全 文 ：　　收稿日期: 2008-09-17
基金项目:四川省“十一五”重点公关资助项目“优良工业
用竹种质资源收集及遗传多样性研究”。
作者简介:蒋　瑶 ( 1982-) ,女 ,四川省罗江县 , 汉族 ,硕士
研究生 ,从事植物分子生物学研究。 E-mai l: h elloki t ty-22
@ 163. com
　* 通讯作者:胡尚连 ( 1966-) ,女 ,河北秦皇岛市 ,西南科技大
学教授、博士 ,主要从事植物生理与生物技术研究。 E-mail:
hush anglian@ 126. com
四川不同地区硬头黄竹 RAPD和 ISSR分析
蒋　瑶1　胡尚连 1* 　陈其兵 2　曹　颖 1
孙　霞1　卢学琴 1　黄胜雄 1
( 1.西南科技大学生命科学与工程学院 ,四川 绵阳 621010; 2.四川农业大学林学园艺学院 ,四川 雅安 625014)
摘　要　以四川不同地区硬头黄为研究对象 ,通过随机扩增多态性 DN A标记 ( RAPD)和简单序列重复
区间 ( ISSR)标记进行扩增 ,探讨硬头黄竹的遗传多样性。研究表明 , 6个 RAPD引物扩增出 42条条带 ,多
态性高达 69. 05% ; 5个 I SS R引物扩增出 47条条带 ,多态性为 61. 70%。利用 Popgen32和 N TYS软件进
行聚类分析 ,可将不同地区硬头黄竹类型区分开来 ,其遗传距离分别为 0. 182 3～ 0. 602 2和 0. 043 5～
0. 672 1, RAPD和 ISSR分子标记为硬头黄竹的遗传改良提供理论依据。
关键词　硬头黄 ;遗传多样性 ; RAPD标记 ; ISSR标记
RAPD and ISSR Analysis of Bambusa rigida from
Seven Dif ferent Regions in Sichuan Province
Jiang Yao
1　 Hu Shang lian1* 　 Chen Qibing2　 Cao Ying1
Sun Xia
1　 Lu Xueqin1　 Huang Shengxiong1
( 1. College of Life Science and Engineering, Southw es t Universi ty of Science and
Tech nology, Mian yang 621010, Sich uan, China;
2. Fores t ry and Ho rticultural College, Sichuan Agriculture Univ ersi ty, Yaan 625014, Sich uan, China)
Abstract　 The genetic div ersi ty of Bambusa rigida f rom seven dif ferent regions in
Sichuan province w as studied using random ampli fied po lymo rphic DN A ( RAPD) and
inter-simple sequence repeat ( ISSR) amplification ma rkers. The results show ed that 6
RAPD and 5 ISSR primers genera ted 42 and 47 bands, o f w hich the percentag e of
polymorphic bands ( PPB ) was 69. 05% fo r RAPDs and 61. 70% fo r ISSRs. The
U PGM A analy sis of Popgen32 and N TYS program show ed the follow ing resul ts: the
genetic distance ranged from 0. 1823 to 0. 6022 for RAPDs and 0. 0435 to 0. 6721 fo r
ISSRs. The techniques o f RAPD and ISSR molecular ma rkers provided a theo retica l
basis for the genetic improvement of Bambusa rigida.
Key words　Bambusa rigida; Genetic div ersity; RAPD marker; ISSR marker
　　聚合酶链式反应 ( Random Amplified
Po lymo rphic DN A, RAPD)是由 Williams[ 1]等
于 1990年发表的一种检测核苷酸序列多态性
的方法 ,而简单序列重复间扩增多态性 ( Inter-
Simple Sequence Repea t, ISSR)是加拿大蒙特
利尔大学 Zietkiewicz[2 ]于 1994年发展起来的一
种基于微卫星序列的新型分子标记技术 ,两种
第 28卷　第 1期
2 0 0 9年 2月　　　　　　　 竹　子　研　究　汇　刊JO URNAL O F BAMBOO RESEARCH　　　　　　　　
Vol. 28, No. 1
Feb. , 2 0 0 9
分子标记技术在植物学研究中被广泛用于遗传
多样性研究 [3～ 6 ]、遗传资源分类 [7, 8 ]、品种纯度
鉴定与杂交育种 [9 ]、遗传图谱构建 [10 ]、突变检
测与基因比较 [11 ]等方面。 RAPD和 ISSR技术
在竹子研究领域也得到广泛应用。吴益民等 [ 12]
借助 RAPD技术分析了孝顺竹 ( Bambusa
mult iplex ( Lour. ) Raeuschel )、凤尾竹 ( B.
mult iplex cv. Fernleaf )、绿竹 ( Dendrocala-
mopsis oldham i ( M unro ) Keng f. )和白绿竹
(B . oldharnii ) 4个品种的 DNA多态性 ,初步
构成反映种特征的 RAPD指纹图谱 ,为竹种鉴
定提供了科学依据。Malay Das[13 ]等利用 RAPD
和 SCAR技术扩增巴苦竹 (B . balcooa , Bb)和
马甲竹 (Bambusa tulda , Bt )片段 ,其中 Bb809和
Bt609是经 RAPD和 SCAR的扩增产物杂交所得
的特异性条带。
硬头黄竹 ( B . rigida )为禾本科 ( Gram i-
neae ) 竹属 (Bambusa )植物 ,具有观赏和经济
价值 ,也是四川地区特有的竹种之一 ,可作为建
筑材料、造纸工业、园林绿化的优良原料。 以往
对硬头黄竹的研究主要集中在无性繁殖 [14 ]、生
长规律 [15 ]、形态特性 [16 ]等方面 ,而对硬头黄竹
遗传多样性方面的研究鲜见报道。鉴于此 ,本研
究以四川省具有代表性的 6个不同地区的硬头
黄竹为材料 ,采用 RAPD和 ISSR分子标记技
术 ,研究不同地区硬头黄竹遗传多样性 ,探讨硬
头黄竹的遗传关系 ,旨在为今后硬头黄竹种质
资源的遗传研究及工业纸浆用竹的遗传改良与
开发利用研究提供理论依据。
1　材料与方法
1. 1　材料
试验以四川省具有代表性的 7个不同地区
的硬头黄竹为研究对象 ,分别采集四川不同地
区具有代表性群居的硬头黄竹的新鲜叶片 (变
色硅胶快速干燥脱水 ,带回实验室 -80℃冰箱保
存备用 )作为提取基因组 DNA的材料 ,各样品
的名称、来源见表 1。
表 1　供试硬头黄竹
Tab. 1　 Materials of Bambusa rigida und er study
样品编号
Sam ple No.
样品名称
Sample name
采样地点
Sampling localit ies
经度
Longi tude
纬度
Lati tud e
1 Y-YBZH 宜宾市竹海县 104°9′ 28°5′
2 Y-YBJA 宜宾市江安县底蓬镇 105°08′ 28°62′
3 Y-NXSM 泸州市纳溪区上马镇 105°12′ 28°45′
4 Y-LZXY 泸州市叙永县向林乡 105°46′ 28°14′
5 Y-MSQS 眉山市青神县 103°89′ 29°85′
6 Y-YBCN 宜宾市长宁县 104°93′ 28°54′
7 Y-M C JB 乐山市沐川县箭板镇 103°85′ 29°00′
1. 2　方法
1. 2. 1　基因组 DNA的提取纯化　参考改良的
十六烷基磺酸钠 ( Sodium dodecy l sulfa te,
SDS) [ 17 ]对硬头黄竹叶片基因组 DNA进行提取
和纯化 ,并有所改进。取 0. 2 g竹叶在液氮中迅
速研磨成粉末 ,加入预热的 650μL SDS裂解缓
冲液 ( 2% SDS, 0. 25 M EDTA, 0. 1 M Tris-
HCl , 0. 15 M NaCl)和 65μL( 5%巯基乙醇 ,β -
BME) , 65℃水浴 30 min,加入 3μL 10 mg·
m L
-1
RNase A 65℃水浴 10 min。取上清 ,加入 1 /
3体积的 5 M KAc( pH 5. 2)冰浴 30～ 60 min,
4℃ 12 000 r· min-1离心 10 min,取上清 ,加入
等体积的酚∶氯仿 ( 1∶ 1, v /v ) , 4℃ 12 000 r·
min-1离心 10 min,加入等体积氯仿抽提 ,离心取
上清液 ,加入等体积异丙醇或 2倍体积无水乙
醇 ,醇沉 1 h,离心去上清 ,将沉淀物用 1 m L
70%乙醇清洗 ,自然风干 ,加入 30～ 50μL的 1
× TE溶解 , -20℃保存。
1. 2. 2　 RAPD扩增、检测　 20μL PCR反应
体系中各组分的含量和加入量见表 2。 PCR扩
增程序为: 94℃预变性 3 min, 94℃变性 30 s,
36℃退火 1 min, 72℃延伸 2 min,循环 40次后 ,
72℃完全延伸 10 min。 扩增产物在含有 EB的
1. 5%琼脂糖凝胶中电泳检测 ,于凝胶成像分析
7　第 1期 蒋　瑶等　　四川不同地区硬头黄竹 RAPD和 ISSR分析 　 　
仪上观察拍照 ,并记录 RAPD扩增谱带 ,用
Excel 2000输入保存于计算机中。 用 DL 2000
的 DNA ladder (大连宝生物公司 )为分子量
标记。
表 2　硬头黄竹 RAPD和 ISSR-PCR反应体系
Tab. 2　 Reaction s ystem of RAPD and ISSR-PCR for B ambusa rig id a
成分
Component
母液浓度
Moth er liquo r
concent ration
反应总体积中各成分加入量 /
20μL Added amount o f each component
RAPD ISSR
各成分的含量
Con tent of each component
RAPD ISSR
10× PCR buffer 2 2 / /
MgCl2 25 mM 1. 6 1. 6 2 mM 2 mM
dN TP mix 2. 5 mM each 1. 6 2 0. 2 mM 0. 25 mM
引物 10μM 0. 6 0. 6 0. 3μM 0. 3μM
模板 100 ng· μL-1 0. 5 0. 5 2. 5 ng 2. 5 ng
r Taq( Takara) 5 U· μL-1 0. 15 0. 15 0. 075 U 0. 075 U
甲酰胺 / 0. 4 / 2%
ddH2O 13. 55 12. 75
表 3　 RAPD和 ISSR引物
Tab. 3　 Primers of RAPD and ISSR
序列 ( 5 → 3 ) sequences 引物 primer 序列 ( 5 → 3 ) s equences
RAPD
OPAA-04* AGG ACT GCT C O PU-14 TGG GTC CCT C
OPB-06* TGC TCT GCC C O PU-18 GAG GTC CAC A
O PB-07 GGT GAC GCA G OPY-15 AGT CGC CCT T
O PC-05 GAT GAC CGC C OPY-18 GTG GAG TCA G
O PC-06 GAA CGG ACT C OPY-19 TGA GGG TCC C
O PC-08* TGG ACC GGT G O PZ-03 CAG CAC CGC A
O PC-18 TGA GTG GGT G RAPD-R2 AA T GGC GCA G
O PC-20 ACT TCG CCA C RAPD-R3 GAG GAT CCC T
OPH-13 GAC GCC ACA C RAPD-R5* TGT CTG GGT G
OPH-19 CTG ACC AGC C RAPD-R6 ACA CCC CAC A
OPK-09* CCC TAC CGA C RAPD-R7 GGC GGA TAA G
OPN-14* TCG TGC GGG T RAPD-R8 CTG GGC ACG A
OPU-12 TCA CCA GCC A RAPD-R9 ACG CCA GAG G
D3 GTC GCC GTC A B17 AGG GAA CGA G
C5 GAT GAC CGC C
ISSRa
ISSR-1 CCAG TGGTGGTGGTG ISSR-15 GSGGT GTGTG TGTGT
ISSR-4* GCACACACAC ISSR-16* BDBCACACACACACA
ISSR-5* CTCTCTCTCTCT CTCTRC ISSR-18* CSCGAGAGAGAGAGA
ISSR-8 DBDGAGAGAG AGAGAGA ISSR-19 GCW GAGAGAGAGAGAG
ISSR-9* CCCGTG TGTGTG TGT ISSR-20 CTCTCTCTCT CTCTCTRG
ISSR-10 GCG ACACACACACACA ISSR-21 V HV GTGTG TGTGT GTGT
　　注: B: C /G /T; D: A /G / T; V: A/C /G; H: A /C /T; W: A /T. * :为本试验 RAPD和 IS SR所筛选的引物。
1. 2. 3　 ISSR扩增、检测　 ISSR的反应体系 20
μL其组分含量和加入量列于表 2。反应程序为:
94℃预变性 5 min, 94℃变性 30 s, 48℃退火 45
s, 72℃延伸 90 s, 40次循环后 , 72℃完全延伸 7
min。扩增产物在含有 EB的 1. 5%琼脂糖凝胶
中电泳检测 ,于凝胶成像分析仪上观察拍照 ,并
记录 RAPD扩增谱带 ,用 Excel 2000输入保存
于计算机中。用 DL 2000的 DNA ladder(大连宝
生物公司 )为分子量标记。
1. 2. 4　试验数据统计及遗传分析　用筛选出
的引物对 7个不同地区硬头黄竹进行扩增 ,以
2 000 bp Marker作为相对分子量标准 ,由同一
8　　　 竹 子 研 究 汇 刊 第 28卷　
引物扩增的电泳迁移率一致的条带被认为具有
同源性 ,按照相同迁移位置上 DNA带的有无进
行统计 ,有带的记为“ 1” ,无带的记为“ 0” ,建立
RAPD和 ISSR的 0 /1数据矩阵。采用 Popgen32
软件分别对 RAPD和 ISSR扩增结果进行遗传
分析 ,得到多态性位点及其多态性 ( percentage
o f polymorphic bands, PPB)、等位基因平均数
( Observ ed number of alleles, Na)、有效等位基
因数 ( Ef fectiv e number of alleles , Ne)、 Nei’ s
基 因 多 样 性 ( Nei’ s g ene div ersity, h )、
Shannon’ s信息指数 ( Shannon’ s information
index , I)等遗传参数。计算 Nei’ s遗传距离 ,并
按不加权算数平均法 ( unw eigh ted pai r g roup
method wi th a ri thmetic, UPGMA)方法聚类 ,
利用 N TSYS软件绘制聚类图。
2　结果与分析
2. 1　引物筛选
分别对 29个 RAPD随机引物和 12个 ISSR
引物进行初选 ,大多数引物对 7个不同地区硬
头黄竹都能扩增出多态性条带 ,分别进行复选 ,
从中选出 6个 ( RAPD)和 5个 ( ISSR)清晰、稳定
并能扩增出多态性位点的引物 ,并对 7个样品
进行扩增。用以遗传分析 ,引物序列见表 3。图
1、图 2为其中 2个引物的扩增结果。
图 1　引物 ISSR-18对 7个样品的 ISSR结果
Fig. 1　 The amplif ication of primer ISSR-18
注: 1- Y-YBZH; 2- Y-YB JA; 3- Y-NX SM; 4- Y-
LZXY; 5- Y-M SQS; 6- Y-YBCN; Pop7- Y-M CJB。
2. 2　多态性
采用两种标记对参试的 7个样品进行扩
图 2　引物 RAPD-R5对 7个样品的 RAPD扩增结果
Fig. 2　 Th e ampli fication of p rimer RAPD-R5
注: 1- Y-YBZH; 2- Y-YB JA; 3- Y-NXSM; 4- Y-
L ZX Y; 5- Y-M SQS; 6- Y-YBCN; Pop7- Y-MC JB。
增 ,检测出的位点及多态性情况见表 4。由表 4
可知 , 6个 RAPD引物共扩增出 42个位点 ,平均
7个 ,其中多态性位点 29个 ,多态性 ( PPB)为
69. 05%。平均每个引物多态性位点4. 8个 ; 5个
ISSR引物共扩增出位点 47个 ,平均 9. 4个 ,其
中多态性位点 29个 ,多态性 ( PPB)为 61. 70%。
平均每个引物多态性位点 5. 8个。尽管两种方
法得到的 PPB有差异 ,但本研究结果表明
RAPD分子标记的 PPB高于 ISSR分子标记。
表 4　 RAPD和 ISSR两种标记引物扩增条带数统计表
Tab. 4　 Th e s tati sti c of amplif ied bands generated
by RAPD and ISSR mark ers
总扩增条带
Th e to tal loci of
ampli fication
多态性条带
The loci of
polym orphic bands
多态性 ( PPB)
Percen tage of
polym orphic bands
RAPD 42 29 69. 05%
ISSR 47 29 61. 70%
2. 3　遗传多样性及遗传相似性
有效等位基因数和基因多样度是衡量遗传
变异最常用的两个遗传指标 ,具有明确的遗传
学意义。Shannon表型多样性指数 ( I )可评价竹
种间遗传多样性的高低 ,指数越大 ,表明竹种间
的遗传多样性越高。利用 Popgen32软件计算分
析样品两种标记方法的 4个遗传参数 (表 5)。
RAPD方法的 Na为 1. 690 5, Ne为 1. 509 9, h
为 0. 285 7, I为 0. 414 9; ISSR方法以上 4个参
数分别为 1. 617 0、 1. 310 6、 0. 198 0和 0. 306 5。
总体上看 , RAPD标记所获得的值都略高于
9　第 1期 蒋　瑶等　　四川不同地区硬头黄竹 RAPD和 ISSR分析 　 　
ISSR标记。计算结果表明 ,供试硬头黄竹具有
比较丰富的遗传变异。
表 5　遗传多样性指标平均值
Tab. 5　 Th e gen etic diversi ty
方法
Meth od
等位基因
平均数 Na
有效等位
基因数 Ne
Nei s基因
多样性 h
Shannon s
信息指数 I
RAPD 1. 690 5 1. 509 9 0. 285 7 0. 414 9
ISSR 1. 617 0 1. 310 6 0. 198 0 0. 306 5
以 RAPD和 ISSR为标记的树状聚类图 (图
3)可以看出 , 7个硬头黄竹间具有一定程度的
遗传变异 ,其遗传距离分别 为 0. 182 3～
0. 602 2和 0. 043 5～ 0. 672 1,平均值分别为
0. 392 2和 0. 314 3。0. 154 7,表明硬头黄竹间出
现了一定程度的遗传分化。由于分布范围广 ,造
成不同硬头黄竹所处位置的温度、水分、光照、
土壤等生态因子发生较大变化 ,环境变异性强 ,
不同种群所承受的生境选择压力存在较大差
异 ,最终导致种群间的遗传分化。
在 U PGM A方法构建的 RAPD系统树图
中可见优先聚类的 3个类群 (图 3):类群Ⅰ 由 Y-
YB JA和 Y-MSQ S先聚在一起 ,再与 Y-LZXY
进行聚类 ,类群Ⅱ由 Y-NX SM和 Y-YBCN组
成。 类群Ⅲ由类群Ⅰ 、类群Ⅱ再与 Y-YBZH和
Y-MCJB聚类。
在 U PGMA方法构建的 ISSR系统树图中
可见聚类的 3个类群 (图 3):类群Ⅰ 由 3个系组
成: Y-NX SM和 Y-LZXY优先聚类在一起 ,再
与 Y-YBCN和 Y-MCJB聚类 ,然后与 Y-YBZH
进行聚类。类群Ⅱ由类群Ⅰ 和 Y-YB JA组成 ,类
群Ⅲ由类群Ⅰ 、类群Ⅱ再与 Y-MSQS聚类。
由此看出 ,硬头黄竹 RAPD和 ISSR的聚类
图存在一定的差异 ,即不同地区间硬头黄竹具
有丰富的遗传多样性 ,其亲缘关系存在差异 ,可
能是由于引物和纬度的差异 ,还有可能是由于
遗传变异在居群间存在不同的进化模式。因此 ,
有必要进一步研究各种进化动力在不同层次对
硬头黄竹遗传变异的影响。
图 3　采用 RAPD和 ISSR标记基于 Jaccard相似系数构建的 UPGMA系统树图
Fig. 3　 U PGM A dend rog rams of Bambusa r ig ida in 7 dif ferent regions
based on Jaccard coef ficien ts using RAPD and ISSR mark ers
3　讨　论
3. 1　硬头黄竹的 RAPD和 ISSR的多态性
近年来对 RAPD和 ISSR技术的应用扩展
速度很快 ,故这两种分子标记已成为植物种质
资源遗传多样性的鉴定提供了高效、便捷的技
术手段。本研究同时采用 RAPD和 ISSR两种分
子标记技术 ,对四川不同地区的硬头黄竹进行
遗传多样性分析 ,可以有效地鉴定种内遗传多
样性和评价研究。
从研究结果来看 ,两种标记均可作为硬头
黄竹遗传多样性分析的手段。 两种方法得到的
多态位点百分率 (多态性 )相近 , RAPD检测到
的多态性为 69. 05% , ISSR为 61. 70% ,二者相
近 ,多态位点数均为 29条 ,但 ISSR标记检测出
的位点数 ( 47条 )比 RAPD标记多 5条 ,也就是
说 RAPD标记可以揭示更为丰富的遗传信息 ,
10　　　 竹 子 研 究 汇 刊 第 28卷　
这与文献报道 [17 ]有一定的差异 ,原因在于所选
择的引物和地理差异 ,也有可能是 PCR扩增条
件的差异。
3. 2　硬头黄竹的 RAPD和 ISSR的遗传数据
遗传多样性计算结果表明 , RAPD方法的
4个遗传参数值分别为 1. 690 5、 1. 509 9、
0. 285 7和 0. 414 9; ISSR方法的为 1. 617 0、
1. 310 6、 0. 198 0和 0. 306 5。总体上看 RAPD
标记所获得的值都略高于 ISSR标记 ,也就是说
RAPD标记能够获得单位引物多态位点的能
力高于 ISSR。
遗传多样性的高低反映了物种对外界环境
适应能力的强弱 ,计算结果表明硬头黄竹具有
比较丰富的遗传变异 ,这主要是由于遗传背景
较为丰富造成的。 U PMGA聚类分析的结果也
显示了硬头黄竹种内具有一定的遗传变异 ,两
种标记的聚类分组趋势基本相同。综上所述 ,尽
管 RAPD和 ISSR对基因组能扩增不同的特性
片断 ,但都可用以进行硬头黄竹的遗传多样性
分析 ,尽管 ISSR标记试验的相对稳定性 ,检测
出遗传信息更为丰富 [ 17] ,但本试验认为采用
RAPD方法更好一些。
因此 ,利用 RAPD和 ISSR两种分子标记进
行硬头黄竹的亲缘关系研究 ,种质资源、指纹图
谱分析和基因定位等研究具有广泛的应用
前景。
参 考 文 献
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