全 文 ：实用医药杂志 2013 年 09 月 第 30 卷 第 09 期 Prac J Med ＆ Pharm． Vol 30, 2013－09 No．09
[基金项目] 全军科技攻关项目（06G034）
[作者单位] 264002 山东烟台，107 医院肿瘤治疗中心（姜红）
狼毒大戟，为大戟科植物狼毒大戟和月腺大戟
的根，早在《神农本草经》记载其具有散结、逐水、镇
痛、杀虫的作用。 长期的临床研究亦发现狼毒具有
广谱抗肿瘤的作用[1-3]，它对体外多种肿瘤的增殖具
有较强抑制作用。 但目前关于狼毒在肺癌抗肿瘤分
子机制方面研究鲜见。 本实验旨在探讨狼毒大戟水
提液对 Lewis 小鼠移植瘤细胞增殖及转移的作用，
以期为指导临床治疗非小细胞肺癌提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料 中药狼毒水提液由解放军第 107 医院
肿瘤实验中心配制，取得济南军区制剂允许（济联
制字 2000BM08046），1 ml 狼毒大戟提取液相当于
生药 2 mg；非小细胞肺癌 Lewis 细胞购自中科院上
海细胞库；C57BL/6J 小鼠，雄性，体重 19～22 g，购自
北京大学；免疫组化试剂盒（SABC 法）、Annexin-V
FITC/PI双染试剂盒购自 BD公司。
1.2 实验方法 用含 10%胎牛血清的 DMEM 高糖
培养基，于温度为 37 ℃、5%CO2的饱和湿度恒温培
养箱中常规培养，2～3 d 传代， 取对数生长期的细
胞， 调整细胞浓度至 1×106/ml 接种于 12 只小鼠右
侧腋下，常规培养小鼠 2 周，观察瘤体生长至 1 cm×
1 cm×1cm 时， 将小鼠随机分为阴性对照组和狼毒
组。 狼毒组按照 12.5 mg/kg的剂量腹腔注射狼毒大
戟注射液、 对照组腹腔注射等量生理盐水，1 次/d，
连续治疗 7 次后，处死小鼠，取出瘤体，称重并记录
结果。 离心收集狼毒组和对照组培养 24 h 的 lewis
细胞，2000 RPM 离心 5 min，弃培养基，用冷 PBS 洗
涤细胞 2 次，2000 RPM/次， 离心 5 min。 用 400 μl
1×Annexin V 结合液悬浮细胞，细胞浓度大约为 1×
106/ml。 在细胞悬浮液中加入 5 μl Annexin V-
基础医学
·论 著·
狼毒大戟对小鼠 Lewis肺癌增殖及转移的影响 *
姜 红
[摘 要] 目的 观察中药狼毒大戟提取液对 Lewis 小鼠移植瘤细胞增殖及转移的影响。 方法 收集对数生长
期细胞接种至 C57BL/6 小鼠右侧腋窝下并随机分组，狼毒组腹腔给上述提取液，对照组给予等量生理盐水连续 7 d，
处死小鼠计算抑瘤率，荧光显微镜下观察 Lewis 细胞凋亡变化，免疫组化检测小鼠 PCNA、TSP-1 的表达。 结果 对
照组平均瘤重为（0.3311±0.0184） g，狼毒组平均瘤重为（0.2209±0.06093） g；荧光显微镜下，狼毒组凋亡的 Lewis 细胞
明显多于对照组；对照组与狼毒组 PCNA 平均光密度分别为 1696.47±79.70、1364.47±108.52；TSP-1 平均光密度值分
别为 307.94±65.66、428.90±57.92。 结论 狼毒大戟在诱导细胞凋亡的同时可以抑制肿瘤细胞的增殖与转移，可能是
一种很有前景的药物。
[关键词] 狼毒大戟；Lewis 肺癌；增殖；转移；狼毒提取液（LDE）
[中图分类号] R734.2:R-332 [文献标识码] A
Influence of Enphorbia Fischeriana Stend on proliferation and metastasis of Lewis carcinoma in mice:
Preliminary study JIANG Hong. The Center of Non -traumatic Treatment and Diagnosis of Tumor, Yantai,
Shandong 264002, China
[Abstract] Objective To explore the effect of Euphorbia Fischeriana Steud on proliferation and metastasis in
Lewis carcinoma of mice. Methods Twelve mices were transplanted subcutaneously to the right limb of 1×106
Lewis cells per mice． After transplanted，the mice were separaed into 2 groups：control and LDE group. The LDE
group were given with LDE intraperitoneal injection; control group with same-volume of normal saline; the two
groups of mice were killed after 7 days, then, tumor were taken off, and weighed firstly for mesureing inhibition
rate; the change of Lewis cells of different groups were observed under fluorescence microscope with Annexin-V
FITC/PI staining; Immunohitochemistry methods were used to analyse expression of PCNA and TSP-1. Results
The mean weight of the subcutaneous tumors of two groups was 0.3311±0.0184 g, 0.2209±0.06093 g, respectively;
the number of apoptosis cells in LDE group was more than that in control group under the fluorescence
microscope; In control group, mean density of PCNA was 1696.47±79.70, LDE group was 1364.47±108.52; the
mean density of TSP-1 in two group was 307.94±65.66, 428.90±57.92, respectively. Conclusion LDE plays an
important role in inhibiting proliferation and metastasis of Lewis carcinoma that may be a drug having great
develop ment foreground.
[Key words] Euphorbia Fischeriana Steud; Lewis carcinoma; Proliferation; Metastasis; Lang-du extract(LDE)
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DOI:10.14172/j.cnki.issn1671-4008.2013.09.056
实用医药杂志 2013 年 09 月 第 30 卷 第 09 期 Prac J Med ＆ Pharm． Vol 30, 2013－09 No．09
FITC染色液，轻轻混匀后于 2～8 ℃避光条件下孵育
15 min。加入 10 μlPI染色液后轻轻混匀于 2～8℃避
光条件下孵育 5 min， 荧光显微镜下观察各组细胞
凋亡变化。 取等量小鼠瘤体然后放入 4%的多聚甲
醛固定液中固定后，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸
蜡、包埋、做 4 μm 切片，采用特异性肌动蛋白 TSP-
1 单克隆抗体 （武汉博士德生物技术公司）， 应用
SABC 法对腮腺标本进行免疫组织化学染色， 抗体
浓度为 1∶250，AEC显色，苏木素轻度复染。
1.3 统计学处理 将所染免疫组 化 切 片 在
OLYMPUS BX51（FN 22）高倍镜（×400）下观察，每
张切片随机选择 5 个视野拍照，Image-Pro Plus6.0
图像分析软件进行分析，测量平均光密度。 实验数
据采用 SPSS 16.0 统计软件进行分析，所有数据均
以均数±标准差（x±s）表示，各实验组均数比较采用
单因素方差分析（One-Way ANOVA），P<0.05 具有
显著性差异。
2 结 果
2.1 狼毒大戟提取液对 Lewis 肺癌小鼠的抑瘤作
用 如表 1 所示，阴性对照组平均瘤重为（0.3311±
0.0184） g， 平均抑瘤率为 0； 狼毒组平均瘤重为
（0.2209±0.06093） g，平均抑瘤率为 33.38%。 两组具
有显著性差异（F=82.575，P＜0.05）。
2.2 荧光显微镜下肿瘤细胞凋亡变化 如图 1 所
示，狼毒组 PI、Annexin-V/FITC染色细胞明显增多。
2.3 免疫组化染色结果 阴性对照组与狼毒组
PCNA 平均光密度分别为 1696.47±79.70、1364.47±
108.52；TSP-1 平均光密度值分别为 307.94±65.66、
428.90±57.92。 两组比较均有显著性差异（P＜0.05）。
见图 2。
3 讨 论
原发性肺癌是最常见的恶性肿瘤之一 [4]，其中
在欧美国家非小细胞肺癌占肺癌发病率的 70%～
80%，在我国则高达 80%～90%，并且呈明显上升的
趋势。 放化疗是非小细胞肺癌的有效治疗手段，但
其不良反应不容忽视，往往伴随着患者免疫功能低
下从而加快肿瘤转移，使病情难以控制。 随着中国
传统医学与现代医学的发展，中西医结合治疗肿瘤
已经逐渐被人们接受并广泛应用于临床，医学界也
提出了以补充替代医疗目的的治疗研究 [5]。 狼毒大
戟，为大戟科植物狼毒大戟的根，具有散结、逐水、
镇痛、杀虫的作用。 本课题实验组王莉平等[6]研究发
现，0.05 mg/ml 浓度的狼毒大戟提取液（1 ml 的狼毒
大戟提取液相当于 2 mg 的生药） 就能够通过上调
bax，及抑制 bcl-2而明显促进 B16 黑素小鼠移植瘤
的增殖与凋亡且随着浓度的增大作用增强。
肿瘤的发生和发展是一个多因素影响的复杂
过程 [7]，细胞凋亡是机体维持稳定的重要保护机制
之一，当细胞凋亡机能降低时，肿瘤发生率就会增
加。 本文实验证实，狼毒组细胞凋亡率明显高于阴
性对照组。 PCNA在细胞增殖的初始阶段发挥关键
性作用，是细胞合成必不可少的因子，PCNA 的表达
能够反映细胞增殖活跃程度，它通过使肿瘤细胞异
常增殖而导致肿瘤不断长大。 本文结果显示狼毒大
戟可以明显促进 Lewis 细胞凋亡， 并且抑制 PCNA
的表达进而抑制肿瘤细胞的增殖[8，9]。 凝血酶敏感蛋
白（TSP-1）可参与调节血小板粘附和聚集、血栓形
成、平滑肌增殖和迁移、内皮细胞凋亡等生物学过
程。 它作为一种内源性血管生成抑制因子，在体外
表现为诱导内皮细胞凋亡，在体内表现为抑制血管
新生 [10]，最近研究发现 TSP-1 作为候选抑癌基因，
可以抑制肿瘤血管生成 [11]，在抑制肿瘤的发展过程
中发挥重要作用。 本文实验结果亦证明狼毒大戟可
以明显促进小鼠 TSP-1的表达。
因此，笔者推测，狼毒在诱导细胞凋亡的同时
可以抑制肿瘤细胞的增殖与转移并提供机体抵抗
力，是一种很有前景的抗癌药物，值得进一步研究。
【参考文献】
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鼠体内转移及彗星电泳实验研究[J]. 中医杂志，2006，47(2):148-
图 1 荧光显微镜下肿瘤细胞凋亡变化
狼毒大戟提取液对 lewis 肺癌小鼠的抑瘤作用（×400）
A 阴性对照组 B 狼毒组
图 2 PCNA与 TSP-1 表达变化（×400）
A 阴性对照组 PCNA表达 B 狼毒组 PCNA表达
C 阴性对照组 TSP-1 表达 D 狼毒组 TSP-1 表达
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实用医药杂志 2013 年 09 月 第 30 卷 第 09 期 Prac J Med ＆ Pharm． Vol 30, 2013－09 No．09
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[2013-02-29 收稿，2013-03-20 修回] [本文编辑：韩仲琪]
单克隆抗体 （monoclonal antibody）自 1975 年
发明以来，在疾病的预防和诊治方面得到的广泛的
引用，尤其在肿瘤治疗方面被寄予厚望。 因表皮生
长因子受体（EGFR）在上皮细胞中表达，抗体易发
挥作用，这就使以 EGFR 作为抗体作用的靶点成为
癌症靶向治疗的一个思路。 EGFR 过度表达或高表
达已被证明与某些肿瘤的增殖存在密切关系，其高
表达患者预后差，易发生早期转移，复发时间短，复
[作者单位] 225000 江苏扬州，扬州职业大学（江秀玲）；武警江苏总
队医院泌尿外科（胡有根）；200000 上海市肿瘤研究所，癌基因及相
关基因国家重点实验室（石必枝）
基础医学
·论 著·
抗人 EGFRvⅢ ex单克隆抗体的制备及初步鉴定
江秀玲，胡有根，石必枝
[摘 要] 目的 研制抗人表皮生长因子受体突变体Ⅲ胞外区（EGFRvⅢex）单克隆抗体（mAb），并鉴定其特
性。 方法 采用原核表达的 EGFRvⅢex 蛋白免疫 BALB/c 小鼠，以间接 ELISA 法筛选分泌特异性 mAb 的杂交瘤细
胞，采用蛋白印迹、间接免疫荧光和免疫组化染色鉴定 mAb 的特异性。 结果 获得 1 株可稳定分泌 mAb 的杂交瘤
细胞株。mAb 的 Ig 亚类为 IgM，效价为 10-6。mAb 可识别 U87 细胞膜上稳定转染的人 EGFRvⅢex 和 SPC-A1 细胞膜
上高表达的 EGFR。 结论 成功制备 1 株抗 EGFRvⅢex 的 mAb，经蛋白印迹、免疫荧光和免疫组化染色检测，mAb
的特异性良好，能够检测细胞上的 EGFR 和 EGFRvⅢex，为肿瘤的治疗提供了良好的手段。
[关键词] EGFRvⅢex；单克隆抗体；鉴定
[中图分类号] Q71 [文献标识码] A
Preparation and characterization of monoclonal antibody against human EGFRvⅢex JIANG Xiu-ling①,
HU You-gen, SHI Bi-zhi. ①Yangzhou Polytechnic College, Yangzhou Jiangsu 225000, China
[Abstract] Objective To study the preparation and characterization of monoclonal antibody against human.
Methods BALB/c mice were immunized with prokaryotically expressed human EGFRvⅢex protein. The mAb-
positive hybridoma cells were screened by indirect ELISA. Specificity of mAb was characterized by Western blot,
immunofluorescent staining and immunohischemical staining. Results One hybridoma cells secreting mAb was
established. The isotype of mAb was IgM. The titer was 10-6. The mAb recognized human EGFRvⅢex protein on
EGFRvⅢex-transfected U87 cells and EGFR protein on SPC-A1 cells. Conclusion One anti-EGFRvⅢex mAb
has obtained. The characterization of the mAb indicated the fine specificity of mAb by Western blot,
immunofluorescent staining and immunohischemical staining, which can provided a powerful method for the tumor
therapy.
[Key words] EGFRvⅢex; Monoclonal antibody; Characterization
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