全 文 ：［收稿日期］ 20120519(002)
［基金项目］ 全军科技攻关计划基金项目(06G034)
［第一作者］ 王园园，Tel:15053532453，E-mail:wangyuan0922@ 126． com
［通讯作者］ * 王义善，教授，Tel:0535-2933947，E-mail:wangyishan288@ 163． com
狼毒提取液对小鼠恶性黑色素瘤
B16 细胞体内转移能力的影响
王园园1，王义善1，2* ，杨桂青1，杨柯1，2
( 1. 滨州医学院中西医结合学院，山东 烟台 264003;
2. 解放军第 107 医院国家中西医结合肿瘤治疗重点专科，山东 烟台 264002)
［摘要］ 目的:探讨狼毒提取液对小鼠恶性黑色素瘤 B16 细胞转移能力的影响。方法:分别以荷 B16 小鼠模型和小鼠恶
性黑色素瘤 B16 细胞实验转移为模型，C57BL /6 小鼠随机分为空白对照组、狼毒 15. 0，20. 0 g·kg －1组及环磷酰胺组，检测 ip
狼毒提取液(EFE)对小鼠 B16 细胞移植瘤生长和肺转移的影响。免疫组化法分析狼毒提取液对荷 B16 小鼠移植瘤中抑癌转
移因子人第 10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)及促转移因子蛋白激酶 B(p-Akt)表达水平的影响。结
果:狼毒提取液明显抑制 B16 细胞的生长，并能显著抑制其肺转移。ip狼毒提取液 15. 0，20. 0 g·kg －1给药 14 d，对 B16 生长的
抑制率分别为 52. 9%，63. 6% (环磷酰胺的抑制率为 59. 5%) ;对 B16 细胞肺转移的抑制率分别为 37. 4%，63. 5% (环磷酰胺
的抑制率为 56. 8%)。免疫组织化学法检测结果显示，狼毒提取液组胞质中 p-Akt褐黄色颗粒较空白对照组少见，而 PTEN胞
浆着黄色则较空白对照组多见。结论:狼毒提取液的抗癌转移效果可能部分与其下调促转移因子 p-Akt，上调抑癌转移因子
PTEN的表达有关。
［关键词］ 狼毒提取液;恶性黑色素瘤;B16 细胞;肿瘤转移
［中图分类号］ R285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)01-0195-04
［网络出版地址］ http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /11． 3495． R． 20121029． 1621． 002． html
［网络出版时间］ 2012-10-29 16:21
Effect of Euphorbia fischeriana Extract on Metastatic Ability
of Melanoma B16 Cells in vivo
WANG Yuan-yuan1，WANG Yi-shan1，2* ，YANG Gui-qing1，YANG Ke1，2
(1. School of Interation of Traditional and Western Medicine，Binzhou Medical University，Yantai 264003，China;
2. Center for Tumor Treatment of Peoples Liberation Army 107 thHospital，Yantai 264002，China)
［Abstract］ Objective:To evaluate the effect of Euphorbia fischeriana extract (EFE)on metastatic ability
of melanoma B16 cells in vivo． Method:The B16 mouse transplanted tumor model and B16 spontaneous motility
melanoma metastatic model were established，and C57BL /6 mice were randomly divided intocontrol group，group
EFE 15. 0，20. 0 g·kg －1 and cyclophosphamide (CTX)group to detect the inhibition effect of EFE for growth of
transplanted tumors and metastatic incidence on lung． The expression of phosphatase and tensin homolog deleted on
chromosome ten (PTEN) and protein kinase B (p-Akt) of transplanted tumors were observed by
immunohistochemical method． Result:EFE could inhibit the growth of B16 cells and the lung metastasis
significantly in vivo． The growth inhibition rate of EFE when injected intrapetitoneally to mice at concentration of
15. 0，20. 0 g·kg －1 were 52. 9% and 63. 6% respectively (cyclophosphamide was 59. 5%) ;inhibition rate of lung
metastasis were 37. 4% and 63. 5% (inhibiton rate of cyclophosphamide was 56. 8%)． Immunohistochemical
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第 19 卷第 1 期
2013 年 1 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 1
Jan．，2013
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2013.01.063
results indicated that compared with control group，expression of p-Akt in EFE group was less apparent while PTEN
expression was more visible than control group． Conclusion:EFE could inhibit the metastasis of B16 cells in vivo，
probably through down-regulating of p-Akt and up-regulating of PTEN expression，and further study are warranted．
［Key words］ Euphorbia fischeriana extrat;melanoma;B16 cells;metastasis
肿瘤侵袭和转移是恶性肿瘤的基本生物学特
征。恶性黑色素瘤预后不良性主要与其较高的远处
转移发生率及侵袭、转移能力较强有关［1］。在复杂
的肿瘤侵袭和转移过程中，涉及多种癌转移相关基
因，包括癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因和肿瘤转
移抑制基因等。
此前我们已经报告狼毒大戟水提液对多种肿瘤
细胞株较强的增殖抑制及凋亡诱导作用，此外，狼毒
提取液还可通过调控肿瘤转移相关因子的表达而抑
制肿瘤细胞的转移［2］。前期体外实验证实，狼毒提
取液可通过下调小鼠恶性黑色素瘤 B16 细胞 p-Akt
(蛋白激酶 B)表达抑制 PI3K /Akt(磷脂酰肌醇 3 激
酶 /蛋白激酶 B)信号转导通路的活化，进而下调
MMP-2(基质金属蛋白酶-2)、P70S6K1(70kDa 核糖
体蛋白 S6 激酶)的表达，降低细胞运动能力，抑制
黑色素瘤转移，有望开发狼毒提取液用于恶性黑色
素瘤临床治疗中，但仍需在体内对肿瘤转移行为的
深入研究。本文报告了 EFE 对小鼠恶性黑色素瘤
B16 细胞体内转移行为的研究结果。
1 材料
1. 1 药物与试剂 狼毒 Euphorbia fischeriana Stedu
购自鲁南制药有限公司，由烟台市中药研究所鉴定
为狼毒大戟的干燥根茎。狼毒提取液由解放军第
107 医院肿瘤实验中心配置，取得济南军区制剂允
许(济联制字 2000BM08046，质量浓度相当于生药 2
g·mL －1)。DMEM 培养基、胰蛋白酶及已灭活的胎
牛血清均购自美国 Hyclone 公司;PTEN 及 Akt 抗
体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠、辣根过氧化物
酶标记山羊抗兔试剂盒均购自 Sigma公司。
1. 2 细胞与动物 小鼠 B16-F10 细胞用含 10%胎
牛血清、100 U·mL －1青霉素和 100 mg·L －1链霉素的
DMEM培养基，于温度为 37 ℃、5%CO2 的饱和湿度
恒温培养箱中常规培养，取对数生长期的细胞用于
实验。C57BL /6 小鼠，7 ～ 8 周龄，体重(21 ± 2)g，雌
雄各半，购自北京协和医科大学实验动物中心，实验
动物许可证号 SCXK(京)2005-2006。
1. 3 仪器 BCN-1360B 型医用超净工作台(东联
哈尔仪器制造公司) ，3111 型二氧化碳培养箱
(Thermo 公司) ，5810R 型台式高速冷冻离心机
(Eppendorf公司) ，CKX31 型倒置显微镜(Olympus
公司) ，TE200-U型倒置荧光显微镜(Nikon公司)。
2 方法
2. 1 B16 荷瘤小鼠模型肿瘤生长抑制率的检测
每只小鼠背部皮下接种 0. 2 mL(4 × 106 个细胞)
B16 细胞悬液。瘤细胞接种后第 7 天，挑选已成瘤
小鼠，随机分组，每组 8 只，雌雄各半。狼毒提取液
组每天 ip 狼毒提取液(相当于生药 15. 0，20. 0 g·
kg －1)溶液，共注射 14 d，对照组同时 ip 等量生理盐
水，阳性对照组接种当天及第 7 天腹腔注射 0. 2 mL
环磷酰胺(50 mg·kg －1)。末次用药后次日颈椎脱
位法处死小鼠，剥离原发肿瘤称重并用 10%中性甲
醛固定后用于免疫组化实验。
肿瘤生长抑制率 =(对照组平均瘤重 －给药组平均瘤
重)/对照组平均瘤重 × 100%
2. 2 B16 细胞实验转移模型肿瘤转移抑制率的检
测 每只小鼠尾静脉接种 0. 2 mL(4 × 106 个细胞)
B16 细胞悬液，肿瘤接种当天开始，狼毒提取液组每
天 ip狼毒提取液溶液(相当于生药 15. 0，20. 0 g·
kg －1)14 d，对照组 ip 等量生理盐水;阳性对照组接
种当天、第 7 天 ip 0. 2 mL环磷酰胺(50 mg·kg －1)。
末次用药翌日股动脉放血法处死小鼠，剥离肺组织
并计数肺表面转移结节总数和大转移结节数
(＞ 3 mm) ，计算肿瘤转移抑制率。
肿瘤转移抑制率 =(对照组平均转移结节数 －给药组
平均转移结节数)/对照组平均转移
结节数 × 100%
2. 3 免疫组织化学法检测肿瘤组织 PTEN 及 p-Akt
的表达 免疫组织化学法(SP 法)检测荷 B16 小鼠
移植瘤中肿瘤转移基因 PTEN 及 p-Akt 的表达。
PTEN的阳性信号位于胞质，p-Akt 的阳性信号主要
位于胞质，胞核中也可见少量表达，均以细胞中出现
棕黄色颗粒为阳性细胞。
2. 4 统计学分析 完全随机化设计实验所得结果
数据用 珋x ± s 表示，资料均数采用 t 检验分析。所有
数据均用 SPSS 13. 0 统计学软件进行统计处理，实
验重复 3 次以上，P ＜ 0. 05 为有统计学意义。
3 结果
3. 1 狼毒提取液抑制小鼠 B16 移植瘤的生长 狼
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中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 1
Jan．，2013
毒提取液组的原发肿瘤明显较对照组体积小，基底
窄，易剥离。每天腹腔注射 EFE(15. 0，20. 0 g·
kg －1)共 14 d，对 B16 的生长抑制率分别为 52. 9%
和 63. 6%，环磷酰胺的抑制率为 59. 5%(表 1)。
表 1 腹腔注射狼毒提取液 14 d
对荷 B16 小鼠肿瘤的生长抑制情况
组别
剂量
/ g·kg －1
动物数
(始 /末)
平均瘤重
/ g
平均抑瘤率
/%
空白对照 － 8 /8 1. 21 ± 0. 36 －
狼毒提取液 15. 0 8 /8 0. 57 ± 0. 201) 52. 9
20. 0 8 /8 0. 44 ± 0. 212) 63. 6
环磷酰胺3) 0. 05 8 /8 0. 49 ± 0. 132) 59. 5
注:与模型组比较1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01;3)于接种当天及第 7
天 ip给药(表 2 同)。
3. 2 狼毒提取液抑制小鼠 B16 细胞的肺转移 解
剖尾静脉注入 B16 细胞的小鼠并取出肺脏，肉眼即
可见对照组小鼠肺表面有较多黑色点状的转移结
节，而狼毒提取液 20. 0 g·kg －1组的转移结节则很稀
少(图 1)。计数结果表明，15. 0，20. 0 g·kg －1狼毒提
取液对 B16 细胞肺转移的抑制率分别为 37. 4%和
63. 5%，环磷酰胺为 56. 8%(表 2)。腹腔注射狼毒
提取液显著抑制 B16 细胞肺转移，且其抑制肿瘤转
移作用优于环磷酰胺。
3. 3 免疫组织化学法检测肿瘤组织 PTEN 及 p-Akt
的表达 免疫组织化学结果显示，p-Akt对照组 B16
细胞质中出现大量褐黄色颗粒，而在狼毒提取液组
细胞中类似颗粒则少见;PTEN 免疫组化结果显示
狼毒提取液组 B16 细胞胞浆着黄色(对照组细胞浆
少见着色)。见图 2。
A. 空白对照组;B. 狼毒提取液 15. 0 g·kg －1组;C. 狼毒提取液 20. 0 g·kg －1组;D. 环磷酰胺 50 mg·kg －1组
图 1 狼毒提取液对实验性 B16 细胞肺转移的影响
表 2 狼毒提取液 ip 14 d对小鼠肿瘤肺转移的抑制情况(珋x ± s)
组别
剂量
/ g·kg －1
转移率
/只
转移结节数
/个
转移抑制
率 /%
空白对照 － 8 /8 42. 9 ± 7. 2 －
狼毒提到液 15. 0 7 /8 26. 9 ± 9. 11) 37. 4
20. 0 6 /8 15. 7 ± 5. 32) 63. 5
环磷酰胺3) 0. 05 7 /8 18. 5 ± 7. 62) 56. 8
4 讨论
恶性黑色素瘤，来源于神经嵴的黑色素细胞，是
致死性最大的皮肤肿瘤［3］。恶性黑色素瘤预后不
良主要与其较高的远处转移发生率及侵袭、转移能
力较强有关，临床发现时多已转移，放化疗效果差。
现有临床药物治疗中，虽然顺铂和氮烯咪胺对黑色
素瘤有效，但其有效率不足 20%［4］。
狼毒是一种有极大开发潜能的天然抗癌药物，
在我国被用于治疗肿瘤已有较久历史［5-7］。研究证
实［8］，狼毒大戟对肿瘤细胞的抑制活性很强，抗瘤
谱广、副作用小。杨宝印研究发现，狼毒大戟提取液
对肝癌、肉瘤的抑瘤率高于农吉利、长春新碱和去甲
斑蝥素。而毒性方面，刘萍等［9］证实，即使剂量增
至 360 g·kg －1，其毒性仍远低于治疗剂量下的环磷
酰胺。本研究所用狼毒提取液为解放军第 107 医院
国家中西医结合肿瘤治疗重点专科研制的狼毒提取
液，所含化学成分主要有岩大戟内酯 A、B，黄酮类，
狼毒大戟甲、乙素等。以该中心研制的狼毒大戟提
取液为研究对象，前期基础研究结果证实［10-13］，狼
毒提取液对体外多种肿瘤细胞株具有较强的抑制增
殖及诱导凋亡的作用，对机体免疫功能也有明显的
促进作用。
最近研究表明，在 30% ～ 50%的黑色素瘤细胞
系和 5% ～20%的黑色素瘤细胞中有 PTEN 基因的
改变［14］。PTEN 的低表达导致其不能有效抑制
·791·
王园园，等:狼毒提取液对小鼠恶性黑色素瘤 B16 细胞体内转移能力的影响
A．空白对照组;B．狼毒提取液 15. 0 g·kg －1组;
C．狼毒提取液 20. 0 g·kg －1组;D．环磷酰胺 50 mg·kg －1组
图 2 狼毒提取液对小鼠 B16 移植瘤 p-Akt及
PTEN的表达影响(免疫组织化学法)
PI3K /Akt通路的异常活化，从而导致肿瘤转移。激
活的 PI3K /Akt通路可能通过以下途径促进肿瘤细
胞的转移:①异常活化 p70S6K1的表达，促进肌动蛋
白的细丝重构，促进细胞运动［15］;②促进下游分子
mTOR的激活，进而上调基质金属蛋白酶-2(MMP-2)
mRNA和蛋白质表达［16］，降解细胞外基质，促进肿
瘤细胞的转移;③促进上皮细胞-间充质细胞转换
(EMT) ，进而下调 E-钙黏蛋白及 β-连环蛋白和上调
间充质细胞波形蛋白，降低细胞间黏附力，使肿瘤细
胞运动能力增强，赋予肿瘤细胞很强的侵袭、转移
能力。
本研究以狼毒提取液为研究对象，以荷 B16 小
鼠模型和小鼠恶性黑色素瘤 B16 细胞实验转移为
模型，检测了狼毒提取液对小鼠 B16 细胞移植瘤生
长和肺转移的影响。实验结果证实，狼毒提取液可
能通过下调促转移因子 p-Akt，上调抑癌转移因子
PTEN的表达而抑制小鼠 B16 细胞移植瘤的生长及
实验性转移，值得深入研究。
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［责任编辑 聂淑琴］
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