全 文 ：第 32 卷 第 5 期
19 93 年 9 月
厦门大学学报 ( 自然科学版 )
J
on r u al ofX i a爪 n eU n iv七 r, i布y ( N a t u r a l S e i e n e e ) Vo
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1 99 3
甜菊叶片细胞 U D P G P P L a 、 e 基本特征
及电镜细胞化学定位 还’
陈睦传 李里妮 洪维廉
学 系 )
江德耀
(生 物
.
摘要 经 硫酸按分级 、 D E A E 一纤维素和葡聚糖凝胶 柱层析 , 叶 中 u D PG P aL s 。 被纯化
1 6 倍 . 该酶最适反应沮度 32 ℃ .最佳反应 p H S . 0 . 2 m n lol / L 的 aC 卜和 5 m m ol / L 的 M扩’ 对该
酶有较好激活效果 , 但无绝对依赖 关系 . P b , ’ 对该酶有较强抑制作用 . 亚细胞分级分离结果表 明
% %的 u D凡 p P L。 。 活性分布于 4 6 0 o x 98 o c m s/ , 上清液 .电镜细胞化学定位研 究表明 .该酶
主要定位于液泡 、 高尔墓扁平囊和高尔基小泡 ,还讨论该酶在甜菊掩普生物合成中的作用 .
关键词 甜菊叶片 ,甜菊糖昔 , 尿啥陡核昔二磷酸葡萄精焦磷酸化酶
19 51 年 T ru c 。 首次从 鼠肝组织提取了尿晦咤核昔三磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 (U D PG
P P aL
s e ) 以来 , 已有不少学者 〔 ’ , , 山 . 〕已证明该酶可催化尿啼吮核昔三磷酸 ( U T P )和葡萄糖 一 1 -
磷酸 ( G 一 1一 P )合成尿啼咤核昔二磷酸葡萄糖 ( U D P G ) .在蔗糖 、糖元 、 纤维素 、 多种糖昔等碳水
化合物代谢中起重要的作用 .
甜菊糖昔 (s t e v i os id e )由于双菇配糖体一 13 位点和 一 19 位点上葡萄糖分子数目及连结形式
不同 , 已从中分离出 8 种在甜度 、 味感等方面不同的糖昔 . 它们在总糖昔中所占的比例是影响
甜菊利用价值的关键 L , , , 〕 . 但迄今为止甜菊搪昔生物合成机理仍未被阐明 . 探讨参与甜菊糖昔
生物合成代谢中关键酶的基本特性 、 亚细胞分布及作用 ,不仅有助于阐明甜菊糖昔形成机理 ,
在生产实践上为提高和改善糖昔的含量和质量 ,也有重要意义 .
1 材料与方法
材料 : 甜菊叶片取 自厦门大学植物园 . U T P 和 G 一 1一 P 系 iS g m a 公 司产品 , U D P G 和
U D p G 脱氢酶系 B e e h r i n g e r M a n n h e im 公司产品 .
方法 : 酶的提取 、 纯化 z )取鲜叶 1 0 0 9 加人 3 倍体积预冷缓冲液 A (含 s o m m o l / 1 T r i s -
H C I
,
p H S
.
0
,
0
.
4 m o l / l蔗搪 , 2 m m o l / l疏基 乙醇 ) ,经匀浆 , 过滤 , 一5 0 0 0 又 9 8 0 c m / s , 离心后收
集上清液 . 2) 硫酸按分级 : 加入固体硫酸馁至 30 %饱和度 , 充分搅拌后静置 Z h , 8 0 0。又 98。
c m s/
, 离心 10 m in ,收集上清液 ,再加入硫酸按室 80 %饱和度 ,充分搅拌后静置 Z h , 8 0 0 丫
98 0
c
m s/ , 离心 . 3) 脱盐 : 收集沉淀部分用缓冲液 A 溶解后 , 用葡聚糖凝胶 G 一 1 5 脱盐 (事先用
① 本文 19 92一 1 1一 0 3 收到 , 国家 自然科学基金资助项目
第 5期 陈睦传等 :甜菊叶片细胞 P G U DP P L韶 e基本特征及电镜细胞化学定位 · 6肠
I
含 50 m m ol八 的 T r. s一 H el的缓冲液 ( B p圣 s r.。 )平衡 ) .4) E DE A一纤维素柱层析 :将脱盐后的样
品适度浓缩后移入事先用缓冲液 B平衡的 E DE A一纤维素 C D一 3 2柱 上 , 经 80 nl 缓冲液 B 洗
脱 ,后依次用含有 0 . 2 、 0 . 3 、 。. 4 和 。 . 6 m ol I/ 的 N a CI 的缓冲液 B 洗脱 , 合并酶活性部分 . 5 )
葡聚糖凝胶 G 一 20 柱层析 :酶蛋白用两倍体积的缓冲液 B 洗脱 ,收集合并酶活性峰部分 .
U I ) P G P P L a s e 活性检测 ; 参照 G a s t a f s o n 等人的方法 ,在系统中偶联 U D P G 脱氢酶 , 检
测 U D P G 生成量 . 该酶活测定分两步 ; 一是 U D P G P P L a s e 的酶促反应 , 用热处理终止后再行
第二步 U D P G 脱氢酶酶促反应 . 反应伴随 N A D H : 生成 ,生成量用波长 340 n m 的吸收值测
量 . 两克分子 N A D H 对应 1 克分子 U O P G ,酶活力单位为每分钟生成 1 微克分子 U D P G .
u D P G P P L
a s 。 亚细胞分级分离 : 取 5 9 鲜叶 ,加人 预冷的 10 m m o l八 T r is 一 H C I 2 0 m l (含
1 0 m m o l / 1 M g C I
: 、
2 m m o l / l疏基乙醇 、 0 . 4 m o l / I蔗糖 、 2 m m o l / 1 ED T A 和 0 . 1% 牛血清白蛋
白 ) , p H 为 7 . 0 . 在研钵中研磨 1 m in 后转入高速分散器匀浆 90 5 (2 0 0 0 r /m in ) . 匀浆液经单
层纱布过滤后 , 在 4 ℃ 下干 7 0 0 火 9 8 0 c m / s , 和 1 7 0 0 又 9 8 0 e m /、 , 各离心 2 0 m i n , 5 0 0 0 又 9 8 0
e m / , ’ 和 Z 0 0 0 x 9 8 o c m / s , 各离心 3 o m in , 4 6 0 0 0丫 9 8 o c m / s , 离心 6 0 m in , 分别收集各级沉
淀物及 4 6 00 火 9 80 c m s/ ’ 上清液供检测 .
U D P G P P L a se 电镜细胞化学定位 :反应原理和制样程序参照李里馄等方法 ` ’ {稍加修改 `
不 同之处 在于反应液中加入疏基 乙醉 , 有利于较长时间保存酶活性 . 对 照实验有 : 1) 在不含
U T P 的介质中保温 ; 2 )在不含 G 一 1一 P 介质中保温 ; 3) 在不含 U T P 和 G l 一P 介质中保温 ; 4 )保
温前样品经 8 0 ℃处理 30 m in ; 5) 在含 10 m m ol l/ N o F 的完全介质中保温 ;幻用 p一甘油磷酸
钠代替 U T P 和 G 一 1一 P 的介质中保温 ; 7) 不经保温处理 ,行常规电镜制样 .
2 实验结果
2
.
1 甜菊叶片细胞 U D P G P PI , as e 的纯化
甜菊叶片细胞 U D P G P P L a s e 提取纯化过程结果见表 1 . 在 D E A E 一纤维素柱层析中 ,该酶
活性峰出现于含 0 , 4 m ol l/ N o CI 洗脱部分 (图 l ) ; 在葡聚糖凝胶柱层析中 ,该酶活性峰出现于
42 管至 54 管处 (图 2) . 整个纯化结果是该酶被纯化 16 6 倍 .
丧 1 U DGP P P L a : e 纯化过程
T a b
.
1 S u m m a r y o f P公r if ie a t i o n o f U D P G P P L a : e
步 体积 ( m l ) 总蛋白 ( m g ) 总活性 ( u ) 比活性 (u / m g ) 产率 ( % ) 纯 化倍数
059610.15.7粗酶液
硫酸按分级
D E A E
一纤维素 1犯 一 32
葡聚搪凝胶 G 一 20 0
3 0 5
36
.
5
0 4 63
.5.4165
3 40 2
.
5 2
.
6 9 6
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-厦门大学学报 (自然科学版 ) 1 93 9年
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图 1 U D p ` P P L a , 。 的 D E A E 一纤维柱 层析 . 活
性 峰出现 千 1 12 至 1 27 管处一口一 A 2 80
一口一 U D P G P P L u s e
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卯 a r s f r o m N o . 11 2 r o N o . 1 2 7 t u b e
图 2
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.
2
U D PG P PL a s e 的葡聚糖凝胶 G 一 20心柱层
析 、 活性峰出现于 42 至 5 4管处
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F元g · 一口一 A 2 8 O一 · 一 E n Z ym e a e l i v i t v
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5 4 t u b e
2
.
2 甜菊叶片细胞 U D P G P P L a o e 的基本特性
u D P G P P L as
e 最适反应温度 : 本试验温度为 23 一 41 ℃ ;结果如图 3 ,表明在检测温度范
围内 , 温度与酶活性呈抛物线关系 ,最适反应温度为肥 ℃ . 当 41 ℃时该酶活性大部分丧失 将
该酶于 23 、 32 、 41 ℃下预保温 , 巧 m in 后取出迅速冷却 , 后在实验条件下测定酶活力 , 其结果
与上述相符 .
.
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似即60和ē ,2。钟匕.。若、ù口盆à
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二 价 阳 离 子 对 U l ) P G
P P L a s e 的影响
T h 七 e ff e e t s o f b i v a ] e n t
e a t i o n o n U D P G
P PL
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匕ō之乞曰
图 3
影响
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.
3
盆度对 U D P G P P L a s 。 的 图 4
T h e e f fe e t s o f t e m p e r a
t u r e o n U D PG P P L a s e
p H 对 U D P G P P L a 、 e 的影 图 5
响
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.
4 T h e e ffe e t s o f p H F ig
.
5
o n U D PG F P L a s e
U D (P 分 P P aL s e 的最适 p H ;分别选择不同 P H , 待热变性处理终止第一步醉促反应后 . 用
第 5期 陈睦传 等
:甜菊 叶片细胞 U I )P P GP Las。 墓本特征 及电镜细胞化学定位 · 67 3
适当浓度的 N aO H或 H CI将反应 ( l )混合液的 pH调至第二步酶促反应所需的 pH.后进行第
二步反应 .反应 (一 )混合液含等量的酶制剂 、 20 m mo l / LTs : rI f Ci、 Z m mo l / L G一 1一 p、 1 m mo l /
P u T L和 5 n rI n` , l / x M g c I 2 . 在 3 2 C 下反应 1 0 m i n , 结果如图 4 , U D P G P P L a s e 催化作用的
最适 p H 在 5 0 左右 . 二价阳离子对 U D P G p p L a s e 的影响 :选取 C a ’ 斗 、 M g , ` 、 M n “ 、 Z n , 一 4种
二价阳离子及细胞化学捕获剂 r h , , 在 l 、 2 、 5 m m d / L 和 10 m m ol / L 4 种不同浓度下 ,分别检
测对 U D P G P P L o S 。 活性的影响 , 结果如图 5 所示 . 4 种阳离子对该酶有不同程度的激活作用 ,
其中 Z m m ol 八 C a , 一 提高酶活 15 . 4% ; s m m ol [/ M g卫小提高酶活 16 . 9% . P卜, 十 对该酶有较强
烈的抑制作用 , 在 。 ~ Z m m ol l/ 范围内抑制作用幅度显著 , 如 Z m m ol 八 J 时可抑制酶活 39 .
2 %
.
2 m m ol / L 后其抑制幅度较平缓 .
2
·
3 U l ) p G P P I
J a s e 亚细胞定位
U D P G P P I
, a s e 亚细胞分级分离结果如表 2 . 该酶活性的 9 5肠分布于 d 6 0 0 0 x 9 8 0 e m / 5 2
土清液 , 2 . 1%分布于 46 0 0。 又 98 0 c m s/ 2 沉淀 , 两部分酶比活性分别为 0 . 4 7 6 和 0 . 2 4 6 ( U / m g
蛋白 ) . 明显地高于其它各级沉淀 , 表明甜菊叶片细胞内该酶主要分布于细胞质可溶性部分和
微粒体部分 .
表 2 细胞分级中的 U D兀 P P L邢 e 活性
T a b
.
2 T h
e e e
l !
e
l a s s 主右e a t i o n o f t h e 孔 e t i a n o f U D PG P PL a s e
细胞分级 蛋白质 ( m g ) 总活性 ( u ) 比活性 (u / m g 》 总活性的 ( % 》
1 70「一丫 9 8 O c m /、 ’ 沉淀
马 0 0 0 丫 9 8 0 r n / 、 ? 沉淀
2 0 0 0。 万 , 匕(一 c nr / , ’ 沉淀
4 60 0 0 又 , 匕。 ; m , s ` 沉淀
4 6 00 0 丫 g s o e m / 5 2 清液
4 2
.
( ) 1
.
3 6 0
.
0 3 2 0
,
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2
,
74 0
.
15 0 1 尽5
0 0 9 9 1
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氏.17
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.
4
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.
2
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5 5 0 24 6 2
.
10
16 0
.
0 2 0
.
4 7 6 94
.
45
细胞化学定位结果表明 , U D P G P P L a s e 主要定位于液泡 、 高尔基扁平囊和高尔基小泡 ,
而细胞核 、 叶绿体 、线粒体 、 微体 、 内质 网等均没有高电子密度的沉淀物 . 图 6 示 U D P G P P L as e
同时定位于液泡和高尔基体的较典型照片. 而有时仅见于液泡 、 或仅见于高尔基体 , 另一部分
仅有微弱的活性 (图 7 , 8) . 反应液中不加 U T P 和 G 一 l 一 P 时 , 细胞内没有阳性反应产物 . 反应液
中仅加入 U r P 时 , 液泡膜或液泡内仅有微弱的阳性反应 . 反应液中仅加入 G 一 1一 P 时 . 阳性反
应则发生在质膜和细胞壁 、 而液泡和高尔基体呈阴性反应 . (图 9~ l ” . 如保温前将样品在 80
℃处理 3 0 m in ,或在反应液中以 p 甘油磷酸钠代替 U T P 和 G 一 1一 P , 细胞内均呈阴性反应 . 上述
试验结果表明液泡 、 高尔基体是 U D P G 的合成场所 .
3 讨 论
3
.
1 甜菊叶片细胞 U D P G P PI J a s e 的纯化及特性
甜菊叶片细胞 U D P G P P L as 。 与其他学者 ! ’ “ “ ’ , ’从绿 豆 、 玉米 、 小麦和阔叶树等植物不同
组织中的 U D P G f)I ” L。 、 e 具有大致相似的纯化性质 . 在硫酸钱分级沉淀时 ,酶活性主要分布于
3 68
· 厦门大学学报 (自然科学版 ) 1 939年
)( 5 %一 80 %的硫酸按沉淀中 ,收 集 30 线一 80 写硫酸按沉淀可得到 10 %酶活性 . 在进一步纯化
过 程中 . 1 ) E A E 一纤维素等阴离子交换剂适合于该酶的纯化 . 实验结果表明 ,不同来源的 U D P G
P P L as e 具有大致相似的离子性质 .
在检测甜菊叶片细胞最适 pH 时 , 采用热变性处理是较理想的 . 它排除了过去大部分学者
采用蛋白质变性剂处理时 ,由于部分蛋白质变性剂残留在反应系统中而妨碍偶联外源酶的第
二步反应的弊病 , 其最适 pH 慎约 8 . 0 ,与迄今已知的大部分植物 U D P G P P L a s 。 最适 p H 在中
性弱碱性范围者相似 . 此外 , 与大部分植物不同之处是甜菊叶片中 U D P G P P L as e 对二价阳离
子没有绝对依赖性 ,尽管 M g卜 、 z n Z ` 和 C a 含+ 对该酶均有一定激活作用 , 然而在没有二价阳离
子存在条件下 , 该酶仍然具有相当高的活性 , 对黄豆 、 高粱等来源的 U D P G P P L a se , 毫摩尔浓
度的 M g , ’ 是该酶的最适离子条件 ’` , 了’ .
3
.
2 甜菊叶片 U D P G P PI J as e 的亚细胞分布及作用问题
迄今有关植物来源的 U D P G P P L as e 亚细胞分布的资料几乎均由亚细胞分级分离结果获
得的 . 本研究除亚细胞分级分离外 , 还用电镜细胞化学定位法加以论证 . 甜菊叶片亚细胞分离
时 , 有 94 . 5% 活性分布于 46 0 0 义 9 80 c m s/ , 上清液 , 2 . 1%活性分布于沉淀 . 这与燕麦胚芽
鞘 、小麦胚芽等来源的 U D P G P P L as e 活性分布基本一致 「’ 〕 . 并与电镜细胞化学定位结果相吻
合 . 从大量电镜照片上可和电子致密度较高的 U D P G P P L 。 * 可同时存在于液泡 、 高尔基扁平
囊和高尔基小泡 . 当然在某些照片上可发现 ,该酶仅存在于液泡 ,或高尔基体之上 . 推测在细胞
内可能存在多个糖基供体 U D P G 库 , 以便最经济最有效的为碳水化合物的合成提供 U D P G ,
这些 U D P G 库可能由具有不同亚细胞分布的 U D P G P P L as e 同工酶产生 , 具有不同的调节机
制 . 因细胞形态建成中许多物质的合成都需要 U D P G . 这一推论有待进一步证实 ,
参 考 文 献
李里馄等 . 甜菊叶肉细胞 F D P a se 和 U D PG 焦碑酸化醉的电子显徽镜细胞化学研究 . 中国科学 ( B 辑 ) .
19 8 7 , ( 1 1 )
; 1 17 4 ~ 1 1 8 4
陈睦传等 . 甜菊叶片细胞液泡系的电镜观寮 . 植物学报 . 1 9 8 3 , 25 (5 ) : 4 26 ~ 4 30
洪维廉等 · 甜菊不同叶龄细胞结构及其甜菊糖昔含 t 分布的研究 . 武汉植物学研究 , 19 8 7 . 5 : Z n ~ 2 20
D a r i s e M e t a l E n z y m a t i c t r a n s g l u e o s y la t io n o f
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s o s id e a n d t h e
s t r u e t u r e一 s w e e t n e s s r e l a t io n
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B i co 无r从 . ,1 . ] 9 88 , 2 5 5 : 3 9 1~ 3 9 6
厂u k u n a g a Y e t a l . E n z卿 a t 一e 士r a n s g l u e o s y l a t i o n p r o d u e t , o f s t e v i o s id e ; eS p a r a t i o n a n d S w e e t n e s s 一 e v a lu -
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A g优 · B i汉 · C从m 二 1 ,吕9 . 5 3 : 1 6 0 3~ 1 60 7
G i o m fa g o a T o t a l
. 衍 n t l s i, o f 仁H ] g ib b e r e ll in : f r o m s t e v i o l u s i n g t h e f u n g u s g ib b e r e ]la f ijik u or i . 尸勿 ` o -
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第 5期 陈睦传等 :甜菊叶片细胞 UDG P P P La s e基本特征及电镜细胞化学定位 。3 9 6
S tud is eo n theBa s i eC ha a r e ter is ti esa nd Sub e el l ula r
La o el ia zti o nof UDG P P P La s ei n the La v e es e el l
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D E A E
一晓 Il u lo s e a n d S e p h a d e x , U D P G P P L a s e w a s p u r i f ie d 1 6 6 f o ld s . T h e o p t im a l t e m p e r a -
t u r e f o r t卜e r e a e t io n o f t h e e n z y m e w a s 3 2℃ . t卜e o P t im a l P H w a s 8 . 0 . Zm m o l / 1 C a Z+ a n d s
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61 ( j厦门大学学报( 自然科学版)1 99 3年
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图 6一 8 经 U D P G P PI as e 完全介质保温 , 图 ` 示该酶定位于液泡和高 尔荃体 . 丫 10 1。 。 ; 图 7 示该酶定位于
液泡 , 丫 1 0 1。 。 ,图 8 该酶定位于 高尔基体 . 义 10 00 . 图 9 . 在不 含底物 u T P 和 G 一 1 一P 介质中保温 .细胞内无
阳 性反 应 . 丫 4 。 `0J ;图 10 在不含 G 一卜 P , 仅含 U T P 介质中保温 ,液泡膜及液泡内有微弱阳 性反应. 丫 4 0 0 .
图 11 . 在仅 含 G 一 l , P . 而不 含 u T P 介质中保温 ,仅在质膜和细胞壁出现微弱阳性反应 , 而 v 、 G 均没阳性反应 、
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