全 文 ：三种兽药添加剂对土壤赤子爱胜蚓的
毒理学研究 3
曲甍甍1 　徐　韵1 　陈海刚1 　李兆利1 　孙立伟1 　徐迪今1 　孔志明1 3 3
杉浦则夫2
(1 南京大学环境学院 污染控制与资源化国家重点实验室 ,南京 210093 ;2 日本筑波大学 农林工学系 ,筑波 30528572 ,日本)
【摘要】　喹乙醇、阿散酸和土霉素是应用极广的兽药添加剂 ,在畜牧业的发展中起着特殊的作用 ,但其使
用不当或过量使用会给环境带来很大危害. 采用土壤中的重要生物赤子爱胜蚓作为生物材料 ,分别研究了
喹乙醇、阿散酸和土霉素对赤子爱胜蚓的急性毒性和对赤子爱胜蚓体腔细胞 DNA 的损伤. 结果表明 ,喹乙
醇溶液法 LC50 > 2 000 mg·L - 1 ,滤纸法 LC50 > 5. 71 ×10 - 2 mg·cm - 2 ,而阿散酸和土霉素在所设最大受试
剂量内没有毒性. 单细胞凝胶电泳试验结果表明 ,阿散酸没有引起蚯蚓体腔细胞 DNA 明显损伤 ;喹乙醇和
土霉素均能引起一定程度的 DNA 损伤 ,中、高剂量组与阴性对照相比有极显著差异 ( P < 0. 01) . 因此 ,有
必要加强对以上兽药添加剂 ,特别是喹乙醇和土霉素的管理 ,控制用药时间和剂量 ,以确保人体健康和环
境安全.
关键词 　兽药添加剂 　喹乙醇 　阿散酸 　土霉素 　赤子爱胜蚓 　急性毒性试验 　单细胞凝胶电泳
文章编号 　1001 - 9332 (2005) 06 - 1108 - 04 　中图分类号 　X172 　文献标识码 　A
Toxicological study of three veterinary drugs on Eisenia f oetida . QU Mengmeng1 ,XU Yun1 ,CHEN Haigang1 ,
L I Zhaoli1 ,SUN Liwei1 , XU Dijin1 , KON G Zhiming1 , SU GIURA Norio2 ( 1 S tate Key L aboratory of Pollution
Cont rol and Resource Reuse , School of Envi ronment , N anjing U niversity , N anjing 210093 , China ; 2 Institute
of A gricultural and Forest Engineering , U niversity of Tsukuba , Tsukuba 30528572 , Japan) . 2Chin. J . A ppl .
Ecol . ,2005 ,16 (6) :1108～1111.
By the methods of acute toxicity test and single cell gel electrophoresis (comet assay) ,this paper evaluated the
toxicological effects of three veterinary drugs olaquindox ,arsanilic acid and oxytetracycline on earthworm ( Eise2
nia f oetida) coelomocytes in vivo. The results of acute toxicity test showed that only the highest dose of olaqui2
dox caused the death of some earthworms ,and none of the test drugs had any effects on earthworm at their envi2
ronmentally relevant concentrations. The comet assay indicated that arsanilic acid had no genotoxicity to earth2
worm ,while olaquindox and oxytetracycline induced significant DNA damage in earthworm coelomocytes ( P <
0. 01) .
Key words 　Veterinary additives , Olaquindox , Arsanilic acid , Oxytetracycline , Eisenia f oetida , Acute toxicity
test , Single cell gel electrophoresis test (SCGE) . 3 高等学校博士学科点专项科研基金资助项目 (20020284041) .3 3 通讯联系人.
2004 - 06 - 29 收稿 ,2004 - 11 - 19 接受.
1 　引 　　言
随着畜禽水产养殖业的迅猛发展 ,各种兽药添
加剂的应用日趋广泛. 然而 ,当兽药添加剂使用不当
时 ,就不可避免地会引起各种环境问题. 过量的兽药
添加剂可在畜禽内脏中大量沉积 ,其残留通过各种
途径进入环境 ,会严重威胁生态系统安全 ,进而影响
人体健康[14 ] . 喹乙醇 (olaquindox) 、阿散酸 (arsanilic
acid)和土霉素 (oxytet racycline) 作为最为常用的几
种兽药添加剂 ,使用不当或过量使用 ,对环境造成的
危害不可小视. 因此 ,研究兽药添加剂喹乙醇、阿散
酸和土霉素的生态效应 ,具有重要的意义.
蚯蚓是分布广泛的土壤动物 ,是维持土壤肥力
的重要生物 ,是陆生生物与土壤生物之间传递污染
物的桥梁 ,是土壤生态系统中土壤物质生物小循环
的重要一个环节[24 ] . 因此 ,研究兽药添加剂对蚯蚓
的毒性 ,是评价兽药添加剂对土壤生态环境安全性
影响的一个重要指标. 为了研究兽药添加剂喹乙醇、
阿散酸和土霉素对土壤生态系统的影响 ,选择赤子
爱胜蚓为生物材料 ,分别采用溶液法和滤纸法 ,研究
了喹乙醇、阿散酸和土霉素对赤子爱胜蚓的急性毒
性 ,同时研究了上述兽药添加剂对赤子爱胜蚓体细
胞 DNA 的损伤. 从生物个体水平和分子水平对喹
应 用 生 态 学 报 　2005 年 6 月 　第 16 卷 　第 6 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,J un. 2005 ,16 (6)∶1108～1111
乙醇、阿散酸和土霉素的毒性进行了系统的研究 ,从
而为全面地评价 3 种兽药添加剂对土壤生态系统的
影响和对人类健康的潜在危害提供科学依据.
2 　材料与方法
211 　供试材料
喹乙醇 (olaquindox) ,由南通醋酸化工股份有限公司提
供 ,纯度 98 %. 阿散酸 ( arsanilic acid) 、土霉素 (oxytetracy2
cline)由南京壮大特种饲料厂提供 ,纯度均为 98 %. 赤子爱胜
蚓 ( Eisenia f oetida) ,购于南京市花鸟市场 ,于实验室中人工
驯养 14 d. 试验中选择 2 月个龄以上 ,体重 300～500 mg 的
健康成蚓.
212 　试验方法
21211 蚯蚓的急性毒性试验 ———48 h 溶液法 　溶液法虽然
不是国家环保局规定的标准方法 ,但是它具有快速、简便、暴
露直接等优点 ,可用于毒物的初筛和毒性的快速鉴别 ,因此
在国外已多有报道[12 ] . 本文按 Belfroid[2 ]报道的方法进行.
根据预试验结果设定试验浓度范围 ,共设 5 个剂量组. 采用
长 8 ml、直径 3 ml 的玻璃管 ,每个玻璃管中加 1 ml 受试物溶
液 ,各放入 1 条蚯蚓 ,并用带孔的薄膜封口. 每个剂量组各
10 管. 用去离子水 (土霉素为 1 % Tween280) 作空白对照. 置
于恒温培养箱内 ,20 ±1 ℃湿度 80 %左右 ,无光照培养. 分别
于 24 和 48 h 各计数 1 次死亡数 ,死亡以对机械刺激无反应
为标准.
21212 蚯蚓的急性毒性试验 ———48 h 滤纸法 　按照《化学品
测试准则》中的“蚯蚓急性毒性试验方法”[19 ]和 OECD 推荐
的标准方法进行. 根据预试验结果设定试验浓度范围 ,共设
5 个剂量组. 采用上述玻璃管 ,玻璃管内壁衬铺大小适中的
中性滤纸 (80～85 g·m - 2) . 用移液管吸 1 ml 受试物溶液加
入玻璃管 ,对照用 1 ml 的曝气水 ,冷风吹干后在玻璃管中加
1 ml 去离子水以湿润滤纸. 每管各放入 1 条蚯蚓 ,用带孔的
薄膜封口. 每个剂量组各 10 管. 培养条件同上. 分别于 24 和
48 h 各计数 1 次死亡数. 计算 48 h LC50 .
21213 蚯蚓体腔细胞单细胞凝胶电泳试验 　按照溶液法急
性毒性试验的染毒方法进行. 染毒时间为 24 h. 喹乙醇和阿
散酸以去离子水为对照 ,土霉素以 1 % Tween280 为对照. 根
据 Eyambe 的方法提取体腔细胞[8 ] . 把蚯蚓个体置于 4 ℃生
理盐水中冲洗干净 ,分别移入 eppendorf 管中 ,加 1 ml 的提取
液 ,浸泡 115 min ,使细胞浓度达到 106～107 个·ml - 1 . 取出
蚯蚓 ,剩余溶液离心 (3 000 r·min - 1 ,3 min) . 用 PBS 缓冲液
冲洗沉淀物 ,离心 (3 000 r·min - 1 ,3 min) 待用. 用苔盼蓝染
色 ,检测细胞的存活率 ( > 90 %) . 准备铺胶. 单细胞凝胶电泳
按 Singh 报道的方法进行[25 ] .
213 　数据分析用
C25050ZOOM 型 OL YMPUS 数码相机拍摄彗星照片 ,
应用 Comet Assay Software Project (CASP)图像分析软件对彗
星照片进行分析 ,每个平行至少分析 50 个细胞.
一个典型的“彗星”图象包括头部和尾部. 无损伤的无尾
部 ,只有一个明亮的圆盘 ,表明无损伤. 当 DNA 损伤程度由
轻到重 ,则“彗星”的尾部逐渐变长变大 ,头部逐渐变小 ,且荧
光强度逐渐变弱. CASP 分析软件可同时提供超过 10 种参
数的分析结果. 为了简明而全面地反映 DNA 损伤情况 ,选择
Olive 尾矩 (olive tail moment ,O TM ;彗星尾部 DNA 含量 ×彗
星头尾重心间的距离)作为 DNA 损伤评价指标 ,同时提供尾
长 (tail length , TL)和彗尾 DNA 含量 (tail DNA % , TDNA) 两
个参数作为参考 ,以较全面反应 DNA 的损伤情况.
数据的统计分析采用 Excel 和 Spss 软件. 根据数据的分
布特征和方差 ,采用非参数检验 (Mann2Whitney U 检验) 进
行各剂量组与空白对照组的显著性检验.
3 　结果与讨论
311 　3 种兽药对蚯蚓的急性毒性
蚯蚓急性毒性试验的结果见表 1. 结果表明 ,喹
乙醇溶液法 LC50 > 2 000 mg·L - 1 ,滤纸法 LC50 >
5171 ×10 - 2 mg·cm - 2 ,测试浓度已达到最大溶解
度 ,喹乙醇对蚯蚓的毒性很小. 阿散酸和土霉素在最
大溶解度内均未引起蚯蚓死亡. 蚯蚓的平均体重为
0132 ±0105 g. 喹乙醇、阿散酸和土霉素对蚯蚓体腔
细胞单细胞的凝胶电泳试验结果见表 2. 图 1a、b 为
典型的未受损伤蚯蚓体细胞 DNA 的彗星图片 ,图
1c 为典型的受损 DNA 的彗星图片.
表 1 　3 种兽药对蚯蚓的急性毒性
Table 1 Aacute toxicity of three veterinary drugs to earthworm
项目
Item
48 h LC50
溶液法
Solution method
(mg·L - 1)
滤纸法
Paper method
(mg·cm - 2)
喹乙醇 Olaquindox > 2 000 > 5171 ×10 - 2
阿散酸 Arsanilic acid > 4 000a > 5171 ×10 - 2a
土霉素 Oxytetracycline > 500a ,b > 7114 ×10 - 3a ,b
a)在此种受试剂量内 ,蚯蚓没有出现死亡 No lethal effect at all dose
levels ; b)以 1 % Tween80 为溶剂对照 Using 1 % Tween80 as solvent
control.
表 2 　3 种兽药添加剂对蚯蚓体腔细胞 DNA的损伤
Table 2 DNA damages of earthworm coelomocytes exposed to three vet2
erinary drugs
项目
Item
剂量 Dose
(mg·L - 1)
OTM
( %·μm - 1)
TDNA
( %)
TL
(μm)
喹乙醇 500 0178 ±0106 5161 ±0139 7108 ±0137
Olaquindox 1 000 1127 ±0108 3 3 8169 ±0146 3 3 10118 ±0148 3 3
2 000 2119 ±0100 3 3 13129 ±1114 3 3 13180 ±1114 3 3
0a 0171 ±0105 5100 ±0133 7105 ±0138
阿散酸 1 000 0198 ±0111 6170 ±0160 7179 ±0150
Arsanilic acid 2 000 0199 ±0104 7112 ±0129 8139 ±0129
4 000 1100 ±0111 7104 ±0173 8137 ±0170
0a 0195 ±0107 6119 ±0139 9101 ±0156
土霉素 125 2109 ±0110 3 3 12153 ±0155 3 3 15127 ±0162 3 3
Oxytetracycline 250 3106 ±0116 3 3 16174 ±0171 3 3 20164 ±0183 3 3
500 5187 ±0139 3 3 23199 ±1121 3 3 33149 ±1161 3 3
0b 0179 ±0105 5142 ±0134 7195 ±0139
a)以去离子水为空白对照 Using deionized water as control ;b)以 1 % Tween80 为溶剂对照 Us2
ing 1 % Tween 80 as solvent control ; 3 3 P < 01011
90116 期 　　　　　　　　　　　曲甍甍等 :三种兽药添加剂对土壤赤子爱胜蚓的毒理学研究 　　　　　　　　　　　
图 1 　DNA 的彗星照片 ( ×400)
Fig. 1 Typical comet figures ( ×400) .
a) 空白对照组 Deionized water control ; b) 溶剂对照组 1 % Tween 80
control ; c) 土霉素 500mg·L - 1剂量组 500 mg·L - 1 of oxytetracycline.
　　以 O TM 值为损伤检测指标 ,可以看出 ,阿散酸
并未引起蚯蚓体腔细胞 DNA 的损伤 ,而喹乙醇和
土霉素均能引 DNA 损伤 ,其中高剂量组与对照组
相比有极显著差异 ( P < 0101) ,并且在设定的剂量
范围内呈现出一定的剂量效应关系 (图 2)
　
图 2 　不同暴露剂量对蚯蚓体腔细胞 DNA 的损伤 (OTM 箱图)
Fig. 2 DNA damages of earthworm coelomocytes at different doses
(Boxplot of OTM) .
a) 喹乙醇 Olaquindox ;b) 阿散酸 Arsanilic acid ;c) 土霉素 Oxytetracy2
cline.
312 　喹乙醇的毒性
喹乙醇能够增强代谢 ,增加瘦肉率 ,同时对多种
细菌有较强的抑制或杀灭作用[3 ] . 喹乙醇具有明显
的蓄积毒性 ,亦可导致鲤鱼贫血 ,破坏鱼体内抗氧化
系统[26 ] ;同时 ,还具有和卡巴氧相同的喹　啉21 ,42
二氧化物结构 ,一直被怀疑具有潜在的基因毒性 ,所
以美国食品药物管理局 ( FDA) 没有批准其使用. 在
本研究中 ,虽然喹乙醇的急性毒性很低 ,但是在设定
的剂量范围内 ,能对蚯蚓体腔细胞 DNA 造成明显
的损伤 ,表明喹乙醇有明显的致染色体断裂的作用.
另外 ,喹乙醇在粪中的结合力较弱[18 ] ,通过淋溶等
作用很容易进入各种水体 ,进而威胁大型蚤等水生
生物. 由于实际生产上长期存在着兽药添加剂使用
不当或超量施用的情况 ,大量残留喹乙醇通过各种
途径进入环境后 ,会严重危害生态系统安全 ,并可能
通过食物链威胁人体健康.
313 　阿散酸的毒性
阿散酸作为一种多功能型的饲料添加剂 ,不但
起着补充必要微量元素砷的营养性作用 ,还具有重
要的药物作用 ,同时也在不同程度上起着与生长促
进剂和抗菌剂相似的作用. 美国 EPA 的 Ames 试验
和小鼠骨髓细胞微核试验都表明 ,阿散酸不具有致
突变作用. 本文的单细胞凝胶电泳试验结果也表明 ,
在设定的试验浓度内 ,阿散酸不会引起蚯蚓体腔细
胞 DNA 的损伤. 砷对土壤固氮菌、解磷菌、纤维分
解菌、真菌和放线菌具有抑制作用 ,土壤受到砷污染
后 ,微生物呼吸强度降低 ,CO2 产出减少[27 ] . 阿散酸
作为一种难降解的砷制剂 ,很容易通过牲畜排泄进
入环境 ,并在土壤中沉积. 这一方面会造成施用地点
周围砷含量的增加 ;另一方面 ,阿散酸含有一个类似
无机态 5 价砷酸的结构[10 ] ,而有多种无机砷已被证
实具有致癌性[11 ] ,因此一旦阿散酸经过各种因素的
长时间作用降解 ,产生无机砷 ,其可能对环境造成的
危害是不容忽视的.
314 　土霉素的毒性
土霉素在畜牧养殖业中应用范围很广. 在急性
毒性方面有报道认为 ,土霉素在具有生态学意义的
浓度范围内 ,对蚯蚓等土壤生物没有毒性[1 ] . 但是 ,
土霉素作为广谱型抗生素 ,进入土壤后必然会对土
壤中的细菌产生作用 ,影响土壤菌群结构[7 ] . 结果
表明 ,在所设定的浓度范围内 ,土霉素能诱导蚯蚓体
腔细胞 DNA 的显著损伤 ,这说明土霉素可能有较
强的基因毒性. 有报道表明 ,土霉素在环境中较难降
解并可蓄积[13 ] . 实际上 ,土霉素在不同类型的土壤
中均有较强的吸附 ,在粪中的吸附能力也很强[9 ] .
土霉素在厌氧条件下 ,半衰期为 9 d ,而在表面沉积
0111　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
物中半衰期长达 30～142 d[20 ] . 因此 ,作为一种因其
副作用而长期受到关注的抗生素 ———土霉素的使用
应当受到严格的监控.
315 　单细胞凝胶电泳技术的应用
土壤生物对土壤生态学的发展有着巨大的影
响[17 ] .近几年来 ,国内外有关土壤无脊椎动物生物
标志物在污染生态和毒理学的研究及应用方面的报
道有所增加 ,涉及多种方法和生物材料[4 ,5 ,16 ,23 ] . 综
合而言 ,在实验室工作中 ,蚯蚓往往作为首选动物用
于污染物的毒理学研究[15 ] .
用蚯蚓体腔细胞来做单细胞凝胶电泳试
验[21 ,22 ] ,是对彗星试验方法的发展和延伸 ,在国内
尚属少见. 本实验用单细胞凝胶电泳试验检测兽药
添加剂对蚯蚓体腔细胞 DNA 的损伤 ,旨在为环境
污染物的遗传毒性评估、环境质量的监测与评估提
供新的手段.
4 　结 　　语
　　兽药添加剂以其原形或代谢产物形式经畜禽粪
尿排出体外 ,沿不同的路径进入环境 ,在各种环境因
素的作用下 ,通过不同的方式发生转归[6 ] . 在土壤
环境中 ,兽药添加剂可在微生物的作用下降解 ,其降
解产物不仅影响不同的生物种群 ,而且通过不同生
物间的关系 ,影响生态系统. 因此 ,研究其降解产物
的毒性 ,具有更现实的意义.
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作者简介 　曲甍甍 ,女 ,1979 年生 ,在读硕士生. 主要从事环
境毒理学等方面的研究 ,发表论文 2 篇. E2mail : Tracy- slater
@126. com
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