全 文 ：真 菌 学 报 12
A e t o M 夕e o l鳍i e a
( z ) : 1 4 5一 1 5 1 , 1 9 9 3
5 1介 i e a
玉米黑粉菌 D N A 载体的构建和
它的原生质球的转化和再生
邓大给 田 波 陆师义
(中国科学院微生物研究所 , 北京 1。。。8。 )
摘要 我们用玉米黑粉菌 ( U , ` i l a : o , a , d i , ) 热休克基因 ( H e a t s五o c k g e n e , h s p 7 0 ) 的
启动子和终止子与新霉素磷酸转移酶基因相连 , 构建成了有效的双功能质粒 p D IL (在 E 。
` 口 il 中用 A o p 作为选择标记 , 在玉米黑粉菌中用新霉素作为选择标记 ) 。 以分离的一株新霉
素敏感的玉米黑粉菌作为受体菌 , 用构建的 p D L I 质粒作为供体 D N A , 对影响受体菌原生
质球的形成条件 (培养基 、 菌龄 、 各种酶、 酶的浓度 、 作用时间和渗透压稳定剂 ) 、 再生条件和
D N A 转化条件进行了初步研究。 对数前中期收集的菌体 ,以 s m g /mI 真菌溶壁酶处理 30 分
钟左右 , 90 肠 都形成原生质球 ,其再生率为 60 一 8 。% , 转化率为 3 0 一 10 0 转化子 /邢 D N A 。
随机选出 2 , 个转化子 , D N A 杂交都为阳性 。 分析 d o卜 b l o t 和 s o u t h e r o b l o t D N A 杂交结
果 ,发现质粒在细胞中以整合形式存在 ,一个细胞可以有多拷贝的整合质粒 , 质粒可能以非完
全同源性的重组形式 ,参人性地整合进染色体中。
关键词 玉米黑粉菌 ; D N A 载体的构建 ;原生质球转化和再生
丝状真菌有 6 0 0 0 0 多种 , 在人类健康 、农业生产 、 食品发酵 、 抗生素生产和生产工业用
酶等方面有重要的作用 。 D N A 重组技术用于丝状真菌的研究 ,变革了真菌经典遗传学分
析 , 使得人们能够研究真菌基因的精细结构和表达 , 以及基因组的组成 。
玉米黑粉菌是玉米黑粉病的病原菌 ,在分类上属于黑粉菌属 。 由于它能在基本培养
基上生长 。 在实验室条件下 ,有单倍体和双倍体生长时期。 单倍体的次生抱子在培养基
上似酵母 ( y e a s t 一 l i k e ) 生长。 因此 ,长期以来 , 人们把它作为一个遗传学研究的理想材
料 , 并且积累了丰富的经典遗传学和生物化学知识 ,为进一步用现代生物学技术研究它的
基因结构 、 基因相互作用以及病原菌与寄主的相互作用打下了基础 ,也为研究其它担子菌
亚门的真菌提供 T 一个模型 ( H o l l i d a y , 1 9 7 4 ; K m i e e & H 。 11。 m a n , 1 9 5 6 ) 。
为 了用基因体外重组的方法研究玉米黑粉菌的分化发育和与侵染有关的基因 , 首先
必须建立一个有效的基因转化系统 。 虽然玉米黑粉菌致密的细胞壁阻止了外源 D N A 的
转化 ,但通过酶法除去细胞壁 , 形成原生质球 , 在有氯化钙和聚乙二醇存在下 , 原生质球可
以吸收外源 D N A , 然后在再生培养基上再生 , 可以得到玉米黑粉菌的转化菌落 ( B a kn s ,
1 9 5 3 ; T o u k u d a
, 一9 8 8 ; W o n g e t a l . , 1 9 8 8 ) 。 B a n k s ( 1 9 8 3 ) 用酵母的 2一M i e r o n D N A
构建玉米黑粉菌的质粒和用玉米黑粉菌的自主复制序列和酵母的质粒构建玉米黑粉菌和
酵母的双功能质粒 , 分别转化玉米黑粉菌原生质球 , 用营养互补方法筛选 , 它们的转化频
1 99 1
一
0 9
一
1 1 收稿。
感谢陈玉梅同志和研究组其它同志的帮助。
DOI : 10. 13346 /j . mycosystema . 1993. 02. 011
1 4 6 真 菌 学 报 1 2 卷
率都不高。 W a n g 等 ( 一9 8 8 ) 用玉米黑粉菌的热休克基因 ( h e a t s h o e k g e n e ) 的启动子
与潮霉素 B ( h y g r o m yc in B ) 磷酸转移酶基因相连 , 构建成了双功能质粒 , 转化玉米黑粉
菌 , 用潮霉素 B筛选 ,转化频率比以前的方法有很大地提高 , 达到每微克 D N A , 转化大约
2 x 10
, 个原生质球 ,得到 50 一 10 0 0转化子 。 很可能是 由于抗生素筛选比营养互补筛选
更优越 。 我们在这里报道用热休克基因的启动子与新霉素 ( en o m yc in ) 磷酸转移酶基因
相连 , 构建成了玉米黑粉菌的质粒。 对受体菌玉米黑粉菌原生质球形成 、 再生和 D N A 转
化作了初步研究 ,并对这质粒在玉米黑粉菌中的整合形式进行了研究 。
材 料 和 方 法
(一 ) 菌种 、 培养基和主要试剂
1
. 玉米黑粉菌 (价 ` il a go 。 。 y id , ) : 从玉米病株上分离 ,对新霉素敏感 。
2
· 受体菌 : E · c o l i H B 1 0一。
3
·
P D A 培养基 : 用于菌种保存和菌种培养。
4
.
H ol l da y 完全培养基 : 用于玉米黑粉菌液体培养和原生质球再生培养。
,
. 含有玉米黑粉菌热休克基因启动子的质粒 p H IL , 由威斯康星大学 .5 .A eL o gn 提供 。
6
. 蜗牛酶 : 中国科学院生物物理研究所生产。
7
. 纤维素酶 R 一 1 0 : Y a k u l t p h a r m a c e u t i e a l I n d . c o . L t d . , J a p a n o
8
. 真菌溶壁酶 : 广东省微生物研究所生产。
,
.新霉素 : 中国卫生部药物检定研究所标准品 。
1 0
.聚乙二醇一 4 0 0 0 : s i g m a 公司。
l一核酸操作工具酶 : B e o h r i n g e r M a n n h e i m 公司 。
(二 ) 原生质球形成的最佳条件
将在 P D A 固体培养基上活化的菌种 ,接种于 Z lm H ol l i d o y 完全培养基中 , 28 ℃ 过夜振荡培养 ,
第二天以 1 / 2。 的接种量 ,接种于含 40 lm H o il d o y 完全培养基的 2 50 0 1 三角瓶中 ,通气振荡培养到
对数生长前中期 , 离心收集菌体 ,将沉淀悬浮在适当体积的 。 . 6 m ol /L 的 N o cl 溶液中 , 加入真菌溶
壁酶 ,使终浓度为 , m g Zm l , 每间隔 10 分钟取 l 滴在相差显微镜下观看原生质球形成情况 , 20 一30 分
钟 ,大约 90 % 都形成了原生质球 。 离心收集原生质球 ,用缓冲液 ( 25 m m ol / L rT is 一 H cl p H 7 . 5 , 50 nt
m ol / L C
:
lC
: , 1 m ol /L 山梨醇 ) 洗两次沉淀 , 将原生质球悬浮于适当体积的缓冲液中 (大约 10 , “ e l l/
m l )
。
为了得到生理功能较强和生长较一致的菌体 , 培养基中应含有各种矿物质 、维生素和氨基酸 , 在生
长前中期收集菌体 。
用纤维素酶 、 蜗牛酶和真菌溶壁酶单独使用以及互相混合使用 , 以 , m g /m l 的真菌溶壁酶单独作
用去壁效果最好 。
(三 ) 原生质球的 D N A 转化和再生
取 50 一 1 0 川 原生质球悬浮液 , 加人 0 . 1一 1雌 p D LI 质粒 D N A (体积尽量小 ) , 加 1川 价疏
基乙醇 , 混合后放在冰上 15 分钟 , 边混合边滴加 钓% P E G 一 4 0 0 0 (溶于 rT is , ca CI 、 山梨醇缓冲液 )
0
.
s ml
, 然后再放置 15 分钟 , 加人 10 lm 含有 1 m ol / L 山梨醇的完全培养基 , 28 ℃ 水浴 2 小时 , 取
l lm
, 加入 5 m l 上层完全培养基 ( 1% 琼脂 , 1 m ol / L 山梨醇 ) , 混合后倒在铺有固体再生培养基的
平皿上 (含新霉素 3 m g / m l) , 4 天后 ,计算转化子 。
在没有抗生素的再生培养基上 , 再生率为 60 一 80 % , 如果原生质球用水 处理 后 , 再 生率 小于
0
.
01 %
。 比较 N a cl 、 K cl 和山梨醇三种渗透压稳定剂 , 以山梨醇作为再生培养基渗透压稳定剂效果
邓大伦等 :玉米黑粉菌 D NA载体的构建和它的原生质球的转化和再生 1斗 7
最佳 。 用倒上层的方法比直接将原生质球涂布在再生培养基上再生率高。
用 p D LI质粒作为供体 DA N, 转化玉米黑粉菌原生质球 , 在含新霉素的再生培养基上筛选 , 转化
率为 3 0 一 1 0 0 0转化子 /湘 D N A 线性质粒比环状质粒提高转化率 ,一 10 倍 ,这与 w o gn 等 ( 1 9 85) 报
道相似 ,与其它丝状真菌的情况不同 ,线性化对其它丝状真菌的转化率有很小或没有影响 ( R a m b“ ` e k 改
L e a c h
,
1 9 8 7 )
。
( 四 ) 玉米黑粉菌 D N A 提取
按上面的原生质球制备方法 , 延长酶解时间 ,使全部都形成原生质球。 D N A 提取和纯化按 D “ ” is
等 ( 1 9 8 6 ) 的方法 。
(五 ) 探针的制备和打点杂交 ( do ,一 bl ot )
以随机引物的方法 , 用 ” P 标记含 ne or 基因的 D N A 片段 , 具体操作按 aS m b r o ok 等 ( 1 , 8 9 ) 的
方法 。
将提取的玉米黑粉菌 D N A 取等量点在硝酸纤维膜上 , 用 ” P 标记的含 ne or 基因的 D N A 片段
进行杂交 , 具体操作按 s a o b r o o k 等 ( 1 9 8 9 ) 的方法 。
(六 ) 核酸操作和 .E c 。 “ 转化
P ar t诫 d ! g e s t沁 n B L
二
= I
A
n e o r g e n e
{
t r… `。 r m a `’。”
{
二` e ’ n 玩`
图 1 p D L I 质粒构建流程图
一一 : p U c1 2 D N A 序列 ; — : 潮霉素 B 抗性基因序列 ; 盛醒习: 玉米黑粉菌 五印 70 有关的D N A 序列 ; 〔二习 : n e o r 基因 D N A 序列 ; R l : E c o R I ; P L : p o l y l i o k e r ; H : H i n d l l l ; B :
B g川 ; A : A v a l , p 人s P 7 0 : h s p 7 o 基因起动子 。
F i g
.
1 T h e e o n s t r u e t i o n o f p D L I Pl a s m i d
— : p U C 12 D N A s e q u e n c e ,— : h y g r o m y c i n B r e s i s t a n t g e n e s e q u e n e e ; 吸翻 : r e l a t i v eu . 份叮 d i , D N A s e q u e n e e t o h s P 7 0 g e n e ; 〔二」: n e o r g e n e D N A s e q u e n e e ; R l E e o R I ; P L :
P o l y l i n k e r ; H : h i n d l l l ; B : B g ll l书 A : A v a l ; P h s P7 0 : h s P 7 0 g e n e P r o m o r e r .
1 4 8 真 菌 学 报 1 2 卷
按 s a m b r o o k 等 ( 一9 8 9 ) 的标准方法进行 。
(七 ) 转化子的 s o u * ` er o b l o *
用合适的限制性核酸内切酶消化用上面方法提取的玉米黑粉菌转化子 D N A , 琼脂糖凝胶电泳后 ,
吸印转移 ,用 ” P 标记的含 en or 基因的 D N A 片段进行杂交 , 具体操作按 sa m b : 。 。 k 等 ( 1 9 8 9 ) 的方
法 。
( J、 ) 质粒的构建
图 1是 p D LI 质粒构建流程图 。 用 cE o RI 部分酶切 p H LI 质粒 , 琼脂糖凝胶电泳以后 , 切下只
在一个 cE o KI 位点切开的质粒 , 回收质粒 D N A , 用 aB 1 31 酶处理回收的质粒 D N A , 使其末端除去
大约 3。。 b p 后终止反应。 用 gB l l 和 A va l 酶切含转座子 T sn 的质粒 ,回收含 ne or 基因的 D N A
片段 ,用 aB l3 1 酶处理 ,使其末端除去大约 ZOb p 后终止反应 。 将处理后的质粒和 en or 基因 D N A 平
端连接 , 转化 .E 0 01 1 的感受态细胞 , 用含有氨茉青霉素的 L B 平板筛选重组子 。 将 10 个重组子分为
一组 ,混合提取质粒 , 转化玉米黑粉菌原生质球 ,用含有新霉素的再生培养基筛选重组子 。 将有阳性转
化子的组 ,再单个菌落进行筛选。 阳性菌落在 L B 平板上进一步纯化 、 鉴定后保存 。
结 果 和 讨 论
p D IL 是一个 p U C 12 的衍生质粒 , 含有玉米黑粉菌 h sP 70 基 因起动子与 ne or 基
因的 D N A 序列 , 在 E . co 八 中只表达 A m p 抗性 , 不表达 ne o 抗性 , 在玉米黑粉菌中
只表达 en 。 抗性 。 新霉素 ( en 。 ) 能有效地抑制敏感的玉米黑粉菌生长 , 虽然自发的抗
性有时会发生 ,但突变的频率非常低 ,对筛选克隆不造成影响。 潮霉素 B 的筛选范围和效
果虽然比新霉素好一些 , 但用量大 ( 1 50 产 g /m l) , 价格非常昂贵。 p D L I 在多聚内切酶
位点 ( oP ly l kn e r ) 和 ne o r 基因中有单一的内切酶位点 ,可用于基因克隆。
我们随机选出 25 个抗新霉素的玉米黑粉菌转化子菌落 , 小量提取它们的 D N A , 取
等量的 D N A 点在硝酸纤维膜上 , 用 ’ ZP 标记的 ne or 基因的 Bg n l 、 A va l D N A 片段
作为探针 , 进行打点杂交 , 图 2 。 结果显示不同菌落的杂交强度出现差异 , 可能是质粒在
细胞中的拷贝数不同 , 也可能是质粒整合进染色体的个数不同 。 我们用温和的方法裂解
图 2 玉米黑粉菌转化子 D N A 的打点杂交
各取 1拼 g 转化子 D N A 点在硝酸纤维膜 , 用 ’ Z P 标记的 en o r 基 因 D N A 作 为探针进行 杂
交。 25 个转化子显示杂交阳性 , 3 个对照显示杂交阴性 。
F i g
.
2 D o t b l o t 五y b r i d i z a t i o n of U · 琳 a夕d i s t r a n s f o r m a n t s D N A
i拼9 D N A o f t r a n s f r o m a n t s w e r e b l o t t e d o n t h e n i t r o c e 1l u 1 o s e f i l t e r a n d h y b r i d i z e d w i t h
, , P
一
l a b e l 。 d n 。。 , g e n 。 D N ^ . 2 , t r a d s f o r m a n t s w e r e p o s i t i v e a n d 3 e o n t r o l s w e r e n e g a t i v e
.
期 邓大伦等 : 玉米黑粉菌 D N A 载体的构建和它的原生质球的转化和再生
七由
图 3 S o ut h “ r n 转移杂交分析新霉素抗性转化子
用 H in dI H 消化 3 拜g 的转化子染色体 D N A , 。 · 7% 琼脂塘凝胶电泳 , SOu t五。 r n 转移到硝酸纤维膜
上 , 用 ’ Z P 标记的 ne or 基因 D N A 作为探针进行杂交。 .l 非转化子对照 ;2 一 10 ·不同的转化子 。
F i g
.
3 S o u t h e r n 五y b r i d i z a t i o n a n a l y s i忿 o f n e o m y e i n r e s i s t a n t t r a n s f o r m a n t s
3尸9 o f t r a n s f o r m a n t e h r o m o s o m e D N A w a s d i g e s t e d w i t h H i n d l l l a n d e l e c t r o p h o r e s e d i n
0
.
7%
a g a r o s e g e l
.
T h e D N A w a s t r a n s f e r e d o n t o n i t r o c e l l u l o s e f三I t e r a n d 五了b r i d i z e d
w i t h
3 2
P
一
l a b e l o d n e o
r
g e n e D N A f r a g m e n t
.
1
.
n o n 一 t r a n s f o r m a n 七 c o n t r o l . 2一 1 0 . d i f王e r e n t
r r a n s f o r m a n t s
.
玉米黑粉菌原生质球 ,琼脂糖凝胶电泳 oS ut h er n bl ot 杂交 ,并没有发现有游离的质粒存
在 , 只是在染色体的位置出现杂交带 。 从图 3 可以更清楚看出 ,如果质粒是以游离状态存
在 ,用核酸内切酶消化后 ,所有转化子应该得到 同样的杂交带 。
为了了解质粒在染色体上的整合形式 , 我们用限制性内切酶 H in dl n 消化阳性克隆
的玉米黑粉菌 D N A , 琼脂糖凝胶电泳 , S o u t h e r n 转移 ,用 3 , p 标记的 n e o r 基因 B g l l l 、
A va l D N A 片段作为探针进行杂交 , 见图 3。 杂交结果显示 , 9个转化子有不 同的杂交
带 ,说明质粒并不是在特定的位置整合进玉米黑粉菌的染 色体 ,也就是它们并非完全同源
性的重组 。 仔细分析杂交结果 , 发现在玉米黑粉菌 h sP 70 基因区域重组的机率比其它
区域大 。 示意图见图 4 , 如果是完全随机的重组 , 由于 I 区的大小几乎等于 1 、 n l 、 Iv
三个区相加一样大 ,那么应该有一半的重组子含有 3 K b 的杂交带 , 但在 9个随机挑选的
重组子中 ,只有 3个重组子含有 3 K b 杂交带 ( 2 、 3 和 7 号重组子 ) 。 如果是完全同源重
组 , 应该只有 3 K b 的杂交带 。 同时 , 从图 3 可以看出 , 有的重组子有多条杂交带存在 , 表
1 5 0 真 菌 学 报 1 2 卷
丁 「 一 { 一 翻濡~ ~霖而一 , J
O b r o 功 O S O m 6 功认
p L I
1幼
图 4 p D L I 与 h s P 70 基因区域重组示意图 ( h s p 7 0 基因区域的 D N A
物理图谱引自 s a l l y A . L e o n g )
〔口 : ne o r 基因 D N A ; 贬翻 : h: p 70 基因区域 ;— : p U C 或其它玉米黑粉菌 D N A ;R l : E e o R I, P L : P o l y l i n k e r ; H : H i n d l l l ; X : X h o l
F i g
.
4 D i
a g r a m m a t i e r e P r e s e n t a t i
o n of r e c o m b i n a t i o n b e tw e e n PD L I a n d h s p 7 o g e n e
r o g i o n ( D N A P五犷: i o a l 功 a P Of 五s P , 0 g e n e r e g i o o f r o边 s a l l y A . L e o n g )
〔二习 : n e o r g e n e D N A ; 盛乡匆: 五s P7 0 g e n e r e g i o。 ; — : P U C o r 比 e o t五e r U . o a夕d i , D N A ;R l : E c o R I易 P L : P o l了l i n k e r ; H : H i n d l l l ; X : X h o l
明存在多拷贝的整合重组 。 2号和 3 号重组子虽然只有一条杂交带 ,但 3号重组子杂交带
的曝光强度大约是 2号重组子的两倍 , S。 ut he r n lb ot 的结果与打点杂交 ( do t 一 b lo o 的
结果一致 。
我们用标记的 p u C 质粒作为探针 ,与全部的重组子都能够杂交 ,进一步说明质粒是
参人性的整合 ,不是取代性的整合 , 这与 W an g 等 ( 1 9 8 8 ) 报道的 H gy B 基因 D N A 在
玉米黑粉菌中整合的形式一样 ,与质粒在脉胞霉 ( N “ or : p口 r a ` ; 。 : : 。 ) 和构巢曲霉 ( .A
,
id
“ al 。 ) 中的整合形式相似 ,不同于质粒在酵母 ( 5 . “ ; 。讨 ; i 。 。 ) 中完全同源性的重组
( T
u r g e o n e t a l
. ,
1 9 5 7 )
o
质粒整人玉米黑粉菌染色体中是稳定的 ,没有发现被切除的现象 。 我们将抗性菌落
稀释后涂布在不含抗生素的固体培养基上 , 经过两代无选择压力培养后 ,将菌落影印到含
抗生素的固体培养基上 , 没有发现产生敏感菌落 。
玉米黑粉菌 D N A 载体的建立 , 为我们进一步用体外基因重组的方法研究玉米黑粉
菌及有关的真菌提供了有效的手段 。
参 考 文 献
1 3 〕
〔 4 〕
〔夕 J
工9 ]
B a n k s G R ( 19 8 3 ) T r a n s f o r m a t i o n o f U 了, i l a g o 。 。 夕d i s b y a p l a s m id e o n t a i n i n g 萝e a s t Z一 i e r o n D N A . C u r -
r e 作 r g e刀 e t ic s 7 : 7 3一 7 7
B a n k s e R ( 19 8 3) e h r o m o s o m a l n N A s o q u e n e e s f r o m U : t i l a 宫。 二 a dy i s p r o m o t e a u t o n o m o u s r e p l i e a t i o n o f
P l a s m i d s i n 占a c c人a r o 脚 cy 打 c e r e夕 i丁i a e . C “ r r e n t g e ” 君 t i c s 7 : 7 9一 8 4
aD
v
i s L G ( 19 8 6) B a
s
i e m e t h o d s in m o l e e u l a r b i o l o g y
.
E l s e
v
i e r P u b l i s h in g C o
.
,
N e w Y o
r
k
H o l l id a y R ( 19 7 4 ) H a n d b o ok
o f g e n o t i e s
.
A e a d e m i e p r e s s
·
N e w Y o r k
K m i e c E B
,
oH l l
o m a n w K ( 29 5 6) H
o二 0 10即 u : p a i r in g o f D N A m o l e e “ l e s b犷 肠 2 1 泞卯 R o e l p r o t e i n 15
Pr叨 o t e d b y s e q u e n e e s o f Z 一 D N A . C讨1 4 4 : 5 4 5一5 5 4
R a m ob s e k J A
, L e a e h J ( 1 98 7 ) C R C C , i : R e o B玄o t e c h o o l 6 : 3 5 7一 3 9 3
s a m b r o k J ( 19 8 9) M o l e c u l a r e l o n i n g一 a l a b o r a t o r y m a n u a l . oC ld s p r i n g h a r bo r p r e s sT s u k u d a T , C a r l e t o n S , F o t h e r i n g h a n S , H o l l o m a n w K ( 19 8 8) I s o l a t i o n a n d c h a r a e t e r i z a t i o n o f a n a u -
t o n o m o u s l y r e Pl i e a t i n g s e q
u e n e e f
r o rn U
s z i l
a g o , a y d i
s .
M o l C
亡
11 B i
o
l s ( 9) : 3 7 0 3一 3 7 0 9
T u r g e on B G
,
e a r b e r R e
, Y o d e r o e ( 19 8 7) D e v e l o p m e n t o f a f u n g a l t r a n s f o
r
m a t i o n s y s t e m b a s e d o n
` e l e c t i o n o f s e q u e n c e s w i t h P r o m o t o r a e t i v t t y . M o l C己11 B i o l 7 ( 9 ) : 32 9 7一 3 3 0 ,
, .J1Jd.l内乙口.Lr.ó
ō.J1.一
1
沙O月I八石r.L.lL
2 期 邓大伦等 : 玉米黑粉菌 D NA载体的构建和它的原生质球的转化和再生 15 1
f 1 0] W
a n g J
,
H o l d e n D W
, L e o n g S A ( 19 8 8 )
从 a夕d i s . P r o c N a z l 月 c a d S c i U S A 8 5 :
G e n e t r a n s f e r s y s t e m f o
r t h e P h y t o Pa t h o g e n i e f u n g u s U s t i l
a g o
8 6 5一 86 9
T H E C O N S T R U C T I O N O F D N A V E C T O R A N D S P H E R O P L A S T
T R A N S F O R M A T I O N A N D R E G E N E R A T I O N O F U S T IL A G O
俐叭 Y D I S
D E N e D A 一 L u N
( I二 : ti z u t e 01 M i c
r o bi o l o g .y
T I E N P o L u S H I
一Y l
A c a d e m i a 51 , i c a
,
B亡行i n g 10 0 05 0 )
A B S T R A C T W e ha v e e o n s t r u e t e d a e f f e t iv e b i f u n e t i o n p l a s而 d p D L I , w h i c h e a n b e
s e l e e t e d i n E s c h e
r i c五i a c o l i w i th a m P i e i l li n a n d i n U : , i l a g o m a夕d i s w i t h n e o m y e i n , by l i g a t i n g
th e P r o m o r e r a n d t e r m i n a t o r o f th e h e a t s h o e k g e n e f丈om U
. 勿 ay d众 w i t h n e姻 y ic n P h o s P h o -
t r a n s f e r a s e g e n e
.
T he s r u d y o n t h e e o n d i t i o n s o f f o r m a t i o n
, r e g e n e r a t i o n a n d D N A t r a n s f o r
-
m a t i o n ( m e d i a
,
g r o w i n g t im e
, e n z ym e s
, e o n e e n t r缸 i o n o f e n z y m e , d ig e s t i o n t i m e , a g e n t s f o r
s t a bl e o s m o t i e P r e s s u r e
, e t e
.
) w a 、 d o n e u s i n g
,
h e i s o l a t e d U
.
m a y d i s s t r a i n s e n s i t iv e t o n e o m y -
e i n a s t h e h o s t s t r a i n a n d P D L I P l a s m id a s th e d o n o r D N A
.
A r o u n d 9 0% s ph e r o p l
a s t f o r m a -
t i o n f r e q u e n c i e s i n th e e a r l y l o g a r i t hm i e , h
a s e e e l l s i n s m g /m l f u n g o u s l y s o w a l l e n z ym e f o r
a b o u t 3 0 m i n u t e s
,
6 0一8 0% r e g e n e r a ti o n f r e q ue n e i es a n d 3 00一10 00 t r a二 f o r m a n t s P e r m i e -
r o g r a m o f D N A t r a n s f o
r
m
a r i o n f r e q u e n e i es w e r e o bt a i n ed
.
D N A h沙 r i d i z a t ion w a s p o s i t i v e
f o r 25 r a n d om l
y s e l e e t e d t r a n s f o r m a n t s
.
T h e r es u lst of d ot bl ot a n d s o u t h e r n b l o t h y b r i d i
z a -
t i o n s r e v e a l e d t h a t h e P l a s m i d i n t e g r a t e d i n t o r h e c h r o m o s ome
i n o n e o r m o r e t h a n o n e e o P i e s
a n d p r o b a bl y b y th e w a y o f n o t p e r f e e r h om
o l o
·
ou s r e co m bi n a t i o n o r i n t e g r a t i o n i n t o t h e g e
-
n 0 1l l e
-
K E Y W O R D S U
: z i l a g o ” : a y j i了 ; e o n s r r u e t io n o f D N A v e c t o r : T r a n s f o r m a t i o n a n d r e
-
g en e r a t i o n o f s P h e r o Pl a s t