全 文 ：第 3 2卷 增刊 1
19 9 3年 , 月
反门大 学学很 ( 自然科学版 )
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19 9 3
甜菊叶片细胞过氧化氢酶
电镜细胞化学定位 ④
陈睦传 吴 芳 洪维廉 沈明 山 陈爱萍② 吕文 渊②
(细胞生物学研究室 )
摘要 应用 D A B法 ,探讨甜菊叶肉细胞内过氧化氢酶的亚细胞定位 , 证明了过氧化氢酶
特异性定位于微体的晶格区或基质内 ,其他细胞器均未观察到该酶的反应产物
关键词 甜菊叶片 ,微体 ,过 氧化氢酶 , 电镜细胞化学定位
有关甜菊叶片和根尖细胞的超微结构及微体内晶格区的立体构型的研究 已分别报道 亡) .2J ,
初步证实了微体与甜菊糖昔形成有一定联系 , 并应用连续超薄切片叠加术和 T EM 倾斜台观
察术 , 对晶格区三维构型进行探讨 . 初步认为其构型类似 日本学者 O S u而卿等对培养醉母
( K 人、 沃廿。 , p . 220 1) 细胞微体晶格由过氧化氢酶和 乙醇酸氧化酶有规则 间隔 排列成岩盐型
( N aC I型 )的实验结果 . 本研究应用 D A B 法 (3 . 3 , 一二氨基联苯胺法 ) , 探讨过氧化氢酶在甜菊
不同叶令细胞内的分布 , 为进一步揭示微体晶格区的立体构型 ,阐明微体的结构与功能提供科
学依据 .
l 材料与方法
本实验以厦门大学植物园甜菊试验地和盆栽植株叶片为材料 . 取幼叶和成叶 . 切取小于
。 . s m m ` 的组织小块 , 迅速投入用 。 . 05 nr ol l/ 磷酸盐缓冲液配制的 3%的戊 二醛固定液 (4 ℃
以下 ) , 经抽气固定 Z h , 磷酸盐缓冲液与甘氨酸一 N a O H 缓冲液分别漂洗后转入细胞化学反应
液中 . 该反应液含 5 0 m m o i / l甘氮酸一N a O H 缓冲液 ( p H 1 0 . 0 ) 5 m l、 D A B 10 0 m g 、 3 % H oO , 0 .
工m l , 用前配制 , 各组混合后过滤 , 并调节 p H 至 9 . 。 , 在 37 ℃黑暗条件下定时振荡温育 l h , 经
同系列缓冲液充分漂洗后于 1姚 0 5 0 , 固定液中于 4℃ 下固定 2 h . 漂洗后酒精系列脱水 . 环氧
丙烷过渡 , E oP n 8 12 包埋 . L K B一 8 0 1 型超薄切片机切片 (约 s o n 。 ) ,醋酸双氧铀和柠檬酸铅
双重染色 ; J EM 一 10 0C X ( I )电镜观察 、 拍照 . 对照组如下 : l) 温育反应中不含 H刀 : , 2) 温育反应
液中加数滴 8纬的二甲基 亚枫 (D M SO ) , 3) 将组织块放于 3 %戊二醛液中 于 飞的 ’ C下加热处
结 果
甜菊叶肉细胞内过氧化氢酶特异性分布
理2乙
本文 1的 3一 0 5一 12 收到 : 国家自然科学基金资助项目
细胞生物学专业骨干研讨班教师
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13 〔) . 厦门大学学报 ( 自然科学版 ) 1 9 93 年
应用过氧化氢为反应底物的 3 . 3 ’ 一二氨基联笨胺 ( D A B) 法 , 对甜菊叶肉细胞内过氧化氢
酶定位结果表明 , 该酶特异性定位于微体上 , 而细胞内其他细胞器均未发现有该酶反应的沉积
(图 1 、 2) . 在不同叶龄细胞内 .该酶在微体内沉积部位有所差异 . 如在叶原基分生细胞和幼叶
细胞内 , 此时其微体直径约 0 . 6~ 1. 0 n m , 其内尚未出现晶格状核心区 ,或仅有无特殊形态的
纤丝状或絮状的小核心 . 而过氧化氢酶的反应产物以小颗粒状形态 ,不规则地散在于微体的基
质内 , 或膜缘 . 如图 1示幼叶细胞酶促反应的结果 . 叶绿体及线粒体等均未见反应产物沉积 ,而
微休基质内有明显的高电子致密颗粒散在分布 , 小核心部分电子致密度更高 (箭头所示 ) . 随叶
龄增长 , 微体数 目增加 . 体积加大 〔直径约 15 m m 左右 ) , 其微体内晶格状核心区范围也随之增
大 , 有些微体内晶格状核心 区可占据其体积的 4/ 5 . 当然因切向效应使之外形有正方形 、长方
形 、 卵圆形或多角形等 . 对成叶细胞的 D A B 法检测表明 ,过氧化氢酶反应产物明显地聚积在晶
格核心区 . 图 2 示成叶细胞该酶反应产物的分布 , 而其他细胞器如叶绿体等均未见反应沉积
物 .
2
.
2 几种对照实验结果
l) 在温育反应液中不加反应底物 H ZO Z时 , 在缺氧条件下的微体及细胞内其他部分均未
发现反应产物沉积 ( 图 3) . 2 )在温育反应液中加入数滴 8环 D MOS 时 , 微体几乎被高电子致密
度的反应产物所掩盖 .其他细胞器未发现反应沉积物 (图 4) . 3) 组织块于 3%戊二醛液中 10
℃加热 30 m in 后 ,细胞器部分解体或损伤 ,而微体外形尚可辨认 ,晶格核心 已消失 ,基质散乱 ,
过 氧化氢酶活性 已丧失 (图 5) . 4) 常规电镜制样的细胞内 , 微体晶格清晰 , 但电子致密度较低
(图 6 ) .
3 讨 论
3
.
1 过氧化氢酶在甜菊叶片细胞内定位的专一性问题
许多学者研究已证明 ,植物细胞内的微体主要有两种类型 : 一是在绿色组织细胞内的过氧
化物体 ( P er ox i s o m e ) ,它与叶绿体 、 线粒体紧密相靠 ,共同完成光呼吸代谢过程 ;其特征标志酶
是过氧化氢酶和乙醇酸氧化酶 . 另一种是在种子或根尖等非绿色组织细胞内的乙醛酸循环体
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, 它与脂质体或园球体等共同完成脂类转化为碳水化合物的代谢过程 :7J . 作者对
甜菊叶肉细胞微体形态结构观察结果初步认为它属于过氧化物体类型〔` , 21 . 本研究应用 D A B
法 , 证实了过氧化氢酶特异性定位于微体 . 为区别细胞内过氧化物酶或细胞色素氧化酶等均可
使 D A B 氧化产生高电子致密的反应产物 ,本实验将组织块在常温下用戊二醛液预先固定 ; 在
温 育反应时将 pH 调至碱性范围 ( pH g . 。 ) , 温 度为 37 ℃ . F aT nk R oe lst 们 曾证实过氧化物酶对
D A B 的氢化活性是该酶未被戊二醛范围固定之前 . eS ils m an 等 〔们 . 证明细胞色素氢化酶对
D八 B 的氧化活性的最适 p H 为 7 . 艺~ 7 . 6 ,最佳反应温度 20 ℃ . 本实验结果与我们对水仙叶片
微体内过氧化氢酶的定位结果基本相似 〔习 .
3
.
2 几种对照处理对反应效果影响
F er d e ir ck
〔` 〕 、 刘丹等〔 3 ,研究认为 , 在温育反应液中不加底物过氧化氢时 , 由于缺少电子受
休 , 在缺氧条件下 , 过氧化氢酶不能催化 D A B 的氧化聚合形成多聚物 , 为此在微体内基本上没
有高电子致密度的反应产物沉积 . 本实验结果与上述其他学者观察结果基本类似 .
将组织块置于 3环戊二醛液中 . 于 10 ℃ 加热 30 m in ,细胞器大部分受损伤 ,细胞质内含
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一 3 2· 厦门大学学报 (自生权科学版 ) 9 1勺 3年
图 l反域产物特异仕沉积在幼叶细胞微体 内 .沐汉 (, 0 口 2 成叶细胞过软化认的待异仕定位 于微
了{ , 核 已、 1刃分布密度较高 丫 38 ( 。 o 图 3 温 存幸夜不加 H : 0 : , t次体电子致密度与常规制样者相近 x 3 3 5 00
日 4 洲育淤中加 IJM S O ,高电子密度的微休被反应产物掩盖 又 4 3 5 0 图 5 组织块经 10 ℃加热处理 ,微
休外形尚可见 , 但欣活性已丧失 又 3 6 沁。 图 6 常规制样的成叶细胞微体 , 晶格核心区大 , 排列规则 ,但电
子致密度较低 \ 月s ( )o o F ;。 . J l h e u r , s u a ]i , y 。 f , 。。。 t ;o 。 。 r o d u e l s 15 d o p o戴: 。 d i n , h e y o u n g 一。 a f 。 e ! ]5 m i e r o -
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