全 文 ：阿维菌素 B1a对土壤微生物和蚯蚓的影响*
孙英健1, 2* * 刁晓平1 沈建忠1
( 1 中国农业大学,北京 100094; 2 北京农学院动物科学系, 北京 102206)
摘要 研究了不同阿维菌素 B1a浓度对 4 种土壤微生物生长和呼吸强度的影响及对土壤中蚯蚓的急性
毒性. 结果表明,土壤中阿维菌素 B1a浓度在 833 mg!kg- 1以上时对 4 种土壤细菌均表现出明显的抑制作
用,但对土壤真菌不表现抑制作用.高浓度阿维菌素 B1a对土壤微生物的呼吸强度有抑制作用, 并且在不同
土壤其作用有差异. 采用滤纸接触试验和人工土壤试验测定阿维菌素对蚯蚓的急性毒性 (半数致死量,
LD50) ,接触毒性 LD50为463g!cm- 2, 土壤法试验测定的 LD50在处理后第7 d和第 14 d分别为 24 13 和
1706 mg!kg- 1.
关键词 阿维菌素 B1a 土壤微生物 蚯蚓 急性毒性
文章编号 1001- 9332( 2005) 11- 2140- 04 中图分类号 Q935 文献标识码 A
Effects of avermectin B1a on soil microorganism and earthworm( Eisenia f etida) . SUN Ying jian
1, 2, DIAO Xi
aoping1, SHEN Jianzhong1 ( 1China Agr icultural University , Beij ing 100094, China; 2Depar tment of A nimal
Science, Beij ing Agricultural College, Beij ing 102206, China) . Chin. J . A pp l . Ecol . , 2005, 16( 11) : 2140~
2143.
Avermectins are the pesticides widely applied in agriculture. T his paper studied the effects of differ ent concentra
tion avermect in B1a( AVM B1a) on soil bacteria and fung i, soil respiration, and soil earthworm( Eisenia f etida) .
The r esults show ed that in 4 test so ils, bacteria were significantly inhibited w hen the AVM B1a concentr ation was
higher than 833 mg!kg- 1, while fung i were less impaired. Soil r espiration was also inhibited by high concentra
tion AVM B1 a, which differed w ith soil ty pes. T he half let hal dosage( LD50) of AVM B1a to soil earthworm was
estimated as 463 g! cm- 2 in filter paper contact test , and as 2413 and 17 06 mg!kg- 1, r espectiv ely after
treated 7 and 14 days in artificial soil.
Key words Avermectin B1a, Soil microorg anism, Eart hworm, Acute toxicit y.
* 国家自然科学基金重点资助项目( 30130140) .
* * 通讯联系人.
2004- 09- 10收稿, 2005- 06- 22接受.
1 引 言
近年来, 随着化学药品在农业生态系统中的大
量使用,土地污染问题日益严重. 兽药如抗菌药物、
抗寄生虫类药物和动物生长促进剂等多用于保障和
提高动物的健康状况. 兽药是具有生物活性的化学
物质,大量使用时,不仅会引发兽药在动物性食品中
的残留问题,而且药物还将通过动物的排泄物进入
土壤环境,而其杀灭有害生物如细菌、病毒或寄生虫
的作用显然对环境中的生物具有潜在的危害, 并且
也可能对环境中的非靶标动物构成危害, 如对土壤
或粪便中的生物[ 1, 3, 6] .国际上关于兽药对土壤中生
物种群的生态毒理学的研究较少[ 12] ,我国在这一领
域中的研究几乎为空白.
阿维菌素类药物( avermectins, AVM s)是由放线
菌( Strep tomyces avermit il is)产生的一组大环内酯
类抗生素,包含有结构相似的 8种天然成分, 其中部
分已经商品化. 其杀虫机理是,通过阻断虫体神经元
之间及节肢动物神经末梢和肌细胞间的神经冲动传
导,使虫体麻痹而死[ 11] . 阿维菌素( AVM )作为抗寄
生虫药物,其优异的驱虫性和较高的安全性使之成
为在全世界应用极为广泛的抗寄生虫药物和农
药[ 14] . AVM 作为兽药, 无论以何种形式给药, 大部
分的药物都通过动物粪便以原型排出体外[ 11] , 排入
环境中的 AVM,仍具有生物活性, 对环境中的土壤
微生物和蚯蚓以及水生生物都会产生影响[ 9] . 因
此,AVM 对生态环境尤其是土壤生态系统将产生
何种影响令人关注. 土壤微生物的种类和数量是土
壤肥力的重要指标.土壤微生物不仅参与土壤中 C
和 N 的循环,还为土壤中的无脊椎动物(如蚯蚓)提
供营养. 研究农药对土壤微生物的影响已成为评价
农药对环境安全性的指标[ 13, 16~ 18, 21, 22] . 土壤中蚯
蚓的活动性也直接影响土壤的结构及营养状况, 而
且蚯蚓对某些污染物比其他土壤动物更为敏感. 对
蚯蚓的生态检测与毒理研究,既可以反映土壤污染
应 用 生 态 学 报 2005 年 11 月 第 16 卷 第 11 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Nov . 2005, 16( 11)∀2140~ 2143
状况,又能鉴定各种有害物质的毒性[ 7, 16, 17] .因此,
土壤微生物和蚯蚓之间的相互作用在土壤生态系统
中起着极其重要的作用.研究 AVM 对土壤微生物
和蚯蚓的影响, 对防治环境污染、保护生态环境, 特
别是保护耕作农业土壤生态环境, 具有重要意义.
2 材料与方法
21 供试材料
供试土壤采自南京、成都、武汉及长春, 取自表层 10 cm
下的土壤,按常规方法对样品进行处理和基本理化性质的测
定[ 4] (表 1~ 表 2) . 蚯蚓 ( Eisenia f etida) 取自中国农业大学
饲养场,取个体体重在 300~ 600 mg、环带明显、2 月龄以上
的成熟蚯蚓为试验用蚯蚓.土壤法试验前先将蚯蚓置于人工
土壤中饲养 24 h,滤纸法试验前先将蚯蚓在湿润的滤纸上清
肠 2 h.供试样品阿维菌素原料药中 B1a含量为 92% (有效成
分含量> 98% ) (中农大生物技术股份有限公司) .
细菌培养基为普通营养琼脂培养基,真菌培养基为马丁
( martin)孟加拉红链霉素真菌培养基; 人工土壤组成为石英
砂 69% ,高岭土 20% , 草炭土 10% , 碳酸钙 10% , pH 6 0 #
05.
22 试验方法
221 AVM B1a对土壤中微生物呼吸强度的影响试验 先
将供试土壤置于 28 # 1 ∃ 恒温培养箱中培养 24 h,以恢复土
壤微生物的活性,备用. 取 500 ml 广口瓶, 每瓶装氢氧化钠
溶液 20 ml,称取新鲜土壤若干份, 每份 20 g ,其中 1 份加入
硫酸链霉素 2 万单位, 1 份不加任何抗生素,其它则加入 25、
50 和 100 mg 的 AVM B1a,每个处理 2~ 3 次重复.以不加土
样的广口瓶作为对照, 置于 28 # 1 ∃ 恒温培养箱中培养 24
h, 用盐酸滴定,记录所消耗的盐酸量. 按消耗 1 ml NaOH 相
当于 2 2 mg CO2, 计算土壤的总呼吸作用以及土壤真菌呼
吸的 CO 2释放量.
222 AVM B1a对土壤微生物抑制作用的测定 选取未经
处理的供试土壤 1 ml稀释液中的细菌菌落数在 100~ 300
个、真菌菌落数在 10~ 50 个范围的稀释度为实验土壤稀释
液浓度.根据实验结果, 选用 10- 4为细菌试验各土壤稀释液
浓度, 10- 3为真菌试验各土壤稀释液浓度. 设定土壤试验所
用的药物浓度分别为 ( mg!kg- 1土壤) : 2 500、1 250、625、
3125、156 及 78. AVM B1 a加 1 ml吐温 20 助溶,每个稀释度
设 3 个重复,以无菌水和非添加药物的土壤稀释液作为空白
对照.向每个平皿加入 05 ml土壤稀释液、13 5 ml细菌培
养基或真菌培养基、1 ml药物稀释液, 每皿共 15 ml. 置于 28
# 1 ∃ 恒温箱中培养, 分别于培养 24 和 48 h 记录细菌菌落
数,同时分别培养 48、72 和 96 h,记录真菌菌落数, 与药物空
白对照相比较,计算出药物对细菌和真菌的平均抑制率.
223 AVM B1a对蚯蚓的急性毒性测定 1)土壤法: 将AVM
B1a的丙酮溶液与少量石英砂混合, 待丙酮彻底挥发完全后,
再将此石英砂与人工土壤充分混匀, 配制浓度分别为 50、
2973、1768、10 51 和 6 25 mg!kg - 1的人工土壤, 每个浓度
设 4 个重复.记录蚯蚓的生理状况和毒性反应, 采用寇氏法
计算 7 和 14 d 的半数致死量( LD50) . 2)滤纸法: 取 1 ml不同
浓度的 AVM B1a丙酮溶液,使 AVM B1a在试管内壁滤纸上的
浓度依次为 10、681、4 64、3 16、215、1 46 和 1 g!cm- 2,
静置, 使丙酮挥发至干.记录 24 和 48 h 的死亡数,计算 48 h
半数致死量.
3 结果与分析
31 供试土壤的理化性质
众所周知,不同地区土壤微生物的种类和数量
各不相同,土壤微生物对土壤中残留的抗菌素的敏
感性、耐受性也有很大的地区差别.本实验所用的土
壤分别来自我国的长春、成都、武汉和南京 4个不同
的地方,具有一定的区域代表性. 经土壤颗粒度分
析,长春和成都土壤质地类型分别为壤土、砂壤土,
长春土中 1~ 005 mm 颗粒为 4943% , 小于 001
mm 颗粒为 1961% ;成都土中 1~ 005 mm 颗粒为
1742% ,小于 001 mm 颗粒为 2108% ; 武汉和南
京土壤都属于轻粘土其 1~ 005 mm 颗粒分别为
1745% 和 2469% , 小于 001 mm 颗粒分别为
4076%和 4343%. 在这 4 个地区的土壤中, 以长
春土壤中有机质含量最高, 为 6136 g!kg- 1, 速效
磷含量为 3365 mg!g- 1; 成都土次之,有机质含量
为 2949 g!kg- 1, 速效磷含量为 1806 mg!g- 1; 南
京土再次, 有机质含量为 2217 g!kg- 1, 速效磷含
量为 046 mg!g- 1; 武汉土有机质含量为 716 g!
kg- 1,速效磷含量为 153 mg!g- 1.
32 AVM B1a对土壤微生物的影响
经微生物测试发现,采自不同地区的土壤样品
细菌数量均远大于真菌数量(表 1) .通过土壤菌落
计数发现,在试验浓度下 AVM B1a对土壤细菌表现
出一定的抑制作用, 但这一效应在不同地区土壤的
表现不尽相同(表 2) .给药 24 h后, AVM B1a对成都
土壤细菌抑制率最低, 但低于 417 mg!kg- 1浓度
时,对成都土壤细菌便无抑制作用,而此浓度对其他
地区的土壤细菌抑制率仍达到 30%以上.给药 48 h
后,AVM B1a对南京土壤细菌表现出最大抑制, 在最
低浓度 52 mg!kg- 1下, 对南京土壤细菌抑制率达
551% ,而对其他地区的土壤微生物则基本不表现
出抑制作用; 104 mg!kg- 1浓度时, 对各地土壤微
生物都表现出不同的抑制作用, 对南京土壤细菌的
抑制率最高为 655%,长春土次之,为 453%, 对成
都和武汉土壤微生物的抑制率也都在 10%以上.当
214111 期 孙英健等: 阿维菌素 B1 a对土壤微生物和蚯蚓的影响
土壤中药物浓度在 833 mg!kg - 1时,对 4种土壤细
菌的 48 h 抑制率都在 40%以上. 与未染毒土壤相
比,染毒 AVM B1a的土壤真菌数有所增加(表 1, 表
3) ,但各药物浓度间差异不显著. 结果表明, 在试验
浓度下, AVM B1a对真菌无抑制作用.
表 1 未添加药物的各对照土壤细菌与真菌的菌落数
Table 1 Colony numbers of bacterial and fungus in control soil samples
时间
Time( h)
成都Chengdu
细菌
Bacteria
( % 106)
真菌
Fungi
( % 104)
南京 Nanjing
细菌
Bacteria
( % 106)
真菌
Fungi
( % 104)
武汉Wuhan
细菌
Bacteria
( % 106)
真菌
Fungi
( % 103)
长春 Changchun
细菌
Bacteria
( % 1 06)
真菌
Fungi
( % 103)
2 4 1 78 - 0 54 - 0 25 - 0 53 -
4 8 3 22 0 63 2 24 0 63 3 92 48 2 58 43
7 2 - 1 83 - 2 9 - 48 - 7
9 6 - 2 43 - 3 3 - 48 - 77
表 2 AVM B1a对不同地区土壤细菌生长的影响(抑制率%)
Table 2 Result of AVM B1a cause the inhibition of bacteria in soil sam
ples( inhibi tion ratio %)
AVM 浓度
AVM concent ra
tion( mg!kg - 1)
成都
Chendu
24 h 48 h
南京
Nanjing
24 h 48 h
武汉
Wuhan
24 h 48 h
长春
Changchun
24 h 48 h
1667 294 441 495 636 52 7 59 5 534 585
833 194 412 477 638 37 4 52 1 541 603
417 0 106 441 611 29 4 45 1 353 568
208 0 112 283 643 15 6 35 4 504 537
104 0 125 546 655 0 07 20 1 485 453
52 0 004 176 551 0 0 04 0 0
* AVM 浓度为平皿中药物浓度 AVM concentrations in petr i dish. 下同 T he
same below
表 3 AVM B1a对不同地区土壤真菌生长的影响(真菌菌落数( 103)
Table 3 Result of fungus grow in soil samples contaminated by AVM
B1a( numbers of fungus colony( 10
3) )
AVM浓度*
AVM concentrat ion
( mg!kg- 1)
成都
Chengdu
48 h 72 h 96 h
南京
Nanjing
48 h 72 h 96 h
武汉
Wuhan
48 h 72 h 96 h
长春
Changchun
48 h 72 h 96 h
1667 107 273 333 163 27 303 0 27 37 93 16 173
833 147 237 284 11 21 223 4 6 63 13 15 17
417 15 25 283 153 223 233 17 23 23 10 18 187
208 117 213 286 97 22 24 27 5 56 9 13 15
104 143 243 263 147 227 23 5 63 66 9 107 107
52 167 31 363 123 25 283 03 06 06 127 14 153
33 AVM B1a对土壤微生物呼吸强度的影响
AVM B1a 24 h 内对土壤微生物呼吸强度的影
响试验结果见表 4.结果表明, 在空白土壤中土壤微
生物的总呼吸强度以成都土最高. 在试验浓度下, 除
长春土外,成都土、南京土、武汉土均表现出呼吸强
度下降,且差异显著( F (3, 8)成都 = 111; F (3, 8)南京 =
542; F ( 3, 8)武汉 = 596, P( 3, 8; 001) = 7591) . 长春土
各浓度的呼吸强度虽然高于其总呼吸强度, 但差异
不显著 F( 2, 5) = 485, P( 2, 5; 0 05) = 5786 ) . 这说明
AVM B1a在试验浓度下对不同土壤微生物有抑制作
用.链霉素对照组土壤部分细菌被抑制. 试验各浓
度组与链霉素对照组相比,南京、长春土与链霉素对
照组的土壤真菌呼吸强度差异显著 ( F ( 3, 8)南京 =
265, P (3, 8; 001) = 7591; F( 2, 5)长春 = 1410,
P ( 2, 5; 0 01) = 13274) ,而在试验浓度下长春土壤的
呼吸强度还高于其链霉素对照组, 说明在实验浓度
下药物对长春土壤微生物的抑制作用弱; 其它各组
土与链霉素对照差异均不显著. 以上结果说明,
AVM B1a对土壤真菌不具有明显的抑制作用.
表 4 不同土壤微生物的平均呼吸强度( mgCO2!100 g- 1土)
Table 4 Mean respiration of microbe in four soi l samples( mg CO2!100
g- 1 soil )
样品采集地
Sampling area
土壤中药物浓度( mg!kg- 1)
Concentration of AVM B1a in soil
1 250 2 500 5 000
链霉素对照
Streptomycin control
( 2 % 105 IU)
总呼吸强度
Total soil
respiration
长春 Changchun - 27 68a 27 25a 23 69b 25 69a
成都 Chengdu 2509 a 24 42a 23 52a 23 41a 25 65b
武汉Wuhan 1098 a 13 33a 11 87a 12 66a 16 69b
南京N anjing 131 a 13 89a 13 78a 19 94c 21 95b
同一行中字母不相同者差异显著 Letter were not same mean difference w as remarkable
34 AVM B1a对蚯蚓的急性毒性试验
用人工土壤法测定 AVM B1a在第 7 d和第 14 d
蚯蚓的 LD50分别为 2413 和 1706 mg!kg- 1, 95%
可信限分别为 1734~ 2667和 1504~ 1890 mg!
kg
- 1
;滤纸法测定的 48 h 蚯蚓 LD50为 463 g!
cm
- 2
, 95%可信限为 36~ 59 g!cm- 2.
试验中蚯蚓的中毒症状表现为:蚯蚓个体活动
性下降,个体较为安静, 不钻土, 有些蚯蚓身体断裂
为 2节,环节松散,身体变长,分泌出黄色的体腔液,
死亡的蚯蚓还表现出身体的自溶现象等等.
4 讨 论
通过试验发现, AVM B1a对各地区的土壤微生
物的毒性表现各不相同. 土壤呼吸强度试验和平皿
法试验的差异性表现可能与土壤对药物的作用有
关.当药物在土壤中时对土壤微生物的毒性较平皿
法试验的毒性低, 而不表现出呼吸强度抑制的长春
土较其他 3种土壤的营养成分含量高; 当药物较少
受土壤影响时,土壤所表现出的毒性则较高,平皿中
AVM B1a浓度在 104 mg!kg- 1以上时对南京和长
春土壤微生物的抑制作用较强, 而对武汉和成都土
壤微生物的抑制作用较小. 由表 1可见,武汉和成都
土壤的营养成分含量相对较低. 这一结果表明, 土壤
营养成分对AVM B1a的毒性有影响,但需要进一步
研究. AVM B1a对土壤真菌基本不表现抑制作用.本
研究与张跃华等[ 20]的研究结果有些差异,可能与试
验用土壤不同有关.
通过蚯蚓的急性毒性试验发现, AVM B1a对蚯
蚓具有毒性.经土壤测试法研究表明,蚯蚓经土壤食
入 AVM B1a的急性毒性与Halley 等[ 6]报道的 AVM
2142 应 用 生 态 学 报 16 卷
对蚯蚓急性毒性的结果相似, 但用滤纸法所测得的
AVM B1a皮肤接触急性毒性比土壤食入毒性大. 这
也可能与土壤有关. 由于 AVM 在土壤中缺乏流动
性[ 8] ,当 AVM B1a进入土壤后可能与土壤中的某些
物质结合,使药效不能完全释放,而通过皮肤直接接
触而吸收的 AVM B1a则相对较多.这与 AVM B1a对
平皿中微生物的影响和对土壤微生物的影响的差异
是相似的.上述结果进一步提示,土壤本身的营养成
分可能影响 AVM B1a对土壤生物的毒性.在实验中
我们还发现,即使存活下来的蚯蚓它的活动性也已
大大下降了,这说明 AVM B1a在低浓度时对蚯蚓也
有毒性. M iyazaki等[ 15]报道的化学物质 chlorophe
nols和农药吡虫啉( imidacloprid)对蚯蚓体内 AChE
和超氧化物歧化酶( SOD)具有明显的抑制作用. 随
着蚯蚓暴露于土壤中的药物浓度的不同, 蚯蚓精子
的畸形率也显著升高[ 20] , 而且蚯蚓对土壤中的重金
属具有富集能力[ 5] .结果表明, 蚯蚓直接接触 AVM
B1a时所表现出的毒性反应是明显的. 然而, 当蚯蚓
暴露于含有一定浓度的 AVM B1a的土壤中时, 是否
也会出现类似 chlorophenols和 Imidacloprid 的潜在
毒性作用, 以及是否会对 AVM 产生富集作用, 值得
进一步研究.
目前 AVM 在世界范围内被广泛使用. Charles
等[ 2]统计表明,巴西农场有 662%的农场主由于各
种原因打乱了药物的使用方式, 这将直接导致环境
中的药物数量和种类增加.有报道称,干燥的动物粪
便中伊维菌素( IVM )含量可达 185 mg!kg - 1[ 10] ,
特别是在牧场周围的环境中, 由于动物粪便未经无
害化处理,或经简单的堆肥处理,作为抗寄生虫药和
农药使用的 AVM 在环境中的存储量无法进行准确
计算.但从以上结果可以预测,在牧场周围环境土壤
中的浓度会使土壤微生物和蚯蚓受到影响, 从而影
响当地陆地生态系统. 这将不利于维持土壤有机质
成分的平衡,也不利于对土壤生态环境的保护.
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作者简介 孙英健, 女, 1970 年生, 硕士, 讲师. 主要从事动
物性食品卫生学和药理学的教学和科研工作, 发表论文 7
篇. Email: yisun51@ bac. edu. cn
214311 期 孙英健等: 阿维菌素 B1 a对土壤微生物和蚯蚓的影响