浮细胞系的建立和组织培养
试管苗移栽观察 [ J] .竹子研究汇刊 , 2000, 19(1):52-55.
[ 8]王光萍 ,丁雨龙.几种观赏竹种组织培养研究 [ J] .竹子研究汇刊.
2002, 21(2):5-9.
[ 9] RamanayakeSM.Organogenesisincalusderivedfromanadultgiant
bamboo(DendrocalamusgiganteusWal.exMunro)[ J] .Scientia
Horticulturae, 2003(98):195-200.
[ 10]韩文军 ,周宏 ,何钢.毛竹愈伤组织培养中褐变现象的研究 [ J] .
湖南林业科技 , 2004, 31(3):4-6.
[ 11]赵光俊.试管内竹类之器官发生与植株再生 [ R].台湾大学园艺
学研究所 2004年度作物组专题讨论, 2004.
[ 12]周宏 ,何钢.毛竹愈伤组织培养研究 [ J] .湖南林业科技 , 2005, 32
(4):41-42.
[ 13]顾小平 ,苏梦云 ,岳晋军 ,等.几种丛生竹愈伤组织诱导与防褐变
技术研究[ J] .林业科技开发 , 2006, 19(1):75-78.
[ 14] SavitaG, AnilS.Somaticembryogenesisanditsconversionintoplant-
letsinamultipurposebamboo, DendrocalamushamiltoniNeesetArn.
ExMunro[ J] .CurentScience, 2002, 83(7):885-890.
(责任编辑　周贤军)
应用研究