全 文 ：构祀子对云芝菌丝体和木质纤维素酶活性的影响
王 宜磊 邓振旭
(山东省菏泽高等师范专科学校生物 系 ,菏 泽 2 7 4 0 1 5 )
构祀子为茄科多年生灌木构祀的成熟果实 , 是常
见的滋补肝肾 、 养肝明 目药 。 云芝 (肠 r io l us * rs ico 勿 r)
是著名的药用菌 , 对迁 延性肝炎 、 慢性肝炎有显著疗
效 . 主要成分为云芝多糖 , 能提高机体的免疫功能 , 且
菌丝体和子实体具有相同的药效 。本文用梯度试验方
法研究了云芝在含不同量构祀子的 P D Y 液体培养基
中菌丝体的生长情况 , 纤维素酶和半纤维素酶活性的
变化 , 为云芝菌丝体的培养提供一定的理论依据 。
1
.
5 酶活测定 ①胞外梭甲基纤维素酶 ( C M C 酶 )活
力测定 :往试管 中加入 0 . 5% 的梭 甲基纤维素钠溶液
(用 p H 4 . 6 , o . I M 柠檬酸盐缓冲液配制 ) l . s m L . 再加
入稀释 10 倍的粗酶液 0 . s m L , 混匀 , 50 ℃水浴保温 30
分钟 , 取出后立即加入 D N S 试剂 (参照张龙翔等方法
配制 ) l . s m 1J . 煮沸 5 分钟 , 取出 , 冷 却后加 入 蒸馏水
ZI
.
s m I
J , 混 匀 , 7 56 M C 型 紫 外可 见 分 光 光度 计测
5 2 0 n m 处的 ( ) D 值 : 以煮沸灭活的酶液作对照 . 每组 3
个重复 ;酶活力 以样 品与底物反应 30 分钟后光密度的
改变值表示 。 ③胞外半纤维素酶活力测定 ( H C 酶 ) : 往
试管中加入 0 . 5 % 的小麦秸半纤维素悬液 ( 用 p4H . 6 ,
0
.
I M 乙酸盐缓冲液配制 ) 1 . s m L , 再加入稀释 10 倍
的粗酶液 0 . 5 m l“ , 混匀 , 50 ℃ 水 浴保温 30 分钟 . 其后
操作与 C M C 酶活性测定相同 。 酶活力以 样品与底物
反应 30 分钟后光密度的改变值表示 。 ③胞内酶活力测
定 :按上述相应的胞外酶测定方法进行 。
1 材料和方法
1
.
1 材 料 ①构祀子 : 由菏泽地区 中医医院提供 ,
其水煎液制备 。 20 9 商 品构祀子加水 10 0 m L , 煮沸 巧
分钟 , 过滤取汁 , 定溶至 I O0 m L 。 ②云 芝 : 由作者 自山
东省菏泽市分离纯化而得 。 ③化学药品 :均为商品分析
纯或化学纯试剂 。 ④半纤维素的制备 L” l : 用 4 % N a o H
浸泡小麦桔粉 2 小时 ( 90 ℃ ) , 过滤得滤液 , 用浓盐酸调
p H 4
.
5 后 , 加入与滤液等体积的乙醇 , 过滤或离心得
沉淀 , 用无水乙醇洗涤沉淀 2 次 , 沉淀 于 45 ℃ 下烘干 ,
即得浅黄色 、 粉末状的半纤维素 。
1
.
2 培养基 ① P D A 斜面培养基 :马铃薯 20 % , 葡萄
糖 2% ,琼脂 2% 。③ P D Y 液体培养基 :马铃薯 20 % , 葡
萄糖 2 % , 酵母膏 0 . 5 % 。
1
.
3 培养方法 ①接种母液制备 : 取在 P D A 培养基
上生长 6 天的斜面 , 轻轻刮下幼嫩菌 丝片段接入盛有
30 m L P D Y 液体 培 养基 的 1 5 0 m L 三 角瓶 中 , 2 8 ,C ,
1 1 0 r/ m in
, 恒温振荡培养 5 天即为接种母液 。 ②菌丝培
养 :向装有 30 m L 液体培养基 的 150 m L 三角瓶中 , 分
别加入构祀子水煎液 0 、 2 、 4 、 6 、 8 、 1 0 m L 和水 1 0 、 8 、 6 、
4
、
2
、
o m L
, 常 规灭菌后 , 接入 l m L 接种母 液 , 2 8℃ ,
11 o r/ m in
, 恒温振荡培养 6 天 , 3 个重复 。
1
.
4 样品制备 ①胞外酶样 品制备 :培养 6 天后 , 取
样 , 抽滤 , 上清液为粗酶液 。 ②胞内酶样品制备 :将滤出
的菌丝体 , 用 蒸馏水冲洗数次 , 抽干 , 称重 , 并按菌丝体
:缓冲液 = 1 :2 的比例加入样品缓冲液 ( 0 . 2 M T irs ,
0
.
I M 硼酸 , 0 . I M E D T A )置 4 ℃冰箱中过夜 , 次 日取
出研磨 . 10 0 O rp m 离心 10 分钟 . 上清液为粗酶液 。 ③
菌丝体称量 :将另一份培养 8 天的菌丝体抽滤 , 用蒸馏
水冲洗数次称其湿重 ; 80 ℃烘至恒重称其干重 。
2 结果与讨论
2
.
1 构祀子对菌丝体生长的影响 结果见表 1 。 由表
表 1 构祀子对菌丝体生长 的影响 (单位 : m l 、 m幼
构祀子水煎液 2 4 6 8 10 对照
菌丝干重 1 8 3 . 2 2 1 9 . 6 3 2 2 . 0 3 3 6 , 3 2 7 3 . 2 1 59 . 2
1 可以看出菌丝生长量以含构祀水煎液 6 m L 、 s m L 最
高 ,这一点也可从菌丝球的大小和数量上明显看出 。说
明在 3 Om L 液体培养基中加入 弓一 s m L 构祀子水煎液
(约含 4% 一 5 % 的拘祀子 )对菌丝体生长 有 明显的促
进作用 。即使加入 10 m L 的构祀对菌丝体生长也未表
现出明显的抑制作用 , 这一点和 其它如激素 、 恩 肥 、 稀
土元素等对菌丝体生长的影响不同 。
2
.
2 构祀子对酶活性的影响 ①构祀子对 胞外酶活
性的影响 :结果见图 1 。 图 1 可见 , 培养基中加入构祀
0
.
1
O D
汤ù①
③④
0 2 4 6 8 10 构布己子含里 m l
图 1 拘记子对纤维紊酶和半纤维紊酶活性的影响
①胞外 C M C 酶 ②胞外 H C 酶 ③ 胞内 C M C 酶
④胞内 H C 酶
子水煎液对胞外纤维素酶 ( C M C 酶 )和胞外半纤维素
酶 ( H C 酶 )活性均有一定影响 , 30 m L P D Y 培养基 中
加入 s m L 构祀子水煎液 (使液体培养基中约含 5 % 的
构祀子 )能明显增加胞外半纤维素酶活性 , 随加入构祀
子水煎液量的增加 ,酶活性也呈直线上升 ,到 s m L 时
酶活达到最高 (为对照的 2 . 75 倍 ) , 以后酶活逐渐下
降 ;构祀子对胞外纤维素酶的影响相对较小 , 即使在酶
活最高时 (即加入 6 m L 和 s m L 水煎液 )其酶活仅为对
照的 1 . 3 5 倍 ; 由此看来 , 构祀子对胞外半纤维素酶活
性影响较大 ,而对胞外纤维素酶活性影响相对较小 。 因
纤维素酶和半纤维家酶均为诱导酶 , 所以为了促进菌
丝体生长 , 得到更多的多糖类物质 ,可以考虑在液体培
养基中加入含半纤维素较丰富的鼓皮类物质 。是否可
以用教皮为主要原料 , 生产云 芝多糖 , 可进一步研究 。
③拘祀子对胞内酶活性的影响 : 由图 1 可以看出 ,均以
加入 6 m L 拘祀子 水煎液 (液体培 养基中含拘祀子
4 % )的酶活性较高 ,说明拘祀子的加入也能明显影响
胞内半纤维素酶和纤维素酶活性 ;胞内纤维素酶峰值
酶活为对照的 2 . 2 倍 ,而半纤维素酶峰值酶活则为对
照的 4 . 3 倍 , 说明胞内酶也与胞外酶相似 ,构祀子对半
纤维素酶的影响更大些 。高浓度的拘祀子对胞内酶的
影响更大 , 当加入 10 m L 构祀子水煎液时胞 内酶活性
已明显低于对照 , 而胞外酶的活性却比对照高 , 是否高
浓度的构祀子更有利于 酶类的分泌 , 还是其它原因尚
有待进一步研究 。 由图 l 还可看出 ,胞外纤维素酶和半
纤维素酶均较胞内酶活性高 ,可能是培养 6 天对这两
种酶来说 , 培养时间已足够长 (达到或超过其产酶高峰
期 ) , 胞内新产生的酶量很少 , 大多数均已转移到胞外
所致 ;就半纤维素酶而言 , 胞外酶明显高于胞内酶活性
(纤维素酶则相差较小 ) , 可能是半纤维素酶更易于分
泌到胞外 。
由上结果可看出 , 4 % 一 5 % 的构祀子不但能促进
菌丝体在液体培养基中的生长 , 而且能促进纤维素酶 、
半纤维素酶的产生和分泌 ;这二者是统一的 , 正是由于
降解纤维素 、 半纤维亲酶类的大量分泌 , 使菌类吸收和
利用营养物质的速度加快 , 才能使菌类旺盛生长 ,产生
较大的生物量 。有关构祀子对云芝多糖产生的影响 , 及
其最佳发酵条件等均有待于进一步研究。
参考文献 9 篇 (略 )
双抱菇抓料垄栽及添加辅料试验
陈世华
(山东省潍坊教育学院生物系 , 26 2 50 0)
双饱菇通常采用培养料平铺栽培 、 常规发菌管理 。本
试验旨在探讨发菌过程中抓料 、 添加辅料 , 以 及改变铺料
方式 :整床起垄对双抱菇产量和转化率的影响 。
1 材料与方法
1
.
1 材料 麦秸 65 % (长 巧cm 左右 ) , 干鸡粪 35 % ,过磷
酸钙 1% , 石膏 2 % , 石灰 1% 。采用二次发酵 。菌种 haF 。
1
.
2 方法 开始投料全部平铺 , 厚 20c m 左右 , 投料
30 k酬扩 ,待菌丝发料至料层 12/ 时 , 对培养料进行五个
处理 : A . 平铺料不动 ; B , 对平铺料进行抓料 , 一方面松
动培养料并拉断一部分菌丝 , 另一方面使长入菌丝培养
料与未长入菌丝培养料进行一定混合 ; C . 抓料并添加
辅料 ; D . 抓料后起垄 , 抓料后将培养料整成垄状 ; E . 抓
料并添加辅料后起垄 。每个处理 1澎 , 设 2 个重复 。辅料
为石灰 、磷酸二氢钾 、豆饼混合物 , 用量各为投干料量的
1%
,豆饼在用前腐熟 , 在抓料时均匀撤入培养料。
2 结果与分析
2
.
1 试验结果 见表 1 。 产量及转化率提高以 A 组为
基数 。
表 1 各种处 理磨菇产 t 和转化率 (单位 : k g 、 % 》
组 别 平均产量 转化率 产量提高 转化率提 高
7
,
5 2
7 8 0
8
.
4 4
8
。
9 3
9
.
5 7
2 5
.
1
2 6
.
0
2 8
.
1
2 9
.
8
3 1
.
9
0
.
2 8
0
.
9 2
1
.
4 1
2
.
0 5
0
.
9
3
.
0
4
,
7
6
.
8
DECAB
解{
2
.
2 结果分析 ①对平铺料栽培组中抓料组 B 较未
抓料 A 组 , 产量及转化率皆有提高 , 显示发菌中抓料处
理可促进产量及转化率提高 。②平铺料栽培组中抓料并
添加辅料组 C 较未添加辅料组 B ,转化率及产量有明显
提高 。③抓料起垄组 C 较抓料平铺组 B , 产量及转化率
有明显提高 。④抓料起垄并添辅料组 E 较抓料起垄组
C
,产量及转化率有明显提高 。⑤纵观起垄组 C 、 E 与不
起垄组 B 、 C ,产量及转化率前者较后者明显提高 。
3 结 论
3
.
1 双袍菇栽培中改变发菌期管理 :进行抓料 、 添加
辅料处理 , 可促进产量及转化率提高 。
3
.
2 伴随抓料处理同时改变铺料方式 : 将培养料起垄
可明显提高产量和转化率 。