全 文 ：收稿日期:2010 － 12 － 21 修回日期:2011 － 02 － 21
基金项目:福建省重大专项基金资助项目(2007SZ0001)。
作者简介:郑宇(1976 －) ，女，讲师，博士研究生，从事园林植物应用与园林规划设计研究。通讯作者郑郁善(1960 －) ，男，教授，博士生导
师，从事园林植物应用与园林规划设计及森林培育学研究。
西洋杜鹃 ISSR-PCR反应体系的建立及优化
郑 宇1，2，何天友1，陈凌艳1，陈礼光3，荣俊冬3，郑郁善1，3
(1．福建农林大学园林学院，福建 福州 350002;2．闽江学院地理科学系，福建 福州 350108;
3．福建农林大学工业原料林研究所，福建 福州 350002)
摘要:以西洋杜鹃(Rhododendron hybridum)叶片提取的基因组 DNA 为材料，用引物 UBC880(序列为 GGA GAG GAG AGG
AGA)研究了 PCR反应体系的主要成分及退火温度对该种植物 ISSR扩增结果的影响。确立了可用于西洋杜鹃 ISSR-PCR
分析的最适宜的 PCR反应体系:20 μL PCR反应体积中，含 10 ng模板 DNA，0．25 mmol·L －1 dNTPs，2．0 mmol·L －1 Mg2 +，1．0
U Taq DNA聚合酶，0．4 μmol·L －1引物，并确定引物 UBC 880 的最适退火温度为 54． 4 ℃。PCR 扩增程序:94 ℃预变性
5 min，94 ℃变性 45 s，54．4 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1．5 min，共 40 个循环后，72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。应用该 ISSR体系对
11 份西洋杜鹃种质进行了扩增，证实了该体系的适用性和稳定性。
关键词:西洋杜鹃;简单序列重复区间;反应体系;优化
中图分类号:S685．21 文献标识码:A 文章编号:1001 － 389X(2011)02 － 0126 － 05
Establishment and optimization of ISSR-PCR system of Rhododendron hybridum
ZHENG Yu1，2，HE Tian-you1，CHEN Ling-yan1，CHEN Li-guang3，RONG Jun-dong3，ZHENG Yu-shan1，3
(1． College of Landscape Architecture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China;
2． Department of Geographic Science，Minjiang University，Fuzhou，Fujian 350108，China;
3． Institute of Industrial Forest，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China)
Abstract:Taking the genomic DNA of Rhododendron hybridum leaves as the experimental materials，the concentrations of PCR
components and the annealing temperatures，which affect the inter-simple sequences (ISSR)amplification，were optimized with the
primer UBC880 (primer sequence:GGA GAG GAG AGG AGA)． The suitable ISSR-PCR system for R． hybridum was as follows:
the 20 μL PCR volume includes 10 ng DNA templates，0．25 mmol·L －1 dNTPs，2．0 mmol·L －1 Mg2 +，1．0 U Taq DNA polymerase
and 0．4 μmol·L －1 primers． The optimal PCR process was 5 minutes at 94 ℃ for predenaturation，the follows by 40 cycles，each
with 45 seconds at 94 ℃ for denaturation，45 seconds at 54．4 ℃ for annealing，1．5 minutes at 72 ℃ for extension，finally 7 mi-
nutes at 72 ℃ for extension and holding the samples at 4 ℃ ． The ISSR-PCR of 11 cultivars of R． hybridum approves the suitability
and stability of the system．
Key words:Rhododendron hybridum;inter-simple sequences repeat;reaction system;optimization
西洋杜鹃(Rhododendron hybridum)［1 － 2］又名比利时杜鹃，系皋月杜鹃(R． indicum)、映山红(R． simsii)
及毛白杜鹃(R． mucronatum)等反复杂交而成，因其具有株型矮壮、树冠紧密、花色丰富等特点，越来越受
到人们的青睐。据不完全统计，目前西洋杜鹃品种大约有 2 000 种［3］，国内品种为 200 － 300 种［1］。由于
西洋杜鹃来自种间杂交，中间类型较多，有的形态特征极不稳定，不同生境(居群间)变异较大，各栽培品
种的鉴别存在一定困难，仅依据形态特征的分类往往引起较大争议，甚至引起分类类群变更频繁。因此探
索新的遗传标记方法，从分子水平上对西洋杜鹃品种进行准确地多样性评价，不仅对西洋杜鹃优良品种鉴
定，而且对该类花卉育种学的发展具有重要意义［4 － 6］。然而令人遗憾的是，在众多杜鹃花的研究文献中，
大部分是介绍杜鹃花的形态、生态、观赏、种植、培养等方面，从分子标记的角度研究杜鹃花的工作还较少，
且集中在野生种类方面［7 － 8］，有关西洋杜鹃分子标记的研究未见报道。
20 世纪 90 年代以后，DNA标记技术的出现为在分子水平上进行遗传多样性分析、品系鉴定、遗传作
图等提供了有力的工具。简单序列重复区间(inter-simple sequence repeat，ISSR)标记是 Zietkiewicz et al［9］
福建林学院学报 2011，31(2) :126 － 130 第 31 卷 第 2 期
Journal of Fujian College of Forestry 2011年 4 月
DOI:10.13324/j.cnki.jfcf.2011.02.010
在简单序列重复(simple sequence repeat，SSR)即微卫星标记基础上发展起来的一种新技术。SSR是一种
高度串联重复序列，重复单位仅 2 － 6 个 bp，均匀分布于基因组中。ISSR的原理是在 SSR的 5或 3端加锚
1 － 4个碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列 SSR的一段基因组 DNA进行扩增。ISSR标记结合了
随机扩增多态性 DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)标记简单、快速和限制片段长度多态性
(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、SSR标记可靠的优点，近年来在品种鉴定、种质资源和遗
传多样性研究中得到了广泛应用［10 － 13］。
本研究以西洋杜鹃基因组 DNA为模板，探讨 ISSR-PCR反应体系中 6 个因素对扩增的影响，旨在获得
西洋杜鹃 ISSR扩增的最佳反应体系，为进一步研究其遗传多样性提供依据。
1 材料与方法
1．1 试验材料
供试材料 11 份，均取自福建省漳平市永福镇花卉基地。选取无病虫害的嫩叶，洗干净后，于 － 70 ℃
低温冰箱内储存备用。
1．2 主要试验设备与试剂
主要试验设备包括 Lab Cycler PCR仪(圣欧国际有限公司)、湖南湘仪 TGL-16 台式高速冷冻离心机、
JS-380B紫外凝胶成像仪(上海培清科技有限公司)、北京六一 DYY-10C 型电泳仪、美菱低温冰箱、上海民
桥 FA 1104 型电子分析天平等。试验所用的 Mg2 +、dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA Ladder Plus、随机引物及
其他试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司(Sangon) ，核酸染料 GoldView购自北京赛百盛公司。
1．3 方法
1．3．1 基因组 DNA 的提取与定量 采用杭州博日公司的 Biospin 植物基因组 DNA 提取试剂盒(Ca#
BSC13S1) ，按说明书提取 DNA，紫外分光光度计检测 DNA 的纯度和浓度，0． 8%的琼脂糖凝胶电泳检测
DNA提取质量。 － 20 ℃保存备用。
1．3．2 ISSR原初扩增条件及 PCR扩增程序 ISSR引物采用加拿大哥伦比亚大学提供的序列，由上海生
工生物工程技术服务有限公司合成。原初扩增反应条件是 20 μL PCR反应体系中含 10 × buffer 2μL，2．5
mmol·L －1 MgCl2，0．15 mmol·L
－1 dNTPs，0．4 μmol·L －1引物，1 U Taq DNA聚合酶(上海 Sangon公司) ，DNA
模板 20 ng。初步设定的 ISSR-PCR扩增程序:94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 45 s，56 ℃退火 45 s，72 ℃延
伸 1．5 min，共 40 个循环后，72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。扩增产物在 1．5%琼脂糖凝胶(每 100 mL 含 10
μL GoldView核酸染料)中电泳(电泳缓冲液为 1xTBE) ，采用 100 bp DNA Marker(fermentas)作标准分子质
量参照物。
1．3．3 ISSR-PCR扩增反应体系的优化 PCR 反应的优化包括反应体系各成分的含量及退火温度的优
化。其中 DNA模板量设 7 个梯度(10、20、30、40、50、60、70 ng) ;Mg2 +浓度设 7 个梯度(0．5、1．0、1．5、2．0、
2．5、3．0、3．5 mmol·L －1) ;dNTPs浓度设 7 个梯度(0．05、1．10、0．15、0．20、0．25、0．30、0．35 mmol·L －1) ;引物
浓度设 7 个梯度(0．1、0．2、0．3、0．4、0．5、0．6、0．7 μmol·L －1) ;Taq 酶用量设 7 个梯度(0．25、0．5、0．75、1．0、
1．25、1．5、1．75 U)。分别设置某一成分梯度变化，其余成分按 1．3．2 所述初始反应体系，比较扩增效果。
退火温度设在 45．9 － 66．1 ℃之间，中间温度由 PCR仪自动生成，生成的温度梯度为 45．9、46．3、47．6、
49．4、51．8、54．4、57．1、59．7、62．1、64．1、65．5、66．1 ℃。
1．3．4 ISSR反应体系稳定性检测 随机选取 ISSR 引物对 11 份西洋杜鹃品种材料进行 DNA 扩增，对筛
选出的最佳体系进行稳定性检测。
2 结果与分析
2．1 dNTPs浓度对 ISSR扩增的影响
首先根据原初反应条件进行引物的初筛，选择能看到清晰条带的引物 UBC880(序列为 GGA GAG
GAG AGG AGA)用于 ISSR-PCR体系优化。由图 1 可知，dNTPs浓度小于 0．15 mmol·L －1时，条带少且模糊
不清;dNTPs浓度大于 0．15 mmol·L －1后，扩增条带明显且重复性好。因此，从药品使用效率上，最适于西
·721·第 2 期 郑宇等:西洋杜鹃 ISSR-PCR反应体系的建立及优化
洋杜鹃 ISSR扩增的 dNTPs浓度为 0．25 mmol·L －1。
2．2 Mg2 +浓度对 ISSR扩增的影响
Mg2 +通过调节 Taq DNA 聚合酶的活性，影响 PCR 扩增［14］。Mg2 +浓度小于等于 1．5 mmol·L －1时，条
带数目较少，亮度较弱;Mg2 +浓度在 2．0 － 3．5 mmol·L －1之间，条带数目和亮度均增加，其中以 Mg2 +浓度为
2．0 mmol·L －1时的条带最为清晰、非特异扩增少(图 2)。因此，最适于西洋杜鹃 ISSR 扩增的 Mg2 +浓度为
2．0 mmol·L －1。
泳道 1 － 7:dNTPs浓度依次为 0．05、0．10、0．15、0．20、0．25、
0．30、0．35 mmol·L －1;M:100 bp DNA ladder。
图 1 不同 dNTPs浓度对 ISSR-PCR的影响
Figure 1 Effect of different concentrations of dNTPs on ISSR-PCR
泳道 1 － 7:Mg2 +浓度依次为 0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、
3．0、3．5 mmol·L －1;M:100 bp DNA Ladder。
图 2 不同Mg2 +浓度对 ISSR-PCR的影响
Figure 2 Effect of different concentrations of Mg2 + on ISSR-PCR
2．3 Taq DNA聚合酶用量对 ISSR扩增的影响
在 ISSR-PCR反应体系中，Taq DNA聚合酶用量直接影响扩增反应的结果。在 20 μL 反应体积中，当
Taq酶用量 ＜ 1．0 U时，ISSR扩增条带较少且不清晰;用量增加至 1．0 U时，条带最为清晰且数量最多;用
量继续增加，扩增背景也逐渐增强(图 3)。因此，最适于西洋杜鹃 ISSR扩增的的 Taq DNA聚合酶用量为
1．0 U。
2．4 引物浓度对 ISSR扩增的影响
引物浓度会对 ISSR-PCR的带型产生明显影响，浓度过低不能扩增，浓度太高会产生新的位点［15］。如
图 4 所示，引物浓度低于 0．4 μmol·L －1时，基本无扩增条带或条带亮度较弱;引物浓度大于0．4 μmol·L －1
时，扩增条带数量增加，亮度增强。重复试验结果显示，引物浓度为 0．4 μmol·L －1时，扩增条带最清晰、稳
定。因此确定 0．4 μmol·L －1为西洋杜鹃 ISSR-PCR反应的最适引物浓度。
泳道 1 － 7:Taq酶用量依次为 0．25、0．50、0．75、1．00、
1．25、1．50、1．75 U;M:100 bp DNA ladder。
图 3 不同 Taq DNA聚合酶用量对 ISSR-PCR的影响
Figure 3 Effect of different concentrations of Taq DNA polymerase on ISSR-PCR
泳道 1 － 7:引物浓度依次为 0．1、0．2、0．3、0．4、0．5、0．6、
0．7 μmol·L －1;M:100 bp DNA ladder。
图 4 不同引物浓度对 ISSR-PCR的影响
Figure 4 Effect of different primer concentrations on ISSR-PCR
2．5 模板 DNA用量对 ISSR扩增的影响
PCR反应对模板 DNA用量要求的范围通常较宽，但最佳 DNA模板用量取决于研究的物种、类群以及
·821· 福 建 林 学 院 学 报 第 31 卷
DNA模板纯度。如图 5 所示，模板 DNA用量为 10 ng 时，就可扩增出清晰且重复性好的条带。考虑到节
约样品用量，本试验以 10 ng作为西洋杜鹃 ISSR-PCR的最适模板量。
2．6 退火温度对 ISSR扩增的影响
本试验从 45．9 至 66．1 ℃共设 12 个温度梯度，研究了不同的退火温度对 ISSR-PCR 的影响。如图 6
所示，温度继续从 48．7 ℃升高至 54．4 ℃时，条带逐渐增多变亮，至 54．4 ℃时，条带清晰明亮，数目最多;
57．1 ℃以上，扩增效果变差，65．5 和 66．1 ℃未能扩增出明显条带。因此引物 UBC880 适宜西洋杜鹃ISSR
扩增的最适退火温度为 54．4 ℃。
泳道 1 － 7:DNA浓度依次为 10、20、30、40、
50、60、70 ng;M:100 bp DNA Ladder。
图 5 不同 DNA模板量对 ISSR-PCR的影响
Figure 5 Effect of different concentrations of DNA template on ISSR-PCR
泳道 1 － 12:退火温度依次为 45．9、46．3、47．6、49．4、51．8、54．4、
57．1、59．7、62．1、64．1、65．5、66．1 ℃;M:100bp DNA Ladder。
图 6 不同退火温度对 ISSR-PCR的影响
Figure 6 Effect of annealing temperatures on ISSR-PCR
泳道 1 － 11:品种编号。
图 7 引物 UBC880 对 11 份西洋杜鹃
样品 ISSR-PCR的结果
Figure 7 ISSR-PCR fingerprinting of 11 cultivars of
R． hybridum with primer UBC880
2．7 ISSR反应体系稳定性检测
选取多条引物对 11 份西洋杜鹃品种 DNA进行扩
增，以检测所确立的 ISSR反应体系的稳定性。所选引
物对各样本(以本研究确立的优化体系)均可扩增出
清晰、重复性好的条带(图 7 显示引物 UBC880 的扩增
结果)。由此可见，该体系稳定可靠，可用于西洋杜鹃
品种的分子鉴别和遗传多样性分析。
3 讨论
杜鹃属植物栽培品种繁多，仅依据形态特征的分
类常引起争议。然而，目前有关该属植物的分子标记
研究集中于野生杜鹃种类的 RAPD 标记［7 － 8，16］，有关
ISSR标记方面未见报道。现有研究［17］表明，RAPD的短引物设计是以降低 PCR反应的忠实性为代价的，
它可使误配的几率大大增加，检测到的变异实际是非遗传的或根本不是目标生物的，有时假阳性的比例甚
至可以达到 60%。另一个限制因素是显性表达机制而非共显性表达，无法区分开纯合体和杂合体。这些
限制因素降低了其在品种鉴定中的可信度和实用性。相比之下，ISSR 是一高度可变的 DNA 区域，有的研
究结果［18 － 20］表明 ISSR能比 RAPD和同功酶标记产生更高比例的多态性带型;相对于 RAPD 而言，ISSR
使用的引物更长，PCR扩增的退火温度更高，因此，ISSR分子标记具有更高的可重复性［21］。综上所述，本
研究尝试选取 ISSR标记作为建立西洋杜鹃品种分子标记鉴定体系的手段。
ISSR谱带的准确性与稳定性是进行遗传多样性分析的前提条件。本研究表明，反应体系不同或扩
增程序不同，都将影响 ISSR扩增结果，进而影响 ISSR分析的准确性。因此，在使用不同的仪器设备，及
来源不同的试剂时，为了保证西洋杜鹃 ISSR-PCR试验结果的稳定性、重复性和可信性，必须对影响 PCR
扩增的主要因子进行适当地调整、筛选和优化［22］。
ISSR-PCR只有在各种扩增参数固定的条件下才表现出较高的稳定性，因此，对各种影响因子进行筛
选和优化是应用 ISSR技术的前提，其扩增条带虽较 RAPD标记稳定，但也受反应条件变化以及物种不同
的影响［23］。本研究通过比较不同因素对西洋杜鹃 ISSR扩增的影响，对反应体系进行筛选和优化，确立了
可用于西洋杜鹃 ISSR分析较适宜的扩增条件:20 μL PCR反应体积中，含 10 ng模板 DNA，0．25 mmol·L －1
·921·第 2 期 郑宇等:西洋杜鹃 ISSR-PCR反应体系的建立及优化
dNTPs，2．0 mmol·L －1 Mg2 +，1．0 U Taq DNA聚合酶，0．4 μmol·L －1引物，并确定引物 UBC880 的最适退火温
度为 54．4 ℃。本研究扩增得到的西洋杜鹃 ISSR带型表现出很高的多态性，多态性带型占 70%，而且这些
带型具有很好的可重复性，说明 ISSR分子标记是评估西洋杜鹃遗传多样性的有效方法。同时，这一优化
的 ISSR-PCR反应体系为进一步利用 ISSR分子标记技术对西洋杜鹃进行品种鉴定、分子遗传图谱的构建
及基因定位提供了依据。
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(责任编辑:卢凤美)
·031· 福 建 林 学 院 学 报 第 31 卷