全 文 ：山地寒止 生物母很 2 7( 3 ) :1 3 5一 1 3 9, 1 9 9 8
Jo u r n a l o f M
o u n t a i n gA
r i e u l t u er a n d B i o l o g y
鸡油菌纯培养菌株的抱子分离
辛智海
(贵州大学植保系 贵阳 5 5 0 0 2 5 )
摘 要 在加有活性破的 rF ies , 培养基上 , 用袍子 分 离法 获得 了鸡油 菌的纯培养菌株 。 试验比较
了几种条件下的分 离效果 。 结果表明 , 加入活性破有利 于抱子 的萌发 , 一株来源 于子 实体组 织 的
细菌时艳子萌发有明显的刹激作 用 。 两 个子 实体来 源 的艳子 混合培养的 分 离效果 明显好于单一
子实体艳子 的培养 。 本文对鸡油 菌的艳子分 离法做了详 细介绍 。
关键词 鸡油菌 袍子 细 菌 分 离
中图分类号 肠4 6 . 4 9Q 3一 335
I s o l a t i o n o f C d n t h e r a l l u s c i b a r i us b y ge mr i
n a t i o n o f s P o er s
.
J o u nr
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gr i c u l tur e a n d B i o l o g y
,
N o : 3
, 1 3 5 一 13 9 , 19 9 8 , T o t
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4 2
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A加 t r a c t P u r e e u lt u r e s t r a ins o f 〔公n t h亡 r a l l us c i阮 r i u s w er e o b t a i n de o n F r ies ’ m e d i u m w it h a e t iv a t e d
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.
K e y w o r ds 山 n t haer l l“ 5 c i加 ir u s F r . b a e t e ir a s po r e iso la t io n
鸡油菌 ( 。 nt h er ul lu : 。 iab ir u : F r . )是一种有驯化价值 的珍贵食用菌〔`〕 。 该菌的纯培养分
离较为困难 。 由于子实体带有种类较多的真菌 和数 量庞大的细菌 2[] , 尤其是伴生 细菌 的干
扰 3[] ,组织分离污染严重 、成功率很低 。 1 9 7 9 年 iN ls rF i es [’] 首次对鸡油菌担抱子的萌发进行
了研究 , 同时用活性碳和 R h o d ot or ul a gl ut i in s ( F r es )刺激抱子萌发 ,分离获得 了鸡油菌 的纯培
养 。 1 9 8 5 年 st ar at s m a 等 2[] 通过组织分离和抱子分离获得 了鸡油菌的纯培养 , 用 D N A 杂交实
验 ( D N A b fo t h y br id iaz t io n) 确证了培养物的可靠性 , 并对鸡油菌菌丝体 , R . 多ut i in : , Q ar t 。 -
cys
t i: fa ga
c ea ur m (Br et
z
)及活的蕃茄根等生物因素对抱子萌发 的刺激作用进行了研究 。 结果
表明 , 除鸡油 菌菌 丝体 外 , 其余 因素对抱 子 萌发 有 刺激 作用 。 1 9 9 0 年 E ir 。 D a n el l & N ils
rF ies 5[] 证实 了 S t ar at s m a 等人的方法 ,并对鸡油菌菌丝体的培养特征做了较详细的描述 。
国内关于鸡油菌纯培养的分离工作虽有报导 〔“ 〕 ,但文 中所述的由土壤菌索分离获得 的培
养物 在形 态特 征上 与 E ir 。 D an el , iN ls rF ie s 等人 的描述 有很 大 差别 。 1 9 9 6 年笔 者参 考
tS ar at s m a 等人的方法 , 通过组织分离获得了鸡油菌菌丝体的纯培养 ,其培养特征与 E ir 。 D an el
所描述的基本一致 。 在此基础上 , 19 9 7 年又进行了担抱子分离工作 , 同时对活性碳 、 伴生细菌
收稿 日期 : 19 9 8 e 0 3一 0 3
DOI : 10. 15958 /j . cnki . sdnyswxb. 1998. 03. 003
山 地 堆 火 住 物 李 很 18 99年
等因素对抱子萌发的刺激作用进行了研究 ,并对不同子实体来源的抱子混合培养与分 别培养
时的分离效果进行了 比较 。
1 材料和方法
1
.
1 鸡油菌 ( aC n t h e ar l l u s e i b a r i u : F r . )
1 997 年 7 月初至 9 月 初采于贵阳市花溪区青岩 、 桐木岭 、 扬中等地的 马尾松林 中 , 子实体
群生于缓坡地上 、 呈带状分布 。 子实体喇叭形 , 肉质 、 具杏仁香味 。 菌盖杏黄色 , 偶有淡黄色 ,
展开时中央略凹陷 , 边缘略向下卷曲 ,盖宽 3 一 s c m , 表面光滑 。 柄中生 , 白色 略带黄色 ,柄长 3
一 6 。 m , 直径 0 . 7 一 1 . 2 。 m 。 子实层延生 , 拟菌褶状 , 具二分叉 , 与盖同色略浅 。 抱子 印淡黄
色 ,抱子 5 一 6 X 7 . 5 一 8 拜m ,于长轴一端有芽状油滴 。
1
.
2 伴生细菌
按文献「3] 的方法 , 1 9 9 6 年由菌肉组织分离 ,种类待鉴定 ,供试菌株共 2 株 。
1
.
3 培养基
1
.
3
.
1 F M ( rF ie
s ’ m ed iu m ) 成分配比按文献【7 ] , 经试验 比较配制方法改进 如下 : 将 矿物元
素和微量无素分别配成 2 0 X 和 2 0 0 X 的贮备液 , 于 1 15 ℃灭菌 2 0 m i n 。 2 0 0 X 维生素液 、 2 0 0
X 酒石酸按液过滤灭菌后于 4 ℃蔽光保存 。 用时按量取液加人到 n s ℃ 灭菌 2 0 m in 的 2 一 3
X 葡萄糖溶液中混匀 ,再与 Z X 琼脂液混匀 ,用 l m ol 几 H C L 调 p H 至 5 . 5 , 补足水分至所需体
积 。 抗生素 : 氨节青霉素 5 0 m g几 、 链霉素 50 m g 几 。 活性碳 : 液体培养基 0 . 05 % 、 固体培养基
0
.
02 %
。 琼脂终浓度 1 . 2 % (使用前用 95 % 酒精浸泡过夜后 ,用蒸馏水冲洗 ) 。
1
.
3
.
2 M S 培养基 : (M u r a s h ig e & s k o g m e d i u m ) 成分按文献 [ 7 ] , p H 4 . 2 或 p H S . 5 , 配制方
法同上 。 抗生素 、琼脂 、 活性碳用量同上 。
1
.
3
.
3 K B A 培养基 按文献【s] ,用于伴生细菌的培养和保藏 。
1
.
4 担抱子的收集方法
于采集当天选取菌盖和 子实层完好 、 无褐斑的子实体作为分离材料 。 用无菌脱脂棉仔细
粘去菌盖及子实层表面的杂物及尘土 , 反复用较强气流吹去子实层缝隙间可能残留的杂物 , 以
免在抱子弹射过程中落人抱子印中 。 用剪刀将菌盖及子实层整个或部分切下 , 倒置于无菌吸
水纸上吸去部分水分 ,然后在菌盖表面涂一层灭菌凡士林使其贴于灭菌培养皿皿盖上 , 盖上培
养皿 以使抱子弹射到血底 ,待形成肉眼可见的抱子印后 (一般 3 一 6 h) ,将皿盖与新的培养皿盖
交换 ,这样可 以在不同培养皿中收集到同一子实体的多个抱子印 。
1
.
5 抱子的培养方法
于抱子印收集后 2 4 h 内进行 。 取收集抱子印的培养皿加人 1一 2 m l 无菌蒸馏水 , 用取液
器将抱子印吹打散开 ,制成抱子悬液 。 取样用血球计数器计数 , 一般抱子浓度在 1护 个八n l 以
上 。 用微量取液器取抱子液接于培养基中 。 固体平板 ( 9 。 m 培养皿 )每皿约 2 x 1 O5 个抱子 ,
涂布后用无菌棉 花取灭菌活性碳粉于表面撒一薄层 ,不能影响观察 ,平板用 p a r af il m 封 口 以免
水分蒸发 。 液体培养用含 50 m l 液体培养基的 250 m l 三角瓶 ,每瓶 2 . 5 x 1 0 5 个抱子 。 接种后
于 2 2 ℃ 黑暗条件下培养 。 所用培养基和处理方法如下 。
1
.
5
.
1
, 活性碳对抱子萌发的刺激作用 取同一抱子印制成 的抱子液分别接于不加活性碳的
第 3期 辛匆海 ,等 鸡油菌纯培养菌株 的抱子分离
FM 的 M S 的固体和液体以及加有活性碳的 F M 和 M S 的固体和液体中 。 接种方法与培养方
法同上 。
1
.
5
.
2 伴生细 菌对分离效果的影响 取 同一抱子 印的抱子液涂布 12 个 FM 平板 , 每皿 Z x
10
5 个抱子 ,加人活性碳粉后于 2 ℃黑暗下放置 7 d ,待表面水分蒸发 。 各取 4 皿接种细菌 工
和细菌 n 。 细菌接种采用画线法 , 用活化的 K B 斜面菌种在培养皿中央 画 一 4 c m 直线 。 与对
照一起用 p ar af il m 封 口 ,继续于上述条件下培养 。
1
.
5
.
3 两个子实体袍子的混合培养 取 5 个不同子实体来源的抱子印 , 依次编号 , 制成抱子
液 ,分别涂布 4 皿 F M 平板 ,每皿抱子数 2 x 1s0 个 ,撒上活性碳粉 ,作为对照 。 混合培养按 1 +
2
,
2 + 3
,
3 + 4
,
4 + 5
,
5 + l 分成 5 组 。 每组按号各取 i x 10 5 个抱子混合涂布 4 皿 F M 平板 , 加
人活性碳 。 与对照一起用 p a ar if lm 封 口后培养 。
1
.
6 鸡油菌菌丝体 的鉴别和传代培养
按文献【2 〕的方法 , 以菌丝体的培养特征和菌丝具有锁状联合为主要鉴别依据 。 关于鸡油
菌菌丝体 的培养特征参考文献【2 1和【5 ] 。 分离物转接到 FM 斜面试管中 ,每月转接 1 次 。
1
.
7 分离效果的比较
抱子的萌发情况取平板培养物于显微镜下观察 。 分离效果 的比较以平板上最终萌发形成
的鸡油菌菌落数为依据 。
2 结果与分析
2
.
1 鸡油菌纯培养的获得
实验中共使用了来源于 2 8 个子实体的抱子印 ,多数培养物因污染而遗弃 。 在余下的培养
物中 , 只在加有活性碳的 FM 平板和液体中有鸡油菌菌丝体产生 。 从接种到形成 肉眼可见的
菌丝体的时间约为 3 一 5 个月 。 5 个月后 ,平板上不再有新的菌落产生 。 所有菌株都具有锁状
联合 。 平板上萌发形成的菌落有两种类型 。 I 型 : 气生菌丝不发达呈葡萄状或无 ,大部分菌丝
生于培养基表面以下 ,菌落黄色 ,较小 ,转接成活率低 , 生长慢 ; n 型 : 气生菌丝发达 , 菌落大 、 颜
色较浅 ,转接成活率高 。 两种菌落传代时都保持原有特征 。
2
.
2 活性碳对抱子萌发的影响
在加有活性碳的 F M 平板上 , 约 14 d 后可观察到少数抱子膨胀 , 约 占视野中抱 子数 的 1 /
10
,
28 d 后可观察到极少数抱子萌发形成芽管 。 未加活性碳 的对照平板上只观察到抱子 的膨
胀而未观察到芽管的形成 。 培养 5 个月后 , 只有部分 FM 平板和液体中萌发 出鸡油菌菌丝体 。
上述结果表明 ,活性碳对抱子萌发有刺激作用 ,但抱子萌发后不一定能形成菌丝体 。 活性碳的
作用是吸收或除去 了培养基中抑制抱子萌发的物质 2[] 。
2
.
2 伴生细菌对分离效果的影响
对来源于 6 个子实体的抱子印进行 了细菌接种对 比试验 , 某中 4 个抱子 印带菌污染 ,余下
的 2 个实验结果见表 1 。 其中菌株 n 由于细菌在平板上迅速生长和扩展 , 整个表面几乎为细
菌覆盖 , 未能观察到有菌丝体的萌发 。 菌株 I 的生长较弱 , 5 个月后仅形成约 0 . 5 一 1 Cm 的细
菌带 ,在其边缘及 以外部分形成了较多 的鸡油菌菌落 , 菌落数明显大于 同一抱子 印的无菌对
照 。 两者的菌落大小及特征相似 ,多为 工型菌落 。 说 明伴生细菌 I 对抱子萌发形成菌丝体有
1 38
山 地 堆 火 性 物 李 根 1 98 9年
明显的促进作用 ,但其机制尚不清楚 。
表 1 伴生细菌对分离效果的影响
处 理
子实体
对照组
菌株 I
未 污 染 平 板 数 萌 发 平 板 数 每皿鸡油菌菌落数 (个 )
I 号 1 号 I l
2 3
I l
0 2
,
3
2 2 2 2 10
,
19 3 3
,
5 0
2
.
3 混合培养 的分离效果
供试的 5 个子实体抱子液中 , 1 号和 2 号完全污染 。 对 3 , 4 , 5 号的实验结果见表 2 。 混合
培养组的平板上形成的鸡油菌菌落数明显高于两个单子实体分别培养的对照 。 由于总抱子数
相同 ,抱子萌发的条件相似 ,混合组中菌落数多的原因可能是不同子实体的抱子萌发后形成的
初生菌丝更易接合形成次生菌终 , 因为所有菌丝体都具有明显的锁状联合 。 此外 , 混合培养组
中生长迅速的 n 型菌落较多 , 菌株的转接成活率也高于对照组 ,说 明混合培养获得 的菌株具有
遗传优势 。 由于没有进行单抱分离和抱子间的交配研究 , 上述分析有待对鸡油菌的遗传学研
究进一步探明 。
处 理
表 2 混合培养实验结果
未污染平板数 每皿鸡油菌菌落数
3 号 2 0 , l
4 号 3 0 , 3 , 7
5 号 2 2 , 0
3 + 4 2 2 0
,
19
4 + 5 2 2 1
,
17
3 讨 论
1 9 7 9 年 N il s F ir e s 的研究表明 , 与许多外生菌根真菌相似 , 通常条件下鸡 油菌担抱子的萌
发率极低 ,难 以分 离成活 , 活性碳和某些生物 因素可 以 刺激抱子 萌发 , 从 而提 高分离 效果 。
tS ar at s m a 等人进一步证实 和发展 了这一方法 , 但他们利用 的生物 因素在培养方法上较 为繁
琐 。 本试验 的结果表明 ,利用细菌刺激鸡油菌抱子的萌发 ,从而提高分离效果是一种更为简便
易行的方法 。 在无其他生物因素的参与下 , 利用不同子实体来源的抱子 混合培养也能取得较
好的分离效果 。
与组织分离法相 比 ,抱子分离法虽然时间长 ,也同样存在污染问题 ,但据作者观察 ,许多污
染是由于长时间培养过程中的平板污染 ,而且在加有抗生素情况下细菌污染很少发生 , 所获得
菌丝 .体经检验多数是不带菌的 , 而组织分离物最初都是带菌 。 采用抱子分主离法可 以避免伴
生细菌的干扰 ,成功率明显高于组织分离法 。 鸡油菌属 (山 nt he ar l l us ) 中有许 多的珍稀食用
菌 [’ ] ,其 中许多种的分离培养尚未见报导 。 据作者 1 9 9 7 年对采 自于花溪 的小鸡油菌 ( c . m in or
eP ck
.
)
、 白鸡油菌 ( ( C . al ib d u : F r . )的分析 , 菌 肉组织的含 细菌量都在 1护 个馆 以上 , 同时 由
于子 r实体较小 ,组织分离 比鸡油菌更加困难 。 鸡油菌抱子分离方法的研究和完善对其分离有
第 3 期 辛韧海 ,等 鸡油 菌纯 培养菌株的抱子分离
重要 的参考价值 。
参 考 文 献
杨新美 . 中 国食用菌栽培学 . 北京 :农业 出版社 , 19 88 .
G tS
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m 界o r hi az l m u s h r o m 山 n th e ar l l u s c i加 r i u sr . F r . J . P l a n t P h邓10 1. 1 98 6 , 1 2 5 : 37 7 一 3 81 .
周德庆主编 . 微生物学实验手册 . 上海 : 上海科 技出版社 , 19 86 .
(上接 1 2 8 页 )
3 结 论
影响烤烟杂交制种的因素有 : 柱头活力 、 贮藏花粉的活力 、 盛花期 、 授粉方法及授粉效率 。
柱头活力受柱头形状 、 花开天数的影响 , 柱头形状以 3 列 、 2 列形状 的柱头活力强 ,花开天
数以花开前 l d 到花开后 l d 的柱头活力强 。
烤烟花粉容易保存 , 常温常湿可至少保存 3 d ,常温干燥可至少保存 15 d ,完全可以解决杂
交制种中经常遇到的父本早花和 气候恶劣给授粉带来的 困难 。
盛花期对杂交制种有影响 , 可能是通过气候条件的改变而影响柱头活力和花粉活力 ,进而
影响杂交结实 。
采用毛笔法授粉 , 在花粉 、 柱头活力强的情况下 , 每人每天可生产 50 0 9 种子 , 制种效率
高 、效益大 。
在试验结果中 ,发现组合间的平均结实数有差异 , 有的组合间达到极显著差异 ,但影 响各
组合亲本柱头活力和花粉活力的因素相 同 , 变化趋势一致 。 因此 ,在对某一特定组合进行杂交
制种时 , 应该注意 : ① . 调节品种播期 , 使父母本盛花期相遇于 7 月下旬 。 ② . 采用毛笔法授
粉 ,提高授粉效率 。 ③ . 尽量选用生活力强的 3 列和 2 列柱头授粉 ,提高每果结实种子数 。 ④
遇到特殊情况 ,要对花粉进行保存时 ,视需保存的天数确定保存条件 ,严 防花粉生活力下降 。
参 考 文 献
孙光玲 ,等 . 烟草花粉贮藏 与活 力侧定 . 中国烟草 , 19 94 , ( 1 ) : 2 0 一 22 .
久保友明 ,等 . 利用雄性不育培 育一代杂种 . 中国烟草 , 1982 , ( 4) : 4 6 一 4 9 .