全 文 ：植. 嗽 件 场、 V娇织 , 兵呆人写、 寸孚 、 ~ .芝八%
A
c ta B o to n 泣e a 战n 让 a
白香草木橱游离培养细胞高频率
再生植株的激素调控
李风霞 安利佳 张俊敏 罗希明 何孟元 郝 水
(东北师范大 学生物 系 , 长春 13 0 0 2 ` )
摘 要
从白香草木择 ( Me il 如如￡ a如绍 乙触邵 . )胚轴外植体诱导愈伤组织 。 将已分化芽的愈伤组织转
入含有不同浓度 2 , 4一 D l( 一 4m g / )L 和 6 B A (0 . 2一 s m g / )L 的 A x 培养基中进行液体振荡培养 ,
得到细胞密度不同的 9 个细胞系 。 将细胞密度较大的 4 个细胞系置于含有不同浓度 2 , 4一 D
(0
·
5一 Zm g / )L 和 6B A (0 . 1一 Zm g / )L 的 A y Z培养基中液体浅层培养 , 只有 L : 细胞系可再生愈
伤组织 。 将愈伤组织转人含有 0 . Zm g L/ 2 , 4 一 D 的 fA 、培养基中 , 可分化出大量的幼芽 。 将幼芽
转入去掉 2 , 4一 D , 另外附加 l m s/ L 赤霉素的 fA : 培养基中 , 幼芽继续发育成幼苗 。 在 0 . 5一 l m g /
L Z
,
4
一
D 和 0 . 7 m g / L 6 B A 条件形成的单细胞愈伤组织 , 具有高频率再生植株 ( 7 9 3 . 3 %一
1 1 2 7 % )的能力 。 较低浓度的 2 , 4一 D 可以明显提高单细胞愈伤组织的分化频率 。
关键词 白香草木挥 ;游离培养细胞 ;高频率 ;再生植株
H O R M O N E R EG U L A T I O N IN H IG H
一
F R E QU E N C Y P L A N T R E G E N E R A T I O N
F R O M IS O L A T E D C U L T U R E C E L L O F
,压I E L I L O T U S A L B U S
L i Fe
n g
一 x ia , A n L i
一
ji a
,
Z h a n g J u n
一
m i n
,
L u o X i
一
m i n g H e M
e n g
一
y u a n a n d H a o S h u i
(浇脚 ,白 7记 . 亡。了而勿夕, , 八b r￡he a品 入 )脚 ;an 1 U n z卿威即 , C h a n g e h u n 1 300 24 )
A b s t r a e t
C a l l w e r e i n d u e e d f r o m Pl u m u la r a lst
“乞竹ilo 妙_嘿“ ’ ` 一 ”
)
`不“ m 吕 /切
。 n g w n 飞c n 几 w e T e 仁、
a n d 6B A ( 0
.
2一 s m g / L ) f o r v i b r a t -
1 1 9
i n A y Z m e d i a e o n at i n in g Z
,
4
一
D ( 0
.
5一 Zm g / L ) a n d 6B A ( 0 . 1一 Zm g / L ) a n d o n l y e e l l in e , L S f o r m e d c a l l i . T h e c a l li w e r e
t r a n s f e r r e d o n ot A f
,
m
e
d i u m e o n at in i n g 0
.
2 m g / L Z
,
4
一
D
,
w h e r e m a n y y o u n g b u d s w e r e d if f e r
-
收稿 日期 , 19 9 1一 0 4一 0 5 接受日期 : 19 9 2一 0 6一 24
5期 李风霞等: 白香草木择游离培养细胞高频率再生植株的激素调控
entia t ed
,
t h e b u d s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d o n t o A f : m e d i u m ( A f
, 一 2 , 4一 D + l m g / L G A 3 ) , w h e r e
t h e y d e v e l o衅 d i n t o y o u n g s e e d l n s s c o n t in u o u s ly . H i g h r e g e n e r a t i o n f r e q u e n e y ( 7 9 3 . 3环一
1 1 2 7 % ) o f e a lil w
e r e o b at in
e d f r o m is o la t e d e e lls e u l t u r e d i n 0
.
5一 l m g / L Z , 4一 D , 0 . 7m g / L
6 B A
.
D i f f e r e n t ia t i o n f r e q u e n e y o f ca l li f
r o m iso l a t
e d e u lt u r e e e ll
s w a s i n e r e a s e d o n ht
e
m e d iu m
e o n扭 in i n g l o w e r e o n e e n t r a t l o n o f Z , 4一 D .
K e y w o r d s M
e l乞勿 ut s a 场. 5 . D e s r . ; I s o l a t e d e u l ut r e e e ll s ; H i g h 一 fr e q u e n e y ; lP a n t r e g e n e r a t i o n
白香草木挥 ( eM的加。 a 必韶 D es r . )是一种优良豆科牧草 ,关于它的离体培养 ,仅有少量
研究报告 。 T ia ar 等 ( 19 7 ;)[ 仪寸其进行组织培养和细胞培养 , 仅得到愈伤组织 。 J ho sn on 等
( 1 98 2) [
3〕对其进行原生质体的分离和培养 , 仅见细胞分裂 。 关于白香草木择离体培养的植
株再生 , 尚没见成功的报道 。 为了利用细胞工程技术筛选具有优良性状的遗传突变体 ,从
而达到选育优 良品种的 目的 , 我们对白香草木裤进行了单细胞培养 ,并探讨了植物激素对
单细胞高频率再生植株的影响 。
材料和方法
白香草木挥种子采集于吉林省西部草原 。 种子在浓硫酸中浸泡 4分钟 , 再用 0 . 1肠氯
化汞溶液灭菌 3 分钟 ,无菌水冲洗 4 次后 ,接种在不含激素的固体 M S 培养基中 。 种子萌
发 3 天后 ,将胚轴切成 1一 Zm m 的切段 ,接种在 A y l 培养基 (表 1) 中诱导愈伤组织 。愈伤组
织 的诱导条件为 27 士 1℃ , 暗培养 。 当诱导出的愈伤组织长到 s m m 时 ,转入赶 , 培养基 (表
1) 中分化 。 愈伤组织的分化条件为 : 白天不高于 27 ℃ ,夜间不低于 18 ℃ ; 1 5 0 0一 2 5 0 0 x1 以
自然光为主的照光 , 日光灯补充照明 。
为了获得细胞分散性较好的细胞悬浮系 ,挑选已分化出幼芽的愈伤组织 ,切碎后转入
A x 培养基 (表 1) 中 ,以 S Oml 液体培养基加入 19 鲜重愈伤组织的比例 , 进行旋转式振荡培
养 ( 1 4 o r / m in) 。 每隔 5 天换液一次 。 振荡培养 40 天后 , 用 64 卜m 镍丝网过滤细胞悬浮液 ,
得到游离的单细胞 。
用沉淀的方法将单细胞从滤液中取出川 , 以 1 0 5 个 /m1 的密度将细胞悬浮于液体 A y Z
培养基 (表 l) 中 。 取 s ml 细胞悬浮液置于直径 sc m 的玻璃培养皿中 ,进行液体浅层培养 。
培养条件为 : 27 士 l ℃ ,静止暗培养 ,每隔 7 天加入 1 . sml 新鲜培养液 。 当愈伤组织长到
1一 Zm m 时 , 移到固体 A y : 培养基 中增殖 。 愈伤组织增殖到 s m m 时 ,转人 A f l 培养基中分
化 。 愈伤组织分化出幼芽以后 ,转入 A f , 培养基 (表 l) 中使幼芽继续发育成幼苗 。 当幼苗
长到 3一 sc m 高时 ,转入 sA 培养基 (表 l) 中生根 。
结果和讨论
白香草木挥胚轴切段接种在 A y , 培养基 (表 1) 中 , 1 周左右开始出现愈伤组织 , 1个
月左右增殖到 s m m 。 将愈伤组织转入 A f , 培养基 (表 l) 中 , 10 天左右分化出芽 。 将已分化
出幼芽的愈伤组织切碎 ,转入 A x 培养基 (表 1) 中振荡培养 40 天 , 可得到 由细胞团和游离
植 物 学 报 5 3卷,
表 l 白香草木娜单细胞培养和植株再生所用培养墓
介 b l e 1 M ed i a f o r m o n o ce l l e u l t u r e a dn P l a 们t r e g e n e r a t i o n o f 刀七l翻d忿妞 s 口历“ s
培养基成分 A y z fA 1 A X A y Z A f Z A S
M 目i um com p
.犯 i it 面 ( m g / L )
M邓 0 一 7H 2 0 4 0 0 2 0 0 4 0 0 4 0 0 2 0 0 1 0 0
C a C 12 2 H Z O 6 6 0 3 3 0 6 6 0 6 6 0 3 3 0 1 6 5
K N 0 3 1 9 00 9 5 0 1 9 0 0 19 0 0 9 5 0 4 7 5
N H 月N 0 3 1 65 0 8 2 5 1 6 5 0 16 5 0 8 2 5 4 1 3
K H Z P O 月 1 7 0 8 5 1 7 0 17 0 8 5 4 3
微量元素 M ict oc 肠二nt B 5 l / 2 B S B 5 B 5 l / 2 B S 1 / 4 B S
有机成分 or gan ic c om p o n e n st B 5 1 / 2 B S B 5 B 5 l / 2 B S l / 4 B S
甘氨酸 Ol y 2 2 2 2 2 l
泛酸钙 。 k i u m p a n t o比 e n a t 。 5 0 0 l l 1 l 0 . 5
生物素 iB ot 迈 3 0 0 0 0 0 . 5 0 . 5 0 . 5 0 . 5 0 . 2 5
腺昔 ^ d e n os 加 e l 0 . 5 5 0 0 0 . 5 0 5 2 5 0
天冬氨酸 A sP 0 7 1 2 0 0 0 0 l l 2 00 0 0
半胧氨酸 c ys 0 . 2 1 1 0 0 0 0 l l 0 . 5
水解乳蛋白 c~ hy dr
of y sa et 5
.
8 5 0 0 1一 4 5 0 0 5 0 0 0 . 5
蔗糖 su 。 二e 10 0 0 0 0 。 2一 8 2 0 0 0 0 10 0 0 0 2
葡萄糖 lG u哪 e 2 0 0 0 0 0 . 2 1 0 0 0 0 2 0 00 0 5 . 8
2 , 4一 D 0
.
2 5
.
8 0
.
5一 2 0 . 7
6 B A 0
.
7 0
.
1一 2 0 . 2
N A A 0
.
2 0
.
2 l
G A 3 5
.
8 5
。
8 5
。
8
IB A
P H
细胞组成的细胞悬浮液 。 经 64 林m 镍丝网过滤后 , 共得到 g 个细胞密度不同的细胞系 (编
号为 L :一 L。 ,见表 2 ) , 在这些细胞系中 ,单细胞约占 9 7 . 4% ,其余的则是处于两细胞的小
细胞 团 。 细胞系细胞密度的不同是由 A x 培养基中 2 , 4一 D 和 6B A 浓度的不同决定的 。 A x
培养基中 2 , 4一 D 浓度较大时 ,得到的细胞系细胞密度较大 ;而 6B A 浓度较大时 ,得到的细
胞系细胞密度较小 。 在较高 2 , 4一 D ( 4m g / )L 和较低 6B A ( 0 . Zm s/ )L 浓度条件下 ,得到的 L 3
细胞 系细胞密度最大 ( 5 . 1 x 1 0 ` 个 / m l ) ;而在较低 2 , 4一 D (一m g / L )和较高 6 B A ( s m g / L )浓
度条件下 ,得到的 L 7 细胞系细胞密度只有 7 . 3 x 一o ` 个 / m r (表 2 ) 。 K u m a r 等 ( 一9 5 5 ) [` j的研
究表明 , 2 , 4一 D 可以增大虹豆细胞悬浮系的细胞密度 。 我们的结果表明 , 在建立 白香草木
择细胞悬浮系过程中 , 2 , 4一 D 也有这种作用 。 与此相反 , 6B A 有降低细胞系细胞密度的作
用 。 因此 ,过低的 2 , 4一D 和过高的 6B A 浓度都不利于得到细胞密度较大的细胞系 。
表 2 A x 培养基中 2 , 4一D 和 6B A 对细胞系细胞密度的影响
T . b le 2 E f ce 妇 of Z , 4 一 D an d 肠B A 恤 A x m de 主u m o n e e l】d e ns i t y o f e e l il n e s
2 , 不D 阮哪 L〕 r 一 2 4 1 一 2 - 一 4 一 1 2 - 一 4
6B A ( m g L/ ) 0
.
2 0
.
2 0
.
2 2 2 2 8 8 8
细胞系编号
N o
。 。 f C e l l i n 留 L
l L Z L 3 L 今 L S L 6 L ? L g L ,
细胞密度 (个 / m l)
C e ll d en s i t y 3
.
6 X 10 3 2
.
7 X 1 0 s 5
.
I X 1 0 6 6
.
2 又 10 2 7 . 7 X 1 0月 1 . 3火 1 0 6 7 . 3 X 1 0 1 2 . 9 X 1 03 8 . 4火 1 03
( ce l
s / m l )
5 期 李风霞等 :白香草木择游离培养细胞高频率再生植株的激素调控
将细胞密度较大 (0 2`一 20 6个/ ml)的L , 、 L : 、 L 。 和 L。 细胞系 (图版 I , 1 ) , 在 A y Z 培养基
(表 1) 中进行液体浅层培养 , 1一 2天时可见细胞分裂 (图版 I , 图 2 ) , 3一 4 天可见第二次分
裂 (图版 I , 3) , 15 天左右形成细胞 团 (图版 I , 4 ) 。 L : 和 L S 细胞系在 30 天左右时可形成 1一
Zm m 的小愈伤组织 (图版 I , 5 ) , L 3 和 L 。 细胞系未见小愈伤组织形成 。 将这些小愈伤组织
转入固体 A y : 培养基中 ,来自 L S 细胞系的小愈伤组织再经 20 天左右可增殖到 s m m (图版
I
,
6 )
,而来 自 L : 细胞系的小愈伤组织不再增殖并褐化死亡 。 这说明 ,在建立白香草木择细
胞悬浮系过程 中 , A x 培养基中的 2 , 4一 D 和 6B A 不仅影响着细胞系的细胞密度 ,而且影响
着细胞系再生愈伤组织的能力 。 在较高 2 , 4一 D 和较低 6B A 浓度条件下得到的 L Z 、 L : 和 L 。
细胞系尽管细胞密度较大 ,但却丧失了再生愈伤组织的能力 ,影响愈伤组织的增殖 。 只有
在适当的 2 , d一 D (2 m g / )L 和 6 B A (2 m g / )L 激素条件下 ,才能得到细胞密度较大 , 又具有较
高再生愈伤组织能力的 L S 细胞系 。
L
S 细胞系在 A y : 培养基 中液体 浅层培养时 ,在 6 B A 浓度相同条件下 , 1 m g / L Z , 4一 D
时的愈伤组织再生频率明显高于 0 . 5 或 2 m g / L 时的再生频率 ;而在 2 , 4一 D 浓度相 同条件
下 , 6 B A 浓度增大时 ,愈伤组织的再生频率也增大 (表 3 ) 。 显微镜下的观察表明 , 0 . s m g / L
2
,
4
一
D 时 ,细胞分裂频率较低 ,形成的细胞团数量较少 ; 2 m g L/ 2 , 4一 D 时 ,细胞分裂频率虽
然较高 ,但分裂后的细胞之间连系得较松散 ,较难形成致密的细胞分裂中心 。 因而在这两
种 2 , 4一 D 浓度中再生出的愈伤组织频率较低 。 0 . s m g / L Z , 4一D 时 , 细胞分裂频率虽然低
于 2 m g / L Z , 4一 D 时的分裂频率 ,但形成的细胞团大多具有细胞分裂中心 , 因而再生愈伤
组织的频率较高 。 显微镜下的观察还表明 , 6B A 浓度较低时 , 具有细胞分裂中心的细胞团
数量较少 , 因而再生出的愈伤组织数量也较少 ; 6B A 浓度较高时 , 具有细胞分裂中心的细
胞团数量较多 ,因而再生出的愈伤组织数量也较多 。 以上结果表 明 , 2 , 4一 D 和 6B A 对白香
草木挥单细胞再生愈伤组织的影响 , 主要是通过影响细胞的分裂频率和具有细胞分裂中
心的细胞团数量来实现的 。 只有在适当的 2 , 4一 D ( l m g / )L 和 6 B A (0 . 7一 Zm g / )L 激素条件
下 (表 3 ) ,才能使 L 。 细胞系既保持着较高的细胞分裂频率 ,又能产生较多的具有细胞分裂
中心的细胞 团 , 因而才能再生出较多的单细胞愈伤组织 。
表 3 A y : 培养荃中 2 , 4一 D 和 6B A 对 L s 细胞系愈伤组织的再生和分化的形响
T a b l e 3
`
E f f e e ts o f Z
,
4
一
D a n d 6 B A in A y Z m de i
u
m
o n r e ge n e r a t io n a耐 d i f f e r e nt i a iot n o f ca l l i f r o m L S ce l l l in e
2 , 4
一 D ( m g / L )
6 B A ( m g / L )
愈伤组织编号
C 洲`」e n o 。 。 f 比 111
再生频率
R e罗 n e r a t i o n
f r叫 u en e y ( 纬 )
分化频率
D 廿f e r e n t i o 门
f r e q u e n cy (% )
:
`
:
1 2 0
.
5 1
0
.
1 0
.
1 0
.
7 0
.
7
2 0
`
5
0
.
7 2 2
C 1 C Z C 3 C 4 C S C 6 C 7 C S C g
1 7
.
5 3
.
5 8 3 6 5
.
5 12 4 9 1 4 5
1 2 3
.
6 9 0
.
7 8
.
1 1 1 2 7 7 9 3
.
3 8 9 2 3
.
2 1 6
、
2 2
.
7
将在含有不同浓度 2 , 4一 D 和 6 B A 的 A y : 培养基 中再生的单细胞愈伤组织 (编号为
1C 一9C , 见表 3) ,分别转入 fA , 培养基 (表 1 ) ,约 1 周分化出芽 ( 图版 I , 7) 。 将分化出的幼
芽转人 A f : 培养基 (表 1) 中 , 幼芽发育成幼苗 (图版 I , 8 ) 。 将 3一 sc m 高的幼苗转入 sA 培
植 物 学 报 35 卷
养基( 表) l中 , 1周左右开始生根 ,成为再生植株 ( 图版 I , 9 ) 。 A y Z 培养基中 2 , 4一 D 和 6B A
浓度的不同 , 不仅影响单细胞再生愈伤组织的频率 ,而且影响再生出的愈伤组织的分化能
力 。 在 .0 5一 1 m g / L Z , 4一 D 和 0 . 7 m g / L 6 B A 条件下再生的 c ; 和 C 。 愈伤组织 ,具有高频率
再生植株的能力 ( 7 9 3 . 3%一 1 12 7% ) ;而在其它 2 , 4一D 和 6 B A 激素条件下再生的愈伤组
织 ,其分化率仅在 2 . 7 %一 1 2 3 . 6 %之间 (表 3 ) 。
本实验还表明 ,将增殖到 s m m 的单细胞愈伤组织先转入含有 0 . 2 m g / L Z , 4一 D 的 A fl
培养基中 , 可分化出大量的幼芽 ,这些幼芽转入去掉 2 , 4一 D 的 A f Z 培养基 中之后 , 可发育
成丛生苗 。 如果将增殖后的愈伤组织先转入 fA Z 培养基中 ,则只能分化出少量的幼芽 ,进
而发育成单株苗 。许多人的研究表明 ,较低浓度的 2 , 4一 D 可以促进某些豆科植物的愈伤组
织分化 .z[ “ , “ ,幻 。 我们的工作表 明 ,在 白香草木挥单细胞愈伤组织分化时 ,较低浓度的 2 , 4一 D
(0
·
2 m g L/ )可明显提高愈伤组织的分化频率 。
参 考 文 献
〔 1 〕
[ 2 」
〔 3 〕
[ 4 〕
[ 5 〕
[ 6 〕
[ 7 ]
〔 8 〕
安利佳 、 罗希明 、 张俊敏 、 李凤霞 、 李方元 、 郝水 , 1 9 9。 : 人参单 细胞悬浮培养再生植株 。 科学通报 , 1 5 : 1 1 8。一
1 18 3
。
G am bor g
.
0
.
L
. , B
.
P
.
D a v i s a n d R
.
W
.
S at 川 h u t , 19 8 3 : S o m a t i e em b r y Og e n esl in
e e l l e u l t u r es of 口勿d 触 s P吧 cj es . 尸如月 t C e 左
eR 尹 , 2 : 2 0 9一 2 12 .
J o h n s on
.
L
.
B
. , D
.
L
.
S t u t e v i l l e , R
.
K
.
H i g日 n s an d H . L . D o u gl as , 1 9 8 2 : P e e t of y as e Y 一 2 3 f o r i s o l a t in g m es o hP y l P r o t o-
lP as t s fr o m se v er a l M目坛C a 夕0 s pe e此 . 了勃侧 S 吮 . 尤心 “ . 2 6 : 1 3 3一 1 3 7 .
K u m ar
.
A
.
5
. , 0
.
L
.
G am ob
r g an d M
.
v
.
N a b o r s , 1 9 8 8
: P lan t r e g e n e r a t i o n f rom
e e l s u s讲n is on e u it u r es o f F .卯叨
~
翻盔步卜
如刁 J反J几 t 口e 左 eR , , 7 : 1 3 8一 1 4 1 .
K y se l y
.
W
. , J
.
R
.
M y
e r s , P
.
A
.
L a z Ze r i , G , B
.
C o l l i n s an d H
.
J
.
J a e o b s e n , 1 9 8 7
: P 」a n t r e g e n e r a t i o n v i a s om a t i e e m b r二
r
o g e es
n e S l s in pe a (尸交浏仍耐动“ 仍 L . ) . 尸如 . t C e “ eR , , 6 : 3 0 5一 3 0 8
N 日g a r a aj n . P . , J . 5 . M e K e n z 记 即 d P . D . W al t o n , 1 9 8 6 : E m b r y o g e n es is a n d p l a n t r e g e n e r a t i叨 o f 卫司别卯 召尹尹. 1” its 糊
C u 仪牡, e . 尸如几￡浇 U eR , . , 5 : 7 7一 8.0
T应 a . T . , F . A . H as k in s an d H . J . G o r z , 19 7 7 : C a l u s an d s u s pe n s」o n e u l t u r es of 卫七l云肠加 吕 a如 t i s u e a n d e e l l s . 肠 。尹召 ct .
1 7 : 4 0 7一4 1 1 .
W a l k e r
.
K
.
A
. , P
.
C
.
Y u , 5
.
J
.
aS
t o
an d J
a w or
s k i , 1 9 8 0 : T h e h or m o n al e on
t r o l Of o r g a n f o r m a t ion in ca l u s of 对 e d招c a卯
吕硒洲 L . C u l t u r ed 云” 即翻r o . A” 赶毛, , , J . BO 心, 6 : 6 5 4一 65 9 .
图 版 说 明
1
. 悬浮培养的单细胞 。 x 2 60 2 . 细胞的第一次分裂 。 x 3 80 3 . 四细胞期的小细胞 团 。 x 3 80 4 . 细胞团 。 火 2 60
5
. 小愈伤组织 X 0 . 7 6 . 增殖中的愈伤组织 。 伙 0 . 7 了. 愈伤组织分化出芽 。 x l 8 . 丛生苗的分化 。 又 0 . 7 9 . 再生植
株 。 x 0 . 7
E x P l a n a t i o n o f P la t e
F ig
.
1
.
I n d i v id ua l ce l l
s o f
su pe ns
i o n e u l t u r e
.
X 2 6 0 F ig
.
2
.
T he f ir st id
v is i o n o f a e e 11
.
X 3 8 0 F 堪 . 3 . Sm a l
c e l { cl u set
r o f f o u r
一 e e l l s at g e
.
X 3 8 0 F ig
.
4
.
A ce l l e l u s t e r
.
X 2 6 0 F ig
.
5
.
Sma l l ca il
.
X O
.
7 iF g
.
6
.
P r o班 e r a -
it o n o f ea l l i
.
X 0
.
1 7 lF g
.
7
.
B u d s d l f fe
r e n it a t e d f r o m ca l i
.
X 1 F ig
.
8
.
iD f f
e r e n t i a t i o n o f e lu s t e r P l a n it e st
.
X 0
.
7 F ig
.
9
.
R雌 e ne r a edt p la n t l e st . X 0 . 7