全 文 ：高效液相色谱法测定槟榔花粉中的芸苔素内酯
王明月 , 吕岱竹 　(中国热带农业科学院分析测试中心 , 海南海口 571101)
摘要　采用高效液相色谱(HPLC)法测定槟榔花粉中芸苔素内酯的含量。使用C18柱 ,以乙腈:水为流动相 ,采用荧光检测器对样品中的
芸苔素内酯进行测定 ,外标法进行定性定量分析。结果表明 ,该方法快速、灵敏、可靠、具有简便、重现性好的特点。
关键词　槟榔花粉;芸苔素内酯;荧光检测;高效液相色谱法;
中图分类号　O657.7+2　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)04-01305-02
Determination of Brassinolide in Areca catechu Pollen by HPLC
WANG Ming-yue et al　(Analysis and Testing Center, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences , Haikou , Hainan 571101)
Abstract　HPLC was used to determine the content of brassinolide in Areca catechu pollen.With acetonitrile-water as mobile phase and C18 column
used , the brassinolide in samples were determined by fluorescence detector and the qualitative and quantitative analyses were conducted by external stan-
dard method.The results showed that themethod was fast , sensitive and reliable and had characters of convenience and good repeatability.
Key words　 Areca catechu pollen;Brassinolide;Fluorescence detection;HPLC
　　芸苔素内酯(brassinolide)又称芸苔素 、芸苔素甾醇类激
素。天然芸苔素内酯(油菜素内酯)是一种最新植物内源激
素 ,是国际上公认为活性最高的高效 、广谱 、无毒的植物生长
调节剂 ,芸苔素内酯广泛存在于被子植物 、裸子植物和某些
低等植物中 ,从在植物体内的分布来看 ,存在于根 、茎 、叶 、花
粉 、雌蕊 、果实和种子中 ,其中花粉中含有较丰富的芸苔素内
酯。当前 ,测定芸苔素内酯的方法多为高效液相色谱紫外检
测[ 1-4] 、气相色谱法[ 5] 、液相色谱-质谱联用法[ 6] 、薄层色
谱[ 7]等 ,这些方法有些灵敏度不够 ,有些方法繁琐 ,而且均未
涉及有关槟榔花粉中芸苔素内酯的测定方法。因此 ,笔者拟
以乙腈-水为流动相 ,选用荧光检测器的高效液相色谱法对
槟榔花粉中芸苔素内酯进行定性定量测定。以期验证该方
法的准确与灵敏性。
1　材料与方法
1.1　仪器和试剂　Waters高效液相色谱仪 ,配有 1525 泵 、
717+自动进样器 、474荧光检测器 、Empower色谱工作站。乙
酸乙酯 、苯硼酸 、甲醇为分析纯试剂 ,高效液相色谱中使用的
乙腈为色谱纯 ,水为超纯水 ,流动相经0.45μm微孔滤膜减压
过滤。样品为槟榔花粉。
1.2　色谱条件　色谱柱:C18柱(150 mm×4.6 mm i.d.);流
动相:乙腈-水(体积比为 80∶20),用前经millipore溶剂过滤
系统(0.5 μm 滤膜)过滤。流速:1.0 ml/min;激发波长:282
nm;发射波长:700 nm;柱温:37 ℃;进样量:10.00μl。
1.3　标准溶液的配制 　精确称取芸苔素内酯对照品
0.020 0 g ,用甲醇定容到100ml容量瓶中 ,此标准储备液浓度
为 200μg/ml;分别移取 200μg/ml芸苔素内酯标准储备液 0、
0.125、0.25 、1.25 、2.5 ml于 5 ml容量瓶中 ,分别加入 5 mg苯
硼酸衍生化试剂 ,摇匀 ,于 80 ℃恒温水浴反应 30 min ,取出冷
却至室温 ,用甲醇定容至刻度 ,得浓度为 0、5.0、10.0 、50.0、
100μg/ml的芸苔素内酯标准溶液。
1.4　样品处理　准确称取槟榔花粉 5.00 g于 250 ml三角瓶
中 ,加入 50 ml 80%甲醇 ,于低温超声 30 min后并重复 1次 ,
合并提取液并高速离心分离 ,上清液浓缩至 5 ml ,过 C18小
作者简介　王明月(1970-),女 ,福建邵武人 ,高级工程师,从事天然产
物活性成分的分析研究。
收稿日期　2007-09-22
柱 , 洗脱物用20 ml 40 mmol/L的醋酸铵缓冲液(pH值为 6.5)
稀释 ,过DEAE Sephadex A-25和 strata X柱 ,上样后 ,用 15 ml
40 mmol/L的醋酸铵缓冲液(pH 值为 6.5)淋洗 ,芸苔素内酯
保留在 strata X柱中 ,用 10 ml甲醇洗脱 ,加入 5mg苯硼酸 ,于
80 ℃水浴衍生反应 0.5 h ,冷却后经旋转蒸发仪浓缩至干 ,用
乙腈定容至 5ml ,供液相色谱测定 。
2　结果与分析
2.1　试验条件的优化　根据芸苔素内酯的理化性质 ,芸苔
素内酯易溶于甲醇 、乙醇 、丙酮等有机溶剂 ,在水中的溶解度
较小 ,选择甲醇为提取溶剂。从槟榔花粉中提取芸苔素内酯
的方式有很多 ,诸如超声波提取 、恒温震荡 、微波辅助提取法
等。选用提取效率高 、操作简单 、成本低廉 、快速的超声波提
取法 。对超声时间 、丙酮的量 、提取温度 、提取次数等因素进
行优化 ,得到最佳提取工艺条件。试验证明 ,以料液比为:
1∶10 ,提取温度为 10 ℃,超声波(频率 28 kHz ,功率 500 W)作
用时间为 30 min、提取次数为 3次 ,槟榔花粉中芸苔素内酯的
提取率可以达到 95%以上。
据文献报道 ,可选的衍生剂有苯硼酸 、1-氰基异吲哚-2-
间-苯硼酸 、9-菲硼酸 、二茂铁硼酸 、1-二甲胺基萘。在此选择
苯硼酸。比较紫外检测器和荧光检测器对其衍生物的响应
值 ,发现荧光检测的灵敏度比紫外高很多。相同浓度的标准
溶液 ,进样体积相同 ,而荧光检测的灵敏度比紫外检测高 10
倍。同时比较激发波长 282、240、350 nm ,发射波长 319 、568 、
700 nm等几个不同波长的测定效果 ,结果表明 ,在激发波长
为 282 nm , 发射波长为 700 nm时芸苔素内酯的检测灵敏度
较高 。还对流动相进行了优化 ,比较不同配比的甲醇—水 、
乙腈 —水 、甲醇—乙腈—水作为流动相的分离效果 ,结果以
乙腈 —水(体积比为 8∶2)分离效果最好 ,芸苔素内酯的保留
时间仅 6.0min ,芸苔素内酯组分与其他杂质达到基线分离。
2.2　定性与定量方法　在严格控制操作条件不变的情况
下 ,比较已知纯物质与未知组分的保留值来定性。定量方法
用的是外标法 ,即用待测组分的纯样品配制浓度递增的标准
溶液 ,定量进样 ,测量峰面积或峰高 ,以峰面积或峰高对标准
溶液浓度作标准曲线 ,分析样品时 ,按相同操作条件定量进
样 ,由所得的峰面积或峰高的标准曲线上查出该组分的浓
度。芸苔素内酯标准品的色谱见图 1 ,根据标准品洗脱峰的
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008, 36(4):1305-1306　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　庆 　责任校对　马君叶
相对保留时间确定样品中芸苔素内酯的峰位。
图1　芸苔素内酯标准品色谱
Fig.1　Chromatogramof the brassinolide standard
2.3　线性范围 、检出限 、精密度与回收率　在试验条件下 ,
配制不同浓度的芸苔素内酯标准溶液进行色谱测定 ,以峰面
积Y 对标准溶液质量浓度 X(g/L)进行线性回归分析 ,得回
归方程Y =1.02×104X -2.94×103;相关系数 r =0.999 3。
在槟榔花粉样品中分别添加 10.0、30.0、50.0μg的芸苔素内
酯标准溶液(n=6),按方法步骤各自进样 10.00μl ,根据测得
样品中各成分的质量分别计算相应的精密度和加标回收率 ,
结果见表 1。以 2倍于噪声的样品量计 ,最小检出浓度为 0.1
mg/kg。试验证明芸苔素内酯的色谱分析线性关系 、最小检
出浓度 、回收率和精密度均可以满足定量分析要求 。
表 1　方法回收率测定结果
Table 1　Determination results of recovery rate
样品
Sample
含量
Content
mo∥μg
添加量
Addition amount
mA∥μg
测量
Determination
mF∥μg
RSD
sτ∥%
回收率
Recovery rate
%
1 50.0 10.0 61.5 2.8 　　102.0
2 50.0 30.0 74.0 5.4 92.5
3 50.0 50.0 92.0 3.3 92.0
2.4　实际样品分析　在上述色谱条件下 ,准确吸取已制备
好的样品溶液 10.00μl ,注入高效液相色谱仪中 ,用外标法定
量 ,测得结果如表 2 。
表 2　槟榔花粉中芸苔素内酯的含量(n=3)
Table 2　The brassinolide content in areca pollen
样品
Sample
样品中芸苔素内酯的含量
Brassinolide content in samples∥mg/ 100 g
1 2 3 X∥mg/ 100 g
1 1.00 1.05 1.10 1.05
2 1.10 1.08 1.16 1.12
3　结论
(1)文献方法中 ,都是对原药或土壤中的芸苔素内酯进
行测定 ,尚未见到槟榔花粉中芸苔素内酯的分析方法的
报道 。
(2)试验芸苔素内酯的最低检出浓度为 0.1 mg/kg ,说明
该法灵敏度高 。
(3)试验用荧光检测器对槟榔花粉的芸苔素内酯含量作
了分析。
(4)由试验数据可知 ,该法重现性高 ,回收率好 ,样品测
定准确。
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