全 文 ：用于分子生态学研究的土壤微生物 D NA 提取方法 3
张于光1 ,2 　李迪强1 3 3 　王慧敏2 　肖启明2
(1 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 ,北京 100091 ;2 湖南农业大学生物安全科技学院 ,长沙 410128)
【摘要】　利用 SDS高盐法和变性剂加 SDS高盐法对土壤微生物总 DNA 进行了提取 ,然后通过电泳加树
脂柱回收和连续 2 次树脂柱回收方法进行了纯化. 结果表明 ,变性剂加 SDS 高盐法的 DNA 提取效率明显
高于前者 ,电泳加树脂柱法的纯化效果更好. 通过 PCR 扩增表明 ,经过纯化后的 DNA ,都可以进行
16SrDNA 扩增和 ni r K、nosZ、nif H 等功能基因的扩增. 因此 ,变性剂加 SDS 高盐法是一种更为高效、可靠
且适合于环境微生物分子生态学研究的 DNA 提取方法.
关键词 　分子生态学 　土壤微生物 　DNA 提取
文章编号 　1001 - 9332 (2005) 05 - 0956 - 05 　中图分类号 　S15414 　文献标识码 　A
Extraction method of soil microbial DNA for molecular ecology study. ZHAN G Yuguang1 ,2 , L I Diqiang1 ,
WAN G Huimin2 ,XIAO Qiming2 (1 Institute of Forest ry Ecology , Envi ronment and Protection , Chinese Acade2
my of Forest ry , Beijing 100091 , China ;2 College of Biosaf ety Science and Technology , Hunan A gricultural U2
niversity , Changsha 410128 , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2005 ,16 (5) :956～960.
In environmental microbiology ,molecular ecology study has been widely concerned in the world ,while high quali2
ty DNA is the basis of the study. In our study ,soil microbial DNA was extracted by the methods of SDS lysis and
denaturant plus SDS lysis ,and purified with gel electrophoresis plus minicolumn and double minicolumn methods.
The results showed that denaturant plus SDS lysis could extract DNA more efficiently ,and gel electrophoresis
plus minicolumn could help to obtain purer DNA that was available in amplifying its 16S rDNA and functional
genes by PCR. Therefore ,denaturant plus SDS lysis could be an efficient and reliable method to extract DNA in
molecular ecology studies.
Key words 　Molecular ecology , Soil microorganism , DNA extraction.
3 国家“十五”科技攻关项目 (2001BA510B10) 和国家林业局重点资
助项目.3 3 通讯联系人.
2004 - 02 - 24 收稿 ,2004 - 07 - 02 接受.
1 　引 　　言
土壤中仅有 1 %的微生物可用于培养 ,还有相
当多的菌种因为无法培养而未被人类所认识 ,而它
们所包含的大量遗传信息是一笔无法估量的财
富[2 ] .因此 ,从自然环境中直接分离微生物 DNA 对
不能培养细菌的检测[8 ,25 ] 、某些目标菌株的跟踪或
重组基因在自然条件下的行为[7 ,19 ] ,以及揭示微生
物的分子多态性和在微生态中的变化[22 ]都具有重
要的意义. 微生物分子生态学是通过分析样品中
DNA 分子的种类、数量和多态性等基因组信息来反
映环境微生物的种类、种群数量和群落变化等信息
的分支学科[5 ] . 分子生态学研究始于 20 世纪 90 年
代初 ,目前已经成为生态学科中最有活力的领域之
一[21 ,27 ,30 ,31 ] .
建立高效、可靠的微生物总 DNA 提取方法是
进行微生物分子生态学研究的基础 ,目前已成为国
内外研究者关注的热点. 自 20 世纪 70 年代 ,研究者
就开始关注环境微生物总 DNA 的提取[7 ] ,近年来 ,
已发展了包括物理、化学等多种提取方法 ,主要可分
为细胞提取法[11 ,19 ,20 ,28 ]和直接溶解法[4 ,17 ,23 ,24 ,32 ] .
由于在土壤中存在的腐殖物质等容易干扰 DNA 的
检测 ,这些污染可能抑制 PCR 中的 TaqDNA 聚合酶
的活性[18 ] 、干扰限制性内切酶的消化[16 ] 、降低转化
效率[25 ]和 DNA 的杂交特异性[18 ]等 ,所以 DNA 的
纯化是获取高纯度微生物总 DNA 的关键步骤. 细
胞提取法虽然可以得到纯度较高的 DNA ,但是提取
效率较低[11 ,20 ] ,而常用的直接溶解法却在纯度上较
难达到要求[4 ] . 本文在直接溶解法的基础上 ,探讨
了在土壤微生物中提取和纯化总 DNA 的方法 ,旨
在建立一种高效、可靠和适合于微生物分子生态学
研究的 DNA 提取和纯化方法.
2 　材料与方法
211 　土壤的采集
于青海省三江源地区采集 4 个土壤样品 ,将大约 100 g
的土壤装入灭菌封口聚乙烯袋 ,低温保存. 采样地点和土壤
部分性质见表 1.
应 用 生 态 学 报 　2005 年 5 月 　第 16 卷 　第 5 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,May 2005 ,16 (5)∶956～960
表 1 　土壤样品的位置和部分土壤性质
Table 1 Sample locations and properties of soils used in DNA extraction
样品
Sample No.
经纬度
Latitude ,longitude
海拔
Altitude (m)
植被类型
Plant type
%N %C
S1 32°49′875″N ,97°07′795″W 3 907 草　原 Grassland 01474 1178
S2 33°49′176″N ,95°29′399″W 4 266 草甸草原 Prairie and grassland 01554 2192
S3 34°07′598″N ,94°13′345″W 4 612 草　甸 Prairie 01464 2143
S4 34°03′707″N ,94°45′258″W 4 777 高寒草甸 Alpine prairie 01420 2198
212 　DNA 提取方法
21211 SDS高盐法 (方案 1) 　参照 Zhou 等方法[32 ] ,并进行
适当修改. 具体步骤 :称取 5 g 土壤 ,放入研钵中 ,倒入适量
的液氮 ,立即研磨 ;再倒入适量的液氮 ,研磨 ,重复 3 次 ,使土
壤颗粒研成粉末 ;将 1315 ml 提取缓冲液 (011 mol·L - 1磷酸
盐 [p H = 810 ] ,011 mol·L - 1 EDTA [p H 810 ] ,011 mol·L - 1
Tris2HCl [p H 810 ] ,115 mol·L - 1 NaCl ,110 % CTAB)和 50μl
蛋白酶 K(10 g·L - 1) 与 5 g 土壤置于 50 ml 的离心管中 ,放
入 37 ℃恒温摇床上 ,225 r·min - 1振荡 30 min ;加入 115 ml
20 % SDS ,轻轻混匀 ,65 ℃水浴加热 2 h ,每隔 15～30 min 轻
轻摇匀 1 次 ;5 000 r·min - 1离心 10 min ,将上清液转入新的
50 ml 离心管中 ;取 415 ml 提取缓冲液加入原离心管 ,摇匀
泥浆 ,加入 015 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴 15 min ,用上述同样
的离心速度离心 10 min ,将上清液与原上清液合并 ;再重复
此步骤 1 次 ;用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀 ,5
000 r·min - 1离心 20 min ;收集上清液 ,并加入 016 倍体积的
异丙醇 ,室温静置 1 h ;25 ℃下 12 000 r·min - 1离心 20 min ,
倒出上清液 ,干燥后加入 500μl 去离子水 ,溶解粘附于离心
管壁的 DNA 及其杂质 ,并收集于 115 ml 的微型离心管中.
21212 变性剂加 SDS高盐法 (方案 2) 　参照 Richard 等[17 ]的
方法 ,并进行适当修改. 取 2 g 土样和等量的灭菌石英砂在
研钵中混合 ,加入 1 ml 变性剂 (4 mol·L - 1异硫青酸胍 ,10
mmol·L - 1 Tris2HCl [p H 710 ] ,1 mmol·L - 1 EDTA[p H 810 ] ,
015 % 22巯基乙醇) ;液氮冰冻 ,研磨至溶解 ,重复 3 次 ;转入
50 ml 离心管中 ,加入 9 ml 提取缓冲液 (011 mol·L - 1磷酸钠
[p H 710 ] , Tris2HCl [ p H 710 ] , 011 mol ·L - 1 EDTA [ p H
810 ] ,115 mol·L - 1 NaCl ,1 %CTAB ,2 %SDS) ;65 ℃水浴 1 h ,
每 10 min 轻轻混匀 1 次 ; 5 000 r·min - 1离心 10 min ,取上
清 ;在原管中加入 5 ml 提取缓冲液 ,混合后 ,65 ℃水浴 10
min ,离心 ,取上清 ,合入上述上清液 ;重复一次 ;加入等体积
的氯仿混合 ,5 000 r·min - 1离心 20 min ,取上清 ;加入 016 倍
体积的异丙醇 ,室温沉淀 1 h ;20～25 ℃,12 000 r·min - 1离
心 20 min , TE溶解沉淀.
213 　DNA 的纯化
1)电泳加树脂柱纯化 : 40 V 电压下 018 %琼脂糖电泳
12 h ; 在 紫 外 灯 下 切 割 目 标 带 ; 用 试 剂 盒 ( Bio Basic
Inc1Canda)回收 ;电泳同时使用标准的λDNA/ Hind Ⅲ作为标
准 ,用凝胶分析软件 Labwork (31012 版本)进行定量分析. 2)
2 次树脂柱纯化 :按照说明 ,用试剂盒 (Bio Basic Inc1Canda)
两次直接树脂柱纯化 DNA 提取液.
214 　DNA 的纯度和定量检测
用紫外分光光度计测量纯化后的 DNA 溶液在波长为
230 nm、260 nm、280 nm 下的 OD 值.
215 　DNA 的 PCR 检测
为了检测 DNA 的纯化质量 ,对纯化后的 DNA 进行
PCR 扩增检测. 用于扩增的引物等条件见表 2.
3 　结果与分析
311 　DNA 的提取
通过两种不同方案 ,分别对 4 个土壤样品进行
了 DNA 提取. 不同方案提取的 DNA 质量都较好
(图 1) ,其 DNA 片断都大于 23 kb ,但是 DNA 产量
明显不同 (表 3) ,方案 2 的产量明显高于方案 1. 因
此 ,两种方案提取的 DNA 在分子大小上可用于分
子生态学分析.
312 　DNA 的纯化效果
使用两种不同方法对初提 DNA 溶液进行纯
化 ,并且检测了纯化后的 OD230 、OD260和 OD280 值
(表 3 和表 4) . 结果表明 ,凝胶电泳加树脂柱方法回
收率 ( > 60 %)高于 2 次树脂柱的回收率 ( < 60 %) .
表 2 　成功用于土壤微生物 DNA扩增的引物
Table 2 Primers from successful amplif ication used to microbial DNA from soil
扩增目的基因
Target genes for amplification
引物序列
Primer sequences
起始序列
Derivation sequence
参考文献
Reference
16S rDNA 5′2AGAGTTTGATCCTGGCTCAG23′
5′2ACGGTTACCTTGTTACGACTT23′ N82N27N14872N1507 26
固氮酶基因 ( nif H)
Nitrogenase reductase gene
5′2AAAGG(CT) GG(AT) ATCGG(CT) AA(AG) TCCACCAC23′
5′2TTGTT( GC) GC(CG) GC(AG) TACAT( GC) GCCATCAT23′ N342N59N4662N491 3
亚硝酸还原酶基因 ( ni r K)
Nitrite reductase gene
5′2GG(AC) ATGGT( GT) CC(CG) TGGCA23′
5′2GCCTCGATCAG(AG) TT(AG) TGG23′ N5262542N102321040 6
亚硝酸还原酶基因 ( ni rS )
Nitrite reductase gene
5′2CCTA(CT) TGGCCGCC(AG) CA(AG) T23′
5′2CGTTGAACTT(AG) CCGGT23′ N7632780N163821653 6
三价氮氧化还原酶基因 ( nosZ)
Nitrous oxide reductase gene
5′2CG(CT) TGTTC(AC) TCGACAGCCAG23′
5′2CATGTGCAG(ACGT) GC(AG) TGGCAGAA23′ N12112N1230N18972N1917 3
7595 期 　　　　　　　　　　　张于光等 :用于分子生态学研究的土壤微生物 DNA 提取方法 　　　　　　　　　　　
图 1 　不同方案提取总 DNA 的电泳结果
Fig. 1 Electrophoresis result of total DNA using different methods.
M :λDNA/ Hind Ⅲ,1 ,2 ,3 and 4 ; 5 ,6 ,7 and 8 were the result of S1 ,
S2 ,S3 and S4 using method 1 and method 2 ,respectively.
同时 ,电泳加树脂柱纯化后的 OD260/ 230和 OD260/ 280
比值比 2 次树脂柱纯化的比值高 ,所以 ,电泳加树脂
柱纯化后的 DNA 纯度更高. 但是 ,2 次树脂柱法回
收较快 ,1 h 可以处理 3～4 个样品.
313 　PCR 扩增结果
应用不同引物对土壤微生物 DNA 纯化质量进
行检测. 用不同的模板量检测了 16S rDNA 的扩增
效果 (图 2) ,结果表明 ,1 ng 的模板量就可以扩增出
目标产物 ,随着模板量的增加 ,PCR 产量增加. 两种
方法纯化 DNA 初提液后 ,均可以得到较好的 PCR
扩增产物 ,如图 3～5. 因此 ,经 2 种方法纯化后的土
壤微生物总 DNA 适合进行分子生态学研究.
表 3 　凝胶电泳加树脂柱对 4 个样品的 DNA纯化效率
Table 3 DNA recovered yield of 4 samples in gel electrophoresis plus minicolumn
样品
Sample
初始 DNA 提取量
Crude DNA yield (μg·g - 1DW soil)
Method 1 Method 2
纯化后 DNA 产量
Final DNA yield (μg·g - 1 DW soil)
Method 1 Method 2
纯化率
Crude DNA recovered( %)
Method 1 Method 2
S1 12134 ±1141 34145 ±3134 9126 ±2112 24180 ±1104 75 72
S2 8134 ±2130 23123 ±1124 5192 ±1179 18158 ±0187 71 80
S3 7187 ±1179 16134 ±2137 5112 ±1156 11144 ±2109 65 70
S4 6184 ±3128 12118 ±1165 4165 ±2173 7131 ±3135 68 60
表 4 　不同纯化方法的纯化效果
Table 4 Purif ied effect of different methods
纯化方法
Purified
method
凝胶电泳加树脂柱
Gel plus minicolumn
OD260/ 230 OD260/ 280
2 次树脂柱
Minicolumn plus minicolumn
OD260/ 230 OD260/ 280
2 次树脂柱后的回收率
Crude DNA recovered
( %)
Method 1 1111 ±0103 1144 ±0104 0195 ±0102 1120 ±0103 54
Method 2 1128 ±0103 1162 ±0103 1112 ±0103 1134 ±0105 50
859　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
4 　讨 　　论
从土壤微生物群体基因组的角度研究土壤微生
物的多样性及其功能是一种可行的方法 ,近年来已
经成为国内外研究的热点[1 ,9 ,12 ,14 ] . 目前 ,主要有两
种方法提取土壤微生物 DNA ,一是在土壤中直接裂
解微生物 ,再提取 DNA ;另一种是先将微生物菌体
与土壤颗粒分开 ,再提取 DNA. 一般认为 ,第一种方
法的提取效率高. 本研究中采用的两种 DNA 提取
方案均属于第一种方法 ,两种方法得到的 DNA 量
都明显高于细胞提取法[19 ,20 ,28 ] . 第二种方案的提取
效率明显高于第一种方案 , 比 Zhou [32 ] 和 Lovell
等[10 ]的报道高 ,这可能是细胞溶解效率的差异以及
核酸酶降解后对核酸的保护作用 ;但是比 Richard
等[17 ]的报道要低 ,可能是由于样品的活性差异 ,因
为本研究的样品都来自高海拔、温度较低和营养条
件较差的青藏高原.
对土壤微生物进行分子生态学研究的关键是
DNA 的提取. 为了进行后续的分子生态学研究 ,直
接提取的土壤微生物 DNA 需要满足以下条件 :提
取的 DNA 分子应足够大 ,提取的 DNA 溶液中没有
抑制分子生态学试剂的成分. 本研究中提取的土壤
微生物 DNA 分子都大于 23 kb ,足可以进行后续研
究 ,而 Ogram[13 ]和 Picard 等[15 ]所用方法中的 DNA
都明显的片断化. 环境样品中提取 DNA 的同时总
是提取了腐殖物质的 DNA ,因而干扰了 DNA 的检
测和定量. 目前发展了不少修改的方法来去除 DNA
的杂质 ,都取得较好的效果[4 ,29 ] . 本研究采用电泳
加树脂柱和 2 次树脂柱 2 种纯化方法 ,纯化后 ,通过
测定其不同波长的 OD 值进行纯度检测. OD260/ 230
值越高 ,表明 DNA 越纯 ,而比值越低 ,表明有杂质
污染 ;同时 ,OD260/ 280的值越高 ,表明 DNA 越纯 ,反
之则有蛋白质污染. 从纯化结果可以看出 ,本研究采
用的两种纯化方法较 Yestes 等[29 ]的效果更好 ,而且
电泳加树脂柱法纯化的效果要比两次树脂柱法的效
果好 ;同时 ,变性剂加 SDS 高盐法提取的 DNA 纯化
效果比前者好.
灵敏度是分子生态学研究的关键. 本研究中 ,通
过 PCR 对土壤微生物中的最少可检测量进行了研
究. 结果表明 ,从 1 ng 的 DNA 量中可以得到目标
PCR 扩增产物 ,与已有结论相一致[2 ,32 ] .
5 　结 　　论
本研究建立了一种快速、高效的从土壤微生物
中直接提取 DNA 的方法. 该方法无需特殊仪器 ,整
个过程可在较短的时间内完成. 纯化后的 DNA 可
以用于 16S rDNA 和其它功能基因的 PCR 扩增 ,为
检测土壤微生物的群落结构、微生物的多样性和功
能微生物的代谢途径等提供了可行的方法.
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作者简介 　张于光 ,男 ,1976 年出生 ,博士生. 主要从事分子
生物学和土壤微生物生态学研究 ,发表论文 5 篇. Tel :0102
62889551 ; E2mail :yugzhang @sina. com. cn
致　读　者　·　作　者
　　《应用生态学报》系中国科学院沈阳应用生态研究所和中国生态学会主办的国内外公开发行的学术性期
刊 ,科学出版社出版. 国际标准刊号为 ISSN100129332. 专门刊载有关应用生态学 (主要包括森林生态学、农
业生态学、草地牧业生态学、渔业生态学、自然资源生态学、景观生态学、全球生态学、城市生态学、污染生态
学、化学生态学、生态工程学和恢复生态学等)的具有创新性的综合性论文、研究报告和研究简报等.
　　本刊创刊于 1990 年 ,现为月刊 ,采用国际标准开本 (210 mm ×285 mm) ,192 面 ,每期 43 万字. 本刊系中
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当高度 ,在国内外应用生态学界的影响日益扩大.《中国科学引文索引》、《中国生物学文摘》、美国《生物学文
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杂志》(РЖ)等数十种权威检索刊物均收录本刊的论文摘要 (中英文) .
　　据悉 ,您们正在从事有关生态与环境科学研究项目 (如国家基础科学人才培养基金项目、国家杰出青年
科学基金项目、国家自然科学基金重大和重点项目、国家攀登计划项目、国家“863”和“973”计划项目、国家重
点科技攻关项目、“百人计划”项目、“长江学者计划”项目和国际合作研究项目等) ,并有望取得重大研究成果
和产生一系列创新论文 ,本刊编辑同仁热切希望您及您的同行们充分利用这一科学园地 ,竭诚为您们提供优
质跟踪服务 ,本刊将及时发表您们的创新成果论文 (或以特刊、专刊及增刊等形式发表 ,或以专刊形式发表优
秀英文创新论文) . 我们相信这一承诺一定能得到您们的积极响应 ,愿我们迎着新世纪的曙光 ,为应用生态学
的发展协同奋进 !
　　我们的目的 :
　　　读者 ———广泛订阅这一优秀期刊
　　　作者 ———充分利用这一科学园地
　　　编者 ———精心编制这一信息精品
《应用生态学报》编辑部
069　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷