全 文 ：第 35 卷 第 4 期 西 南 林 业 大 学 学 报 Vol． 35 No． 4
2015 年 8 月 JOUＲNAL OF SOUTHWEST FOＲESTＲY UNIVEＲSITY Aug． 2015
收稿日期:2014 － 12 － 30
基金项目:国家自然科学基金项目(NSFC 31260050)资助。
第 1 作者:张雪娟(1988—) ，女，硕士生。研究方向:植物遗传育种及群体遗传学。Email:juanzi888168@ 126. com。
通信作者:田斌(1983—) ，男，博士，讲师。研究方向:植物遗传育种及群体遗传学。Email:tianbinlzu@ gmail． com。
doi:10． 11929 / j． issn． 2095 － 1914． 2015． 04． 015
地构叶和广东地构叶基因组大小测定
张雪娟1 周知里1 朱仁斌2 巨苗苗1 何承忠1 田 斌1，3
(1．西南林业大学国家林业局西南生物多样性保育重点实验室，云南 昆明 650224;
2．西北农林科技大学资源环境学院，陕西 杨凌 712100;3．中国科学院昆明植物研究所，云南 昆明 650201)
摘要:以水稻为外标，采用流式细胞仪测定 2 种地构叶属植物地构叶和广东地构叶的基因组大小。
结果表明:地构叶的基因组大小(2C DNA含量)平均为(0. 81 ± 0. 02)pg，广东地构叶的基因组大小
(2C DNA含量)平均为(0. 85 ± 0. 02)pg。
关键词:地构叶属;地构叶;广东地构叶;基因组大小;流式细胞仪
中图分类号:S718. 46 文献标志码:A 文章编号:2095 － 1914(2015)04 － 0086 － 05
Estimation of Genome Sizes of Speranskia tuberculata
and Speranskia cantonensis
ZHANG Xue-juan1，ZHOU Zhi-li1，ZHU Ｒen-bin2，JU Miao-miao1，HE Cheng-zhong1，TIAN Bin1，3
(1． Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China，State Forestry Administration，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan
650224，China;2． College of Ｒesource and Environment，North West Agriculture and Forestry University，Yangling Shaanxi 712100，China;
3． Kunming Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Kunming Yunnan 650201，China)
Abstract:Using rice (Oryza sativ)as an external standard，the genome sizes of Speranskia tuberculata and
Speranskia cantonensis were determined by flow cytometry． As a result，the average genome sizes (the content of 2C
DNA)of Speranskia tuberculata and Speranskia cantonensis were about (0. 80 ± 0. 02)pg and (0. 85 ± 0. 02)pg，
respectively．
Key words:Speranskia;Speranskia tuberculata;Speranskia cantonensis;the genome sizes;flow cytometry
地构叶属(Speranskia)隶属于大戟科铁苋菜亚
科，为我国特有属，仅包含 2 个植物种。其中地构叶
(S． tuberculata) ，又名瘤果地构叶、珍珠透骨草等，
广泛分布于我国的北方地区，如东北、华北和西北
地区东部。广东地构叶(S． cantonensis)又名华南地
构叶、蛋不老等，广泛分布于秦岭淮河以南，南岭以
北的亚热带地区，如安徽、四川、江西、湖南等省［1］。
该属植物被应用在多种中药配方中，是一种重要的
民间药用植物，主治风湿痹痛、疔疮肿痛、跌打损伤。
作为重要的药用资源植物，目前对地构叶属的
研究主要集中在植物化学成分的提取与天然产物
以及药理活性的研究等方面。范云柏等［2］首次从
地构叶的地上部分提取出软脂酸、香草酸和阿魏酸
等化学物质;李艳梅等［3］从地构叶中提取出了地构
苷、香叶素以及多种黄酮类化合物;高海翔等［4］对
地构叶的挥发油成分进行了进一步的分析。王璇
等［5］比较了 5 种中药名为“透骨草”植物的抗炎和
镇痛活性，并进行了急性毒性实验，其中尤以地构
叶和角蒿最安全。然而，涉及地构叶属植物基本生
物学特性尤其是遗传背景的研究甚少。
基因组大小(C 值)是指单倍体细胞核中所含
的 DNA总量，也是生物基因组多样性非常重要的基
本参数［6］。确定物种基因组大小是物种今后的基
因组资源利用以及遗传改良的基础。一般以质量
计算，其单位为皮克(pg)或是以核苷酸碱基对数目
表示(Mb) ，1 pg 等于 978 Mb。植物的 C 值目前被
广泛应用于植物系统分类学、植物生理学和植物进
化生物学等领域，C值与植物的性状特征、生理特性
以及基因组进化等相关问题，已引起了众多科研工
作者的广泛关注［7 － 8］。然而，地构叶属植物作为传
统中药和药用活性成分提取的材料，其 C 值还未被
测定，有关 C值在药用植物的系统演化和进化等方
面的研究，还没有引起重视。
近年已经发展起来的测定基因组大小的方法
主要有孚耳根微显影、基因组测序法和流式细胞术
(Flow cytometry，FCM)3 种。对比这一系列不同的
方法，我们会发现孚耳根微显影的操作过程相对繁
杂，而基因组测序法花费比较大，显然流式细胞术
操作十分简单、分析非常快速、相对比较准确，而且
广泛应用于不同物种基因组大小测定的研究［8 － 10］。
Bennett统计结果显示，近 30 年中有 84. 5%的植物
C值是采用 FCM法测定［11］。本研究拟应用流式细
胞仪对大戟科地构叶属植物地构叶及广东地构叶
的基因组大小进行测定并加以分析，以期为地构叶
属植物资源的充分利用奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验材料为地构叶和广东地构叶野外采集种
子播种后长成的健康植株，每个植物种收集分别来
自 2 个不同种群的 3 个叶片作为重复，样品信息见
表 1。用作外标的水稻品种日本晴(Oryza sativa
subsp. japonica Kato cv. Nipponbare)取自中国科学
院昆明植物研究所。
1. 2 仪器与试剂
仪器:流式细胞仪(CyFlow Space )。
试剂:碘化丙啶(propidiumiodide，PI )染液，其
他均为常规分析纯试剂。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 提取液的选择 不同提取液的解离效果不
同，本试验对制备细胞核悬液过程中所需要的提取
液进 行 尝 试，比 如 常 见 的 LB01［12］、GPB［13］、
WPB［13］、Tris·MgCl2
［14］、Galbraith［15］，以获得适合
地构叶及广东地构叶的最佳提取液。适合的解离
液能促进植物细胞破碎充分，细胞器分散彻底，从
而解离出细胞核。由于植物材料不同，所以不同解
离液的解离效果相差甚大［16 － 17］。
1. 3. 2 细胞核悬液的制备 分别取地构叶和广东地
构叶的新鲜幼嫩叶片约 1. 5 g，用蒸馏水快速冲洗，之
后用滤纸吸干水分，放于培养皿中置于冰上预冷，后加
入预冷的解离液(约 1. 5 mL)，用锋利的刀片垂直快速
切碎叶片。充分混匀后用滤膜过滤并用移液枪吸取至
2 mL离心管，然后置于 4 ℃冰箱中孵育 5 min再取出，
置于离心机 1 000 r /min 4 ℃离心 5 min。小心弃上清，
向沉淀中加预冷的解离液 150 μL，混匀置于冰上备用。
采用相同方法获得水稻叶片的细胞核悬液，置于冰上
备用。操作时应注意刀片要锋利，材料要完全浸入提
取液，垂直快速切碎;每个样品至少重复 3次。
1. 3. 3 DNA特异性染色 将制备好的地构叶、广东
地构叶以及水稻的细胞核悬液放在冰上，分别往 3 种
不同的细胞核悬液中加入预冷的碘化丙啶(PI)染料
200 μL，再置于 4 ℃冰箱中避光染色，8 min即可。
1. 3. 4 样品测定及基因组大小计算 在样品上机
检测前，将染过色的样品轻轻振动 6 s，然后移至上
样管，采用流式细胞仪测定。每个样品收集 8 000 ～
15 000 个细胞(核) ，包括碎片。在测定过程中采用
500 nm的蓝光激发，后收集 FL2 通道的荧光并检测
PI发射的荧光强度。样品核 DNA 含量的计算方法
如下:
待测样品核 DNA含量(pg)=水稻日本晴核 DNA含量 ×
水稻样品 G0 /G1 峰荧光均值
待测样品 G0 /G1 峰荧光均值
2 结果与分析
2. 1 提取液的选择
在制备细胞核悬液的过程中，对常用的解离液进
行尝试。最后发现，裂解液WPB对地构叶及广东地构
叶的细胞核解离效果最佳，所得的峰形图杂峰较少或
没有杂峰。WPB配方为:200 mmol Tris·HCl ，4 mmol
MgCl2·6H2O，2 mmol EDTA·Na2·2H2O，86 mmol
NaCl，10 mmol 焦亚硫酸钠，1. 0 % PVP － 10，1. 0 %
(v /v)Triton X －100，pH 7. 5，4 ℃下保存。
2. 2 基因组大小的测定
由于采用内标法难以对地构叶属植物的离子团准
确区分(图 1 －A)。因此，本试验采用水稻品种日本晴
作为外标(图 1 －B)，应用流式细胞仪测试 6份水稻样
品计算 G0/G1峰荧光均值为 106. 18，随后又分别测定
来自地构叶和广东地构叶共 12组样品，每个样品测 3
次重复。部分样品的流式细胞图谱见图1 －C和图1 －
D。地构叶、广东地构叶的二倍体 DNA含量统计结果
见表 1。
78第 4 期 张雪娟等:地构叶和广东地构叶基因组大小测定
表 1 地构叶和广东地构叶 2C DNA含量测定结果
Tab． 1 2C DNA content measurement of Speranskia tuberculata and Speranskia cantonensis
植物种 样品来源 地理位置 样品编号 2C DNA含量 /pg 平均数 /pg 变异系数 /%
地构叶 山东济南市 北纬 36°3718″
东经 117°0416″
1 － 1 0. 83 ± 0. 04
1 － 2 0. 82 ± 0. 03
1 － 3 0. 78 ± 0. 04
甘肃广河县 北纬 35°2917″
东经 103°3433″
2 － 1 0. 79 ± 0. 01
2 － 2 0. 80 ± 0. 00
2 － 3 0. 81 ± 0. 01
0. 81 ± 0. 02 2. 55
广东地构叶 广东阳山县 北纬 24°4342″
东经 112°4516″
3 － 1 0. 80 ± 0. 03
3 － 2 0. 86 ± 0. 03
3 － 3 0. 83 ± 0. 00
广西桂林市 北纬 25°1826″
东经 110°1945″
4 － 1 0. 88 ± 0. 02
4 － 2 0. 86 ± 0. 00
4 － 3 0. 83 ± 0. 03
0. 85 ± 0. 02 2. 35
88 西 南 林 业 大 学 学 报 第 35 卷
由于水稻日本晴 2C DNA含量为 0. 795 pg［18］，
再以所测样品的 PI 发射荧光强度为根据可计算出
基因组的大小(2C DNA 含量) ，地构叶的基因组大
小平均为(0. 81 ± 0. 02)pg，变异系数为 2. 55%;广
东地构叶的基因组大小平均为(0. 85 ± 0. 02)pg，变
异系数为 2. 35 %。由此可知，地构叶和广东地构叶
的基因组大小很接近。
3 结论与讨论
通常情况下利用流式细胞仪测定植物基因组
大小采用内标方法，内标的选择应该符合以下几个
条件［19］:相比于待测物种，要有相近的基因组大小，
且较易区分;有稳定的遗传性;有可靠的基因组大
小数据;能获得大量样品。由于地构叶和广东地构
叶与普遍使用的内标如水稻和毛果杨(Populus tri-
chocarpa)等基因组大小类似，且难以区分离子团
(图 1) ，又与玉米(Zea mays)等基因组大小相差较
远，计算误差较大，难以得到准确的数据。因此，选
用水稻作为外标的试验方法测定地构叶属的基因
组大小。多次重复试验表明，该手段同样能得到较
为准确的数据。
所测得的不同地构叶样品和广东地构叶样品
的变异系数分别为 2. 55%和 2. 35%，说明同一物种
的不同植株和不同材料的基因组大小存在一定差
异。目前普遍认为，变异系数在低于 3 %时，被认为
实验结果是准确的，变异系数低于 5%也是可以接
受的范围［19］。地构叶和广东地构叶基因组大小的
变异系数均小于 3%，因此，认为此差异对于应用流
式细胞仪来测定植物基因组大小并没有造成实质
性的影响，测出的基因组大小数据很可靠。
杨德奎等［20］对地构叶的核型分析表明，地构叶
为二倍体植物(2n = 14) ，我们本次测得的地构叶和
广东地构叶的 DNA 含量接近(表 1) ，因此，可以推
断广东地构叶和地构叶一样，也应该是一个二倍体
植物，并且染色体条数有可能一致，均为 14 条。广
东地构叶基因组(0. 85 ± 0. 02)pg 稍大于地构叶
(0. 81 ± 0. 02)pg，很可能是在进化过程中某些染色
体或者基因片段发生了重复的结果。根据邱园的
植物 DNA C －值数据库(http:/ /data. kew. org /
cvalues / homepage. html)中的数据，大戟科的植物
基因组大小差异很大，范围在 0. 30 ～ 14. 35，平均值
为 3. 59，我们的结果表明:地构叶属在大戟科中属
于 DNA 含量较小的基因组，和巴豆亚科的木薯属
(Manihot)、以及同为铁苋菜亚科的蓖麻属(Ｒicinus)
的基因组大小类似，表明基因组大小不能反映大戟
科植物的系统演化关系，这与自然界普遍存在的“C
值悖论”［21］吻合。
本研究以日本晴作为外标，测定了地构叶属植
物地构叶和广东地构叶的基因组大小，这些数据将
有利于地构叶属植物遗传学和基因组学研究方案
的制定以及数据的分析，也为可测定其他药用植物
C值提供参考和借鉴。
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(责任编辑 赵粉侠)
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