全 文 ：第 51卷 第 6 期
　2005 年 12 月
武汉大学学报(理学版)
J. Wuhan Univ.(Nat. Sci. Ed.)
Vol. 51 No. 6 　
Dec. 2005 , 776 ～ 780
　　收稿日期:2005-06-07　　　　†通讯联系人　E-mai l:w ang qf97@public. w h. hb. cn
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973)资助项目(G2000046805);国家自然科学基金资助项目(30370098)
作者简介:董贞荣(1974-),男 ,在职硕士 ,在三峡大学护理学院从事遗传学教学和研究工作.
文章编号:1671-8836(2005)06-0776-05
泽苔草居群内遗传多样性
董贞荣 , 陈进明 , 王青锋†
(武汉大学 生命科学学院 , 湖北 武汉 430072)
　　摘　要:采用 RAPD分子标记对泽苔草湖里居群 10 个家系共 60 个子代样品进行了家系间及家系内的遗传
多样性分析. 12个有效引物共产生 91条带 ,其中 83 条带表现出多态性 , 占91. 21%.各个家系的基因多样性在0. 11
～ 0. 23 之间(家系水平为 0. 27), Shannon指数在 0. 17 ～ 0. 34 之间(家系水平为 0. 41).分子变异分析(AMOVA)结
果显示家系间的基因分化系数(Gs t)为 0. 277 , 说明家系间的遗传变异占 27. 7%, 家系内的遗传变异占 72. 31%,家
系间和家系内的变异均极显著(p<0. 001).基于家系间的遗传分化系数(Gst)估测家系间的基因流(N m)为0. 65.采
用 UPGMA 法对所有子代聚类结果表明:同一家系的子代个体并不能完全聚在一起.
关　键　词:濒危植物;泽苔草;家系;分子变异分析;随机扩增多态性
中图分类号:Q 347　　　文献标识码:A
0　引　言
　　物种濒危的原因是多方面的 ,其遗传特性和遗
传多样性是原因之一. 一般所指的遗传多样性是指
种内的遗传多样性 ,即种内个体之间或一个群体内
不同个体遗传变异的总和[ 1] . 因为家系(family)是
种内遗传变异的重要组成部分 ,家系内的遗传变异
是居群内以及居群间遗传变异的重要来源 ,要想得
到较全面的遗传多样性信息 ,对居群内家系间(母本
个体)以及家系内(子代)等较小范围内遗传多样性
的研究也十分必要[ 2] .
泽苔草(Caldesia parnassi f ol ia)属于泽泻科
(Alismataceae)泽苔草属(Caldesia Parl. ),是多年
生挺水草本植物.目前泽苔草在中国仅存在一个自
然居群 ,位于湖南省茶陵县湖里沼泽 ,该物种已处于
濒危状态.但目前对泽苔草的研究仅集中在形态学 、
细胞学 、传粉生物学等方面[ 3 ～ 6] ,而有关泽苔草在
DNA 水平上的遗传变异的研究尚未见报道.
从20世纪 90年代开始 ,随机扩增多态性 DNA
(random ampli fied polymo rphic DNA , RA PD)技术
逐渐应用于居群生物学研究 ,特别是濒危植物方
面[ 7] . RAPD标记因比其他 DNA 标记(如限制性片
断长度多态性分析 RFLPs)简单 、利于进行大量位
点的分析等 ,是植物遗传多样性研究的一个有效而
简便的工具. 利用 RAPD技术来研究物种的遗传变
异 ,对深入探讨物种致濒机理 ,保护和延续物种多样
性具有重要的理论意义和实际价值. 本文采用
RA PD分子标记对泽苔草居群内的遗传多样性进
行分析 , 揭示泽苔草居群内家系间和家系内的遗传
多样性水平以及遗传变异在家系间及家系内的分布
状况 ,为更深入地阐明泽苔草的濒危机制提供遗传
学数据.
1　材料与方法
1. 1　研究材料
供试材料泽苔草取自湖南茶陵湖里居群. 从该
居群随机选取 10株植物 ,收集植株上成熟的瘦果 ,
每家系抽取 6个瘦果 ,用每一瘦果中的胚作为子代
样本.共取 60个子代样本. 野外考察及取样时间为
2004年 9月份 ,凭证标本存于武汉大学植物系统学
与进化生物学研究室.
1. 2　DNA提取和 PCR扩增
供试材料泽苔草胚 DNA 的提取步骤见文献
[ 8] .
PCR反应体系(25 μL)含有 15. 5 μL 双蒸水 ,
DOI牶牨牥牣牨牬牨牳牳牤j牣牨牰牱牨牠牳牳牫牰牣牪牥牥牭牣牥牰牣牥牪牱
第 6 期 董贞荣 等:泽苔草居群内遗传多样性
2. 5 μL(2. 5 mmol /L) dNT Ps , 2. 5 μL 10 ×PCR
buf fer (含 10 mmo l /L Tris-HCl , 1. 5 mmol /L
MgCl2和 50 mmol /L KCl ),0. 5μL (2 U /μL) Taq
Polymerase , 1 μL 引物 (25 pmol /L), 3 μL 模板
(2. 0×108 g /μL). PCR反应在 PTC-100TM扩增仪
上进行 ,反应参数为:94℃预变性 4 min;94 ℃变性
1 min ,34 ℃复性1 min ,72℃延伸 2 m in ,共 45个循
环;72℃延伸 10 min.
本实验共选用了 100个随机引物进行筛选 ,引
物购自上海Genbase 公司 ,为十聚体寡核苷酸随机
引物.依据扩增结果 ,对比可重复性 、多态性后 ,筛选
确定了扩增效果良好的 12个引物.所选用的有效引
物及序列见表 1.
1. 3　电泳谱带统计
PCR扩增产物在 1. 2%的琼脂糖凝胶上 90 V
稳压电泳 ,溴化乙锭处理后置于紫外光灯下检测 ,用
凝胶成像系统拍照 、存档待分析.统计条带时将电泳
图谱中的每条 DNA 谱带作为 1 个单位 ,如果有带
(包括弱带)则计为“1” ,没有带则计为“ 0”. RAPD
标记位点名称用引物名加扩增片段的分子量表示.
以 200 bp Marker作为标准分子量对照 ,见图 1.
1. 4　数据分析
采用 POPG EN E Version1. 31软件对全部家系
表 1　所用有效引物名称 、序列及扩增结果
引物名称 序列 (5′-3′) 扩增的条带数
P-B17 GAGGGCGAGC 9
P-C01 GCGGC TGGAG 5
P-C03 GTGACGCCGC 6
P-C19 ATTGGGCGAT 4
P-D02 CGCACCGCAC 16
P-D06 GCCTGGTTGC 5
P-E08 ACGGCCGACC 5
P-E11 GAAGCGCGAT 7
P-E12 GCTGCGTGAC 10
P-E20 GTCGATGTCG 5
P-G18 CGGAGAGCGA 7
P-G19 GTGGCCGCGC 12
以及单个家系分别计算了多态位点百分率(PPB)、
各个家系的基因多样性(H)、Shannon 指数(I)[ 9] 、
各家系间的 Nei’ s遗传距离[ 10] ,分析了家系间的亲
缘关系 , 并根据 Nei’ s 遗传距离采用 N TSYSpc
2. 02软件对所有子代样品进行了 UPGMA聚类. 根
据欧几里德遗传距离矩阵[ 11] 采用 WINAMOVA1.
55软件对家系间及家系内的分子变异进行分析 ,计
算了基因分化系数(Gst ), 该软件的输入文件由
AMOVA-PREP 软件制作.根据家系间基因分化系
数(Gst)计算了家系间的基因流(N m),计算公式为
Nm =(1 -Gst) /4Gs t .
图 1　引物 P-D02 对泽苔草 4 个家系材料的 RAPD扩增结果电泳图
M:200 bp DNA Ladder(Tian Yuan Biotech. Co. , Ltd.)
1～ 6:家系 HL-1;7～ 12:家系 HL-2;13～ 18:家系 HL-3;19～ 24:家系 HL-4
2　结果与分析
12个引物共扩增出 91条带 ,其中 83条表现出
多态性 ,占总带数的 91. 21%,平均每个引物扩增的
DNA 带数为 7. 14条(表 1),各个家系多态位点百
分率(PPB)在 31. 9%～ 52. 8%之间(表 2). 各个家
系基因多样性(H)范围在 0. 11 ～ 0. 23之间(家系水
平的基因多样性为 0. 27),Shannon 指数(I)的范围
在 0. 17 ～ 0. 34之间(家系水平的 Shannon 指数为
0. 41),基因多样性与 Shannon 指数的结果基本相
符(表 2).
　　分子变异(analysis of molecular variance ,
AMOVA)对所有家系的分析结果表明家系间的基
因分化系数 Gs t =0. 277 ,即总的变异中有 27. 7%的
变异存在于家系间 ,家系内的遗传变异占总遗传变
异的 72. 3%,家系间和家系内变异均极显著(p <
0. 001)(表 3). 基于家系间的遗传分化系数(Gst)计
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武汉大学学报(理学版) 第 51卷
算家系间的基因流 Nm =0. 65.
基于 Nei’ s遗传距离对各个家系的遗传距离分
析结果表明:各个家系之间遗传距离介于 0. 04 ～
0. 21之间(数据未列出). 采用 UPGMA 法对 60 个
子代进行聚类结果表明:同一家系的子代个体并不
能完全聚在一起(图 2).
表 2　泽苔草 10个家系遗传多样性的 RAPD 分析结果
家系号 多态性条带 多态性位点比率 /% 基因多样性 Shannon 指数
H L-1 47 51. 65 0. 19(0. 20) 0. 29(0. 29)
H L-2 37 40. 66 0. 15(0. 19) 0. 23(0. 28)
H L-3 29 31. 87 0. 11(0. 18) 0. 17(0. 26)
H L-4 31 34. 07 0. 13(0. 19) 0. 19(0. 28)
H L-5 48 52. 75 0. 20(0. 20) 0. 29(0. 29)
H L-6 43 47. 25 0. 17(0. 20) 0. 26(0. 28)
H L-7 44 48. 35 0. 17(0. 19) 0. 26(0. 28)
H L-8 41 45. 05 0. 18(0. 20) 0. 26(0. 30)
H L-9 40 43. 96 0. 17(0. 20) 0. 25(0. 29)
HL-10 53 58. 24 0. 23(0. 21) 0. 34(0. 30)
所有家系 83 91. 21 0. 27(0. 18) 0. 41(0. 24)
　　　　　　　　　HL-1～ HL-10表示湖里居群家系 1～ 10;括号内为标准误差
表 3　泽苔草 10 个家系的分子变异分析结果
变异来源 自由度 总方差 变异组分 比率 /% p
家系间 9 276. 17 3. 56 27. 7 <0. 001
家系内 50 465. 33 9. 31 72. 3 <0. 001
图 2　泽苔草 60个子代个体的 UPGMA 聚类图
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第 6 期 董贞荣 等:泽苔草居群内遗传多样性
3　讨　论
先前的研究普遍认为水生植物的遗传多样性比
陆生植物低[ 12 , 13] ,但也有些研究表明在水生植物种
群内同样存在很高的遗传多样性[ 14 , 15] .本研究发现
泽苔草湖里居群在家系水平具有较高的遗传多样
性 ,多态位点百分率(PPB)为 91. 2%,远远高于采
用 RAPD分子标记对其他水生植物遗传多样性的
部分研究结果. 例如高于高寒水韭(I. hypsophi la)
(PPB =50%)[ 16] , 也高于同属中的宽叶泽苔草
(Caldesia grandis)(PPB=70. 5%)[ 8] 等.本文通过
分子变异分析(AMOVA)进一步研究了泽苔草居群
内遗传多样性的分布 ,表明 27. 7%的遗传变异存在
于家系间 ,而绝大部分的遗传变异存在于家系内
(72. 3%).本研究所得到的泽苔草的居群内的遗传
变异模式与那些多年生且具有异交繁育系统的植物
具有相似的遗传变异模式[ 17] .
泽苔草为虫媒传粉植物[ 6] ,花粉的扩散是家系
间(母本植株间)基因流动的惟一形式. 本文根据家
系间遗传分化系数计算出的基因流 (Nm )为
0. 652 8 ,高于水生植物的平均值 0. 552[ 18] . 从对 10
个家系和 60 个子代样品的 UPGMA 聚类图也可以
看出 ,同一家系的子代不能完全聚在一起(图 2),表
明不同家系和不同子代个体间存在一定的基因交
流.种群间的遗传分化与环境因子的选择和基因流
的阻隔有关.种群内部的基因流会影响居群的遗传
结构[ 19] , 同时生态小环境的变异也可能导致不同
种群间在遗传结构上的差异[ 20] . 本文对 10个泽苔
草母本植物进行了 UPGMA 聚类 , 结果显示 10 个
母本植物聚成许多组(图 2). 空间距离与遗传相似
性没有明显的对应关系 , 因此可以说明在所研究的
居群中通过花粉实现的基因流足以能阻止地方性的
分化 , 这同时可以说明微生态环境因子如水位 、水
流以及伴生种的竞争等对泽苔草居群内个体间的遗
传分化可能有一定的影响. 当然 , 至于何种生态因
子影响泽苔草居群内个体间的遗传分化尚需要进一
步的研究.
虽然泽苔草的繁育系统同时具有有性繁殖(自
交或异交均能产生种子)和无性繁殖(花序上的株芽
脱落形成新的植株).但本研究所得到的泽苔草的遗
传多样性 、遗传分化系数 、基因流 、聚类分析结果均
与异交植物类似 ,表明异交可能在泽苔草居群中占
主要地位 ,这与作者对泽苔草异交率的定量估测结
果相一致(异交率 tm =1. 008 ,未发表数据).较高的
异交水平可能使得泽苔草家系中具有较高的遗传多
样性.
对濒危植物居群内家系间和家系内的遗传多样
性进行分析 ,一方面不仅能揭示出该居群潜在的遗
传多样性(因为子代个体的遗传变异是居群内以及
居群间遗传变异的持续来源),另一方面还能对该物
种的交配系统进行粗略地估计. 对那些目前交配系
统模式仍不清楚的物种 ,通过对其居群内遗传多样
性的研究 ,将有助于对该种的繁育系统进一步的了
解.
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Genetic Diversity in a Natural Caldesia parnassi f olia Population
DONG Zhen-rong , CHEN Jin-ming , WANG Qing-feng
(Co llege o f Life Sciences , Wuhan University , Wuhan 430072 , H ubei , China)
　　Abstract:Genetic diversity in a natural Caldesia parnassi folia population in Hunan Province w as as-
sessed using RAPD markers. A to tal of 60 individuals f rom 10 maternal plants w ere analyzed. Using
tw elve primers , which produced highly reproducible bands , a total of 91 DNA fragments w ere generated
wi th 83 (91. 21%) being polymorphic. Analy sis o f molecular variance (AMOVA) showed that a larg e pro-
po rtion of gene tic variation (72. 31%) resided w ithin maternal plants , while only a small proport ion
(27. 69%) resided among ma ternal plants. Shannon index show ed that the to tal g enetic dive rsity among
mate rnal plants w as 0. 4147 , which w as ident ical w ith the result of Nei’ s gene diversity. NTSYS analy sis
indicated tha t the of fspring individuals f rom a maternal plant could no t be clustered completely together.
The estimate of gene f low (Nm) among mate rnal plants w as 0. 6528.
Key words:endangered plant;Caldesia parnassi folia;family;analy sis o f molecular variance (AMO-
VA);random amplified polymorphic DNA (RAPD)
780