全 文 ：硅酸盐细菌 NBT菌株在小麦根际定殖的初步研究 3
盛下放　
(南京农业大学生命科学学院 ,南京 210095)
【摘要】　对硅酸盐细菌 NB T 菌株进行了耐药性标记 ,得到稳定的链霉素抗性标记菌 NB T 菌株. 采用选择
性培养基分离计数 ,通过琼脂平板和盆栽试验 ,研究了标记菌 NB T 在小麦根际的定殖动态及影响因素. 结
果表明 ,在灭菌土盆栽中 ,播种后 9 d 左右 NB T 菌株在小麦根际的定殖水平达最高 (1. 4 ×108cfu·g - 1根
土) ,播种后 54 d 左右趋向稳定 ,NB T 菌株细胞数量为 2. 4 ×103cfu·g - 1根土 ;未灭菌土盆栽中 ,播种后 9 d
左右 NB T 菌株的定殖水平达最高 (3. 8 ×108cfu·g - 1根土) ,60 d 左右趋向稳定 , 菌数为 3. 1 ×103cfu·g - 1根
土. 生物和非生物因素对 NB T 菌株定殖小麦根系有影响.
关键词 　耐药菌株 　小麦根际 　定殖动态
文章编号 　1001 - 9332 (2003) 11 - 1914 - 03 　中图分类号 　Q938. 1 　文献标识码 　A
Colonization of silicate bacterium strain NBT in wheat roots. Sheng Xiafang( College of L if e Sciences , N anjing
A gricultural U niversity , N anjing 210095 , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2003 ,14 (11) :1914～1916.
The strain NB T of silicate bacterium was labelled with streptomycin ,and a stable streptomycin resistance strain
NB T was obtained. Its colonization dynamics and affecting factors in wheat rhizosphere were studied in agar
plates and greenhouse pots were studied by counting the method with selective medium. The results of pot cul2
ture experiment showed that strain NB T could successfully colonize in the rhizosphere of wheat . In pot cultures of
sterile soil ,the highest colonization level (3. 4 ×107cfu·g - 1 root soil ) was reached on 9th day after seeds sown ;
at 54th day , the population of strain NB T tended to stable , and decreased to 1. 4 ×104 cfu·g - 1 root soil. In pot
cultures of unsterile soil , the highest colonization level (3. 8 ×107cfu·g - 1 root soil ) was reached at 9th day ,and
the population of strain NB T tended to a stationary state at 60th day ,with the numbers being 1. 4 ×104 cfu·g - 1
root soil. Some biological and abiotic factors could greatly influence the colonization of the beneficial microorgan2
ism.
Key words 　Streptomycin resistance strain , Wheat rhizosphere , Colonizing dynamics.
3 上海市农业委员会项目 (农科攻字 (98) 第 0522 号) 和江苏省教育
厅社会发展资助项目 (BS2002044) .
2001 - 01 - 15 收稿 ,2001 - 04 - 01 接受.
1 　引 　　言
土壤细菌和根圈细菌作为提高农业产量的作物
接种剂 ,已研究了一个多世纪. 业已证明不同类群的
细菌对植物有益 ,包括生防菌、植物促生根际细菌
( Plant Growth2promoting Rhizobacteria ; 简称 PG2
PR) 、增产菌以及固氮螺菌 ( A zospi rill um spp . ) . 但
是 ,这些细菌必须在根内或根面生长才能对植物生
长产生影响. 因此 ,它们能否在根部定殖至关重要.
现在 ,细菌的根部定殖已成为测量各种细菌2植物系
统的一个重要参数 ,亦即测量引入细菌的根部定殖
已成为揭示有益细菌的根圈微生态学特征、提高其
根圈适应性和增产效果必不可少的研究内容. 人们
已利用各种检测手段跟踪、检测和回收了各种细
菌[1～4 ,8 ,10 ,11 ] .硅酸盐细菌作为一种植物促生根际
细菌已受到人们的普遍重视. 这种细菌能通过释放
含钾矿物中的钾、硅等元素以及通过产生的植物激
素等生理活性物质来促进作物生长、提高作物产量、
改善作物品质[5～7 ,9 ] . 硅酸盐细菌要发挥其功能 ,首
先必须能够在作物根部成功地定殖. 然而 ,有关硅酸
盐细菌在作物根际的存活状况、群体数量的变化以
及与环境条件的关系等研究至今未见报道. 由于传
统的研究方法难以将引入的细菌菌株与同类土著性
细菌分开 ,以致研究结果偏差较大. 为此 ,本研究试
采用抗生素标记法 ,研究硅酸盐细菌 NB T 菌株在小
麦根际的定殖动态及影响因素 ,为阐明硅酸盐菌剂
的促生机理及科学应用提供科学依据.
2 　材料与方法
211 　供试材料
硅酸盐细菌 NB T 菌株 ,由南京农业大学微生物学系分
离筛选. 供试作物为小麦 (杨麦2158) . 供试土壤为黄棕壤 (采
自南京卫岗 ) . 有氮培养基组成 ( g ·L - 1 ) : 蔗糖 1 % ,
(NH4) 2 SO40. 1 % , K2 HPO4 0. 2 % , MgSO4 . 7H2O 0. 05 % ,
NaCl 0. 01 % ,酵母膏 0. 05 % , CaCO3 0. 05 % , p H 7. 4. 无氮
应 用 生 态 学 报 　2003 年 11 月 　第 14 卷 　第 11 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Nov. 2003 ,14 (11)∶1914～1916
培养基组成 (g·L - 1 ) : 蔗糖 1 % , K2 HPO4 0. 05 % , MgSO4 .
7H2O 0. 02 % , NaCl 0. 02 % , CaCO3 0. 05 % , p H 7. 4. 缺钾培
养基组成 ( g·L - 1 ) : 有氮培养基中的 K2 HPO4 用等量的
Na2 HPO4 代替 ;菌株标记用培养基 :有氮培养基 + 不同浓度
(5 ,20 ,50 ,1200 ,μg·ml - 1)的盐酸链霉素.
212 　耐药菌株的获得 [11 ]
将 NB T 菌株接种于有氮液体培养基中 ,28 ℃振荡培养
至对数期的中期 (培养时间为 20h) ,吸取 1 ml 菌液涂布于含
5μg·ml - 1链霉素的固体有氮培养基上 ,置 28 ℃恒温培养
2d. 挑取在平板上出现的菌落至含 20μg·ml - 1链霉素的有氮
液体培养基内 ,28 ℃振荡培养. 当培养基出现混浊时 ,再接种
至含 50μg·ml - 1链霉素的有氮液体培养基中振荡培养. 以此
类推 ,最后涂布于含药的有氮培养基平板 ,待长出菌落 ,挑取
并保存于斜面 ,由此获得抗 1200μg·ml - 1链霉素的菌株.
213 　稳定性试验
稳定性试验的具体方法见文献 [11 ] . 获得的具有良好抗
药稳定性菌株用于以下试验.
214 　接种物的制备
NB T 菌株接入有氮液体培养基 ,28 ℃振荡培养 30 h 后
(细胞数量为 2. 7 ×108 个·ml - 1) 浸泡小麦种子 1 h ,自然凉
干 ,备用.
215 　灭菌土和不灭菌土盆栽试验
取黄棕壤过筛 (20 目) ,加水拌匀 ,装钵 ,装量为每钵
800g ,126 ℃湿热灭菌 2 h ,冷却后浇无菌水保湿 3～5d 后播
种 ,每钵播入 10 粒种子 ,每隔 3d 浇一次无菌水 ,取不同生长
时间 (1～60 d) 的小麦根样检测 ,检测方法见文献[13 ] . 计数
在无氮培养基平板上进行 (培养基中添加 1200μg·ml - 1盐酸
链霉素)
216 　平板试验
接种物种植于琼脂平板内 ,待种子生根之后 3～17 d 内
定期采样检测细菌在小麦根上定殖数量 ,计算 1cm 根段上
细菌菌落形成单位 cfu·cm - 1 . 检测与计数方法同 2. 5 .
217 　摇瓶试验
500 ml 三角瓶 ,每瓶加钾长石粉 (100 目) 2. 0 g 和缺钾
培养基 100 ml ,在 121 ℃下灭菌 20min ,然后接入硅酸盐菌剂
5ml. 对照接等量灭活菌液. 试验设 3 个重复 ,28 ℃振荡培养
(200 r·min - 1) 5d 后取样分析. 样品处理方法见文献 [6 ] ,钾用
原子吸收分光光度法测定.
3 　结果与分析
311 　抗生素抗性标记菌株 NB T 的定殖动态
　　利用链霉素平板测定 NB T 菌株在小麦根际的
定殖密度和动态变化 (图 1) . 接种 NB T 菌株后即开
始增殖 (最初接种量为每棵小麦种 6. 4 ×106cfu) ,在
灭菌土盆栽条件下 ,定殖在小麦根际的 NB T 菌株细
胞数量在接种后 9 d 左右达最高 (1. 4 ×108cfu·g - 1
根土) ,54 d 左右趋向稳定 ,数量为 2. 4 ×103cfu·g - 1
根土 ;在未灭菌土盆栽条件下 ,NB T 菌株的定殖数
量则在 9 d 左右达最高 (3. 8 ×108cfu·g - 1根土) ,60
d 左右即开始趋向稳定 ,为 3. 1 ×103cfu·g - 1根土.
未灭菌条件下达到增殖高峰的时间与灭菌条件下的
时间相近 ,但未灭菌条件下最大定殖数量高于灭菌
条件下 ,且未灭菌条件下细胞定殖数量趋向稳定的
时间延长 ,其原因可能与土著微生物或土壤中其它
活性物质对 NB T 菌株生长、繁殖的促进作用.
图 1 　NBT 菌株在小麦根际定殖的动态变化
Fig. 1 Dynamic variations of NBT colonizing in wheat rhizosphere.
Ⅰ. 灭菌土 Sterile soil , Ⅱ. 未灭菌土 Non2sterile soil.
312 　NB T 菌株在根部定殖的影响因素
31211 水分含量 　NB T 菌株定殖小麦根系能力受
水分含量影响较大. 在 0. 5 %和 1. 0 %琼脂平板上 ,
NB T 菌株定殖小麦根系的数量分别为 4. 2 ×105 和
4. 5 ×105cfu·cm - 1 ,显著高于 1. 5 %琼脂上的数量
(1. 6 ×105 cfu·cm - 1) ;而 1. 5 %琼脂上的细菌定殖
数量又显著高于 3. 0 %琼脂上的数量 (7. 6 ×104 cfu·
cm - 1) .
31212 p H 值 　在 NB T 菌株生长适宜 p H 值范围内
(6. 5～8. 0) , NB T 菌株在小麦根系定殖能力受 p H
值的影响不大 (表 1) .
表 1 　pH值对 NBT菌株定殖小麦根系的影响 3
Table 1 Effect of pH on the colonization of strain NBT on wheat root
system( logcfu·cm - 1)
p H 1d 3d 6d 9d
6. 5 5. 14a 5. 25a 5. 36a 5. 30a
7. 0 5. 36a 5. 62a 5. 95a 5. 86a
7. 5 5. 87a 6. 13a 6. 26a 6. 35a
8. 0 5. 74a 5. 85a 6. 15a 5. 92a3 Duncan’sα= 0. 05 Different analysis was Duncan’sα= 0. 05.
31213 营养成分 　生长于 SA 和 WA 2 种营养条件
下 ,小麦根上 NB T 菌株定殖数量 4 次检测结果均高
于生长在 NA 上的定殖数量. 生长于 HA 营养条件
下 ,小麦根上 NB T 菌株定殖数量最大 ,说明 NB T 菌
株在有机氮丰富的条件下不能很好生长 ;在小麦最
适生长条件下 ,NB T 菌株细胞能很好生长 (表 2) .
31214 芽孢杆菌 　芽孢杆菌 C3 和 C8 菌株首先定
殖小麦根上 ,对 NB T 菌株再定殖没有显著影响. 同
519111 期 　　　　　　　　　　　盛下放 :硅酸盐细菌 NB T 菌株在小麦根际定殖的初步研究 　　　　　　　　
时 ,NB T 菌株在小麦根上定殖的数量并未受后来
C3 和 C8 菌株定殖的影响 (表 3) .
表 2 　营养成分对 NBT菌株定殖小麦根系的影响
Table 2 Effect of nutrients on colonization of strain NBT on wheat root
system( logcfu·cm - 1)
营养成分 3 Nutrients 1d 3d 5d 7d
NA 6. 11 6. 10 6. 05 5. 25
SA 6. 32 6. 47 6. 47 6. 24
WA 6. 24 6. 15 6. 21 6. 10
HA 7. 15 7. 12 6. 95 6. 873 琼脂浓度均为 1. 0 %Agar concentration was 1. 0 % in all plates ,NA :
0. 2 %营养肉汤琼脂平板 0. 2 % nutrition of peptone agar plate ,SA :土
壤浸出液琼脂平板 Solution of soil agar plate ,WA :琼脂平板 Water2a2
gar plate ,HA : Hogland 溶液琼脂平板 Solution of Hogland agar plate.
表 3 　芽孢杆菌对 NBT菌株定殖小麦根系的影响
Table 3 Effect of strain Bacillus on the colonization of strain NBT on
wheat roots( logcfu·cm - 1)
处理
Treatment
定殖数量 (NBT)
Population
densities
处理
Treatment
定殖数量 (NBT)
Population
densities
C3 + NBT 4. 94 a NBT + C3 5. 10 a
C8 + NBT 5. 16 a NBT + C8 5. 25 a
NBT 5. 11 a NBT 5. 15 a
313 　标记菌株的解钾活性
　　硅酸盐细菌 NB T 菌株在摇瓶条件下表现出较
强的分解钾长石的能力 (表 4) . 培养 5d , 标记菌株
可以从钾长石中释放出 89. 1 mg·L - 1钾 ,比接灭活
菌和不接菌对照分别增加 49. 8 %和 732. 7 %. 非标
记菌株可以从钾长石中释放出 89. 6 mg·L - 1钾 ,说
明硅酸盐细菌 NB T 菌株经抗药性标记后 ,其解钾活
性没有丧失.
表 4 　硅酸盐细菌 NBT菌株的解钾作用
Table 4 K release from feldspar by strain NBT of silicate bacterium
处理
Treatment
培养液中的钾
K in fermented
fluid (mg·L - 1)
p H
不接菌 No2inoculation 10. 7 6. 95
接灭活菌 Inoculation with dead bacteria 60. 5 6. 56
接菌 Inoculation with active bacteria 89. 6 5. 45
接标记菌 Inoculation with labeled bacteria 89. 1 5. 48
接标记灭活菌 Inoculation with labeled dead bacteria 59. 5 6. 87
4 　讨 　　论
　　有益微生物在根际定殖并在整个植物生长周期
保持较多数量的存活 ,这是人工接种菌剂能否有效
地提高作物产量的重要因素. 引入植物根际的微生
物的检测方法有 4 种 :天然抗生素抗性的标记 ,外来
基因标记 ,DNA 和 RNA 探针以及免疫学方法[12 ] .
采用天然抗生素抗性作为检测标记具有简便、快速、
消耗低、实验结果可以进行统计分析等优点. 当菌株
没有选择标记时 ,天然抗生素抗性就很实用[13 ] . 虽
然这种方法有其局限性 ,如土壤本底中抗生素抗性
菌株的存在以及抗生素抗性的不稳定性. 但在本研
究中 ,经抗生素平板检测供试土壤中不存在抗盐酸
链霉素 (1200μg·ml - 1)菌株 ;另外 ,本研究采用了无
氮培养基作为一种选择培养基 ,提高了供试菌株检
测的可靠性和准确性. 通过无菌和有菌条件下培养
和抗生素标记法测定 ,表明 NB T 菌株能在小麦根际
成功定殖并保持较多数量. NB T 菌株细胞定殖数量
的变化都是先快速增殖然后逐渐下降并保持一个较
低的相对稳定状态. 但是在田间作物整个生长季节
以及在不同土壤 ,不同作物根际 NB T 菌株存活状况
以及它们的主导作用 ,值得进一步研究. 另外 ,可采
用基因探针、发光酶基因等研究方法原位检测硅酸
盐细菌在作物根际的分布状况、动态变化及其影响
因素 ,为进一步阐明硅酸盐细菌促生机理及科学应
用提供试验依据.
参考文献
1 　Bai J2L (柏建玲) ,Wang P (王 　平) , Hu Z2J (胡正嘉) . 1999. Us2
ing lux genes marker technique to track Pseudomonas chlororaphis
PL9L in cotton rhizosphere. Acta Microbiol S in (微生物学报) ,39
(1) :43～48 (in Chinese)
2 　Chabot R , Kloepper J . 1996. Root colonization of maize and lettuce
by bioluminiescent Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli .
A ppl Envi ron Microbiol ,62 (8) :2767～2772
3 　Holflich G , Wiehe W , Kuhn G. 1994. Plant growth stimulation by
inoculation with symbiotic and associative rhizosphere microorgan2
isms. Ex perientia ,50 :897～905
4 　Kluepfel DA. 1993. The behavior and tracking of bacteria in the
rhizosphere. A nn Rev Phytopathol ,31 :441～472
5 　Luo W(罗　微) ,Xie D2T (谢德体) , Huang Z2X(黄昭贤) . 1998.
Role of silicate bacteria in releasing potassium from minerals and
soils. J Southwest A gric U niv (西南农业大学学报) ,20 (1) :5～8
(in Chinese)
6 　Sheng X2F(盛下放) , Huang W2Y(黄为一) , Yin Y2X(殷永娴) .
2000. Effects of application of silicate bacterium fertilizer and its
potassium release. J Nanjing A gric U niv (南京农业大学学报) ,23
(1) :43～46 (in Chinese)
7 　Ullman WJ , Kirchman DL ,Welch SA ,Vandevivere P. 1996. Labo2
ratory evidence for microbially mediated silicate mineral dissolution
in nature. Chem Geol ,32 (1～4) :11～17
8 　Wang P (王 　平) , Wang Q (王 　勤) , Feng X2M (冯新梅) .
1999. Root colonization of non2legume plants by luxAB and GusA
genes marked huakuii J S5A16. J Huaz hong A gric U niv (华中农业
大学学报) ,18 (3) :238～241 (in Chinese)
9 　Wang S2Y(王思远) . 2000. Effect of the silicate bacterium on ab2
sorbing and transforming nutrient of tobacco in soil. J Jili n A gric
U niv (吉林农业大学学报) ,22 (3) :10～15 (in Chinese)
10 　White D ,Leifert C ,Ryder MH , et al . 1996. Lux gene technology —
a strategy to optimize biological control of soil2borne disease. New
Phytologist ,133 :173～181
11 　Wu S2C(吴胜春) ,Li L2M (李良谟) , Li Z2G(李振高) . 1994. Ob2
taining streptomycin resistance strain from predominant rhizosphere
bacteria and its 15N label. Microbiol J (微生物学通报) ,21 (4) :195
～198 (in Chinese)
12 　Zhang B2X(张炳欣) , Zhang P (张 　平) . 2000. Detection of in2
troduced microorganisms to rhizosphere. J Zhejiang U niv ( A gric
and L if e Sci) (浙江大学学报 (农业与生命科学版) ) ,26 (6) :624
～628 (in Chinese)
13 　Zhang Y2X(张玉勋) , Wang D2B(王道本) , Peng Y2F (彭于发) .
1996. Studies on the colonization of the biocontrol agent D93 strain
on wheat roots. J Huaz hong A gric U niv (华中农业大学学报) ,15
(1) :18～23 (in Chinese)
作者简介 　盛下放 ,男 ,1963 年生 ,副教授 ,博士 ,主要从事
土壤养分微生物活化及土壤污染微生物治理等研究 ,发表学
术论文 10 余篇. E2mail :xfsheng604 @sohu. com
6191 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　14 卷