全 文 ：污染土壤的酶学修复研究进展 3
张丽莉1 ,2 　陈利军1 3 3 　刘桂芬3 　武志杰1
(1 中国科学院沈阳应用生态研究所 110016 ;2 中国科学院研究生院 ,北京 100039 ;3 黑龙江省大兴安岭林校 165004)
【摘要】　土壤酶在污染土壤的修复过程中起到非常重要的作用. 污染土壤的酶修复具有专性强、适应性
广、受环境因素影响较小等特点. 文中综述了土壤酶对污染土壤修复的优势 ,酶的固定化技术与方法、氧化
还原酶对污染物的去除机理 ;介绍了用于土壤修复的酶的来源及主要特征 ,并对今后的研究工作提出了几
点建议.
关键词 　土壤酶 　污染土壤 　修复
文章编号 　1001 - 9332 (2003) 12 - 2342 - 05 　中图分类号 　S154. 2 　文献标识码 　A
Advance in enzymological remediation of polluted soils. ZHAN G Lili1 ,2 ,CHEN Lijun1 ,L IU Guifen3 ,WU Zhi2
jie1 (1 Institute of A pplied Ecology , Chinese Academy of Sciences , S henyang 110016 , China ;2 Graduate School ,
Chinese Academy of Sciences , Beijing 100039 , China ;3 Forest ry School of Daxing’anling in Heilongjiang
Province , Daxing’anling 165004 , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2003 ,14 (12) :2342～2346.
Soils enzymes play an important role in the remediation of polluted soils. The enzymological remediation of pol2
luted soils has the characteristics of high specialization ,wide applicability ,and little sensitivity to the ambient fac2
tors. This paper reviewed the advantages of enzymological remediation of polluted soils ,the methods and tech2
nologies of enzyme immobilization ,and the removal mechanisms of pollutants by oxidoreductases. The sources
and characteristics of the enzymes used to remediation were also introduced ,and some suggestions about the re2
search in the future were put forward.
Key words 　Soil enzyme , Polluted soil , Enzymological remediation.
3 国家重点基础研究发展规划项目 ( G1999011808204)和中国科学院
沈阳应用生态所知识创新工程重大资助项目 (SCXZD0104202) .3 3 通讯联系人.
2003 - 03 - 04 收稿 ,2003 - 07 - 03 接受.
1 　引 　　言
在过去的 50 年里 ,环境尤其是土壤的污染已受到科学
界和大众的广泛关注. 工业生产释放的废物、现代交通运输
工具释放的废气以及有机农药、杀虫剂的使用等等 ,使土壤
圈大多被异生命体化合物污染并且大大超过了环境的自净
能力[2 ] . 土壤污染面临的严峻形势是一些毒性污染化合物很
难被降解. 例如多环芳烃 ( PAHS) 及氯苯类化合物等已被世
界普遍认为是危害比较大的污染物 [34 ] . 它们在土壤中累积
产生的直接的负面影响及通过各种转化、运移途径 (如食物
链)产生的间接负面影响是巨大的 [53 ] .
对污染土壤的修复和净化是目前重要的研究方向. 土壤
污染修复的传统方法有化学法 [8 ]和生物法[6 ] . 其中 ,生物修
复是近 30 年来兴起的 ,起源于有机污染土壤的治理. 陈玉
成[12 ]提到在 1972 年 ,美国宾夕法尼亚州的 Ambler 用生物
修复法清除管线泄漏的汽油. 但这时生物修复的应用范围仅
限于试验阶段 ,直到 1989 年美国阿拉斯加海域受到大面积
石油污染以后 ,才首次大规模应用生物修复技术 [12 ] . 在生物
修复中酶对土壤污染物的修复作用的优势更加明显. 其主要
机理是通过微生物源酶的作用分解转化土壤中的有机污染
物成为简单的无机物 ,以达到净化土壤的目的 [12 ] . 近年来 ,
微生物酶在环境净化及环境工程方面的应用日益受到重视 ,
其应用也在不断扩大. 酶修复的目的就是降解和转化土壤中
的污染物 ,使污染物的浓度降低到可接受的水平 ,或将有毒
有害的污染物转化为无害的物质 [60 ] . 利用酶对土壤中污染
物进行修复可以在一定程度上克服其它方法可操作性差、成
本较高、效果不理想等的弊端 [2 ,26 ] ,例如过氧化物酶、漆酶、
酪氨酸酶等对土壤中酚类化合物和芳香族化合物的降解就
很有效. 近些年来 ,酶对土壤污染物的去除和分解在污染土
壤中修复的作用得到越来越多的关注.
2 　污染土壤的酶修复
污染土壤的生物修复是当前世界相关研究的热点 . 研究
得最多的是通过接种外源微生物来降解土中的有机污染物
或降低和消除无机污染物的毒性 ,但因诸多原因而收效不
大 :1)接种微生物因土壤毒素或土著微生物而失活 ;2) 接种
微生物更多地是用土壤本源有机物 ,而不是污染物作为底
物 ;3)由于污染物在土中的非连续分布 ,接种微生物的趋向
运动常受到阻碍 ;4)接种微生物难与土著微生物竞争 [27 ] .
与污染土壤的微生物修复相比 ,酶修复具有如下优
点[47 ] :1) 酶对底物的转化具有专性 ; 2) 酶在不利于微生物
生长的土壤环境中仍具活性 ;3)酶通常不受噬菌者或某些微
生物代谢抑制剂的影响 ;4) 酶对微生物间的竞争不敏感 ;5)
应 用 生 态 学 报 　2003 年 12 月 　第 14 卷 　第 12 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Dec. 2003 ,14 (12)∶2342～2346
微生物对有机污染物的降解能力不及专性酶 ,因为前者在有
机污染物的浓度很低时可利用其它的碳源 [28 ] . 酶具有与无
机催化物不同的性质 (高底物亲合力 ,高催化能力)使其广泛
应用于生物和环境科学. 它们对底物高的亲合力在很大程度
上消除了反应副产物 ,酶反应过程对环境条件要求比较低 ,
尤其对温度的要求较低 ,其多数反应在常温下即可进行 ,这
样在高温下会发生的底物的降解反应的几率相应降低 ,副产
物的减少降低了对其处理的费用也减少了对环境的压力. 同
时酶反应对能量的需求也比较低. 因此 ,对污染土壤的酶修
复的研究具有重要的理论和实践意义 [27 ] .
3 　污染土壤酶修复的技术与方法
　　酶作为土壤有毒物质的降解物必须具备以下的特点 :1)
可以被重复使用 ;2) 在反应结束以后可以恢复初始活性 ;3)
可以在一个过程中连续使用 ;4) 具有较高的稳定性. 而这些
特点游离酶不具备 ;在水溶液中的游离酶的缺点 :1) 不能被
重复使用 ;2)很难或不可能恢复 ;3) 对几种变性因子稳定性
较低 ;4)不能持续利用. 在 20 世纪 70 年代 ,科学家们把酶蛋
白与固体基质固定 ,即将酶从一个均质的反应体系转化向异
质反应催化体系 ,依据固定化技术开创了一个新的研究领域
———固定化酶生产及应用[27 ] .
在过去的几十年里 ,已对固定化基质的种类、固定机制
等进行了研究 ,得到固定化酶以进行实际的应用. 大量的研
究表明[5 ,13 ,33 ,57 ] ,可以利用固定化酶去除土壤污染 ,并使其
恢复原状 ;可用于提高低产土壤的肥力 ,恢复由于过分使用
杀虫剂而污染的土壤.
何宁[35 ]提到 Shinji Wada 等人用弱酸离子交换树脂 Di2
aion WK220 作为支持物 ,利用交联剂 EDC 将酪氨酸酶固定
制成固定化酪氨酸酶 ,用这种固定化的酶去除土壤中的苯酚
效果好于游离酶 ,并且在 10 次重复处理后 ,酶活力几乎不降
低.但如果不将酪氨酸酶固定化 ,可溶性酪氨酸酶反应后会
迅速失活.
土壤本源的氧化还原酶对一些潜在污染物或它们的衍
生物有较强的去除作用. 正像它们能够催化非芳香族化合物
如烷类、取代烷类的氧化反应一样 ,氧化还原酶如加氧酶、酚
氧化酶、过氧化物酶能够催化多种芳香族化合物的氧化反
应 ,例如 :苯酚、取代酚、苯胺、多环芳烃等. 在反应中可能发
生芳环的裂解和由非酶转化作用而形成不稳定的底物阳离
子基以及聚合作用. 在这个过程中氧和过氧化氢充当氧化剂
的作用. 另外 ,这类酶最普遍的特征是能使不稳定的带有卤
素的反应产物进行化学分解而自发脱卤 [27 ] .
4 　用于污染土壤修复酶的来源
　　目前用于污染土壤修复的外源酶都是从微生物体内提
取的. 能够降解不同的脂肪族、脂环族、芳香族和杂环族化合
物的微生物已被分离出来 ,并且降解的生化过程以及酶在反
应中的作用也已阐明. 研究证明微生物来源的酶所作用的底
物并不是微生物的碳源 ,这种酶将污染物作为底物 [38 ] . 所以
具有广阔的应用前景.
　　Singleton[56 ]指出只有几种能降解异生命体化合物的酶
得到了提纯. 从细菌中提纯的酶有五氯苯酚单加氧酶、二氯
甲烷脱卤酶等. 从霉菌中提纯的酶有木质素过氧化物酶等.
5 　固定化酶 : 技术与性质
511 　酶的固定化技术
　　把酶固定在基质上有几种方法 :把酶固定在承载物上、
酶与基质互相交联或采取物理包被技术. 固定化技术可以通
过化学结合或物理持留来进行 [27 ] . 目前有 5 种固定化技术.
1)酶分子与承载物间共价结合 ;2)酶分子与承载物间吸附结
合 ;3)渗入胶体或纤维中 ;4)与稳定的团聚体形成胶囊 ;5) 与
功能剂形成交联物质 (图 1) . 这些方法可单独应用 ,也可共
同使用. 所有这些固定方法在自然界中都存在 ,许多酶都是
以固定化的状态存在的. 例如土壤中的酶就是一类以固定化
状态起作用的酶. 固定化技术的关键在于要平衡固定时初始
活性的丧失和固定以后长时期的活性保持. 对于消除土壤中
的有毒物质来说 ,酶固定化后长时期活性保持作用意义比只
具有较高的初始活性意义重要得多. 在所有的方法中吸附法
最简单 ,但是在对底物 (即有毒物质) 进行作用时效果最差.
因为酶和承载物之间的作用力很小 ,在一定条件下很易出现
解吸附而导致酶失活. 比较而言 ,在聚合胶体上的物理包被
的方法既可以防止酶逸失又可允许底物和产物通过. 但是时
间过长 ,酶分子也会从孔隙中扩散出来而造成固定化酶催化
活性下降 ,这个问题是该固定方法的最大缺陷.
　　共价结合是将功能集团连接在酶和承载物上 ,是一个比
较优越的方法 ,但其前期准备工作比较困难 ,承载物的制作
复杂 ,成本较高 ,并且因为与活性部位结合会造成活性的相
对下降[27 ] .
　　在进行酶的固定化研究时要以如下的标准进行衡量 :方
法的简易性、生产成本的低价性、对酶的普遍适用性 ,以及整
个过程的易控性. 同时承载物的选择必须要考虑它对酶进行
固定的能力和对酶发挥作用的影响、酶固定以后的稳定性以
及生产和使用成本 [27 ] .
512 　固定化酶的性质
　　固定化酶的催化特性与游离酶不相同. 固定化酶的两个
最主要的性质 :1)具有较高的稳定性 ,能够抵抗物理、化学和
生物变性剂的干扰 ,从而使其本身变化很小或根本不变化 ;
2)由于是异质体系 ,所以它的催化特性有所不同. 这些性质
在很大程度上取决于酶固定体系的主要成份以及它们结合
的方式. 其它条件 (p H、温度、离子强度、压力、搅拌、协同因
子)都会对环境条件有影响 ,从而影响到酶的作用. 承载物的
表面 ,不管是无机物质还是有机物质 ,都会影响到酶的作用 ,
因为在这个微域环境里 p H 值、缓冲体系、亲水性和疏水性
与溶液不同. 酶与不溶性承载物固定以后活性的降低取决于
固定后蛋白质分子三级结构的变化. 另外 ,酶和基质连接的
数量以及承载物的亲水基和酶蛋白的疏水基互相交联程度
一样影响酶的作用. 酶与承载物连接的方式与活性部位的某
343212 期 　　　　　　　　　　　　　　　张丽莉等 :污染土壤的酶学修复研究进展 　　　　　　
些基团有关. 同时 ,蛋白的固定会影响酶亚基间的互相连
接[43 ] .
　　由于酶与基质之间进行了连接与固定 ,所以酶的活性部
位会在一定程度上受到包被或覆盖 ,而底物就不能与酶的活
性部位像均质体系一样容易接触. 对于大分子底物这个特点
表现得尤为突出. 而这个作用不干扰底物向酶的靠近和产物
从活性部位的扩散 ,几种固定在固体基质上的酶对大分子底
物的活性要小于对小分子底物的活性就是这个道理. 固定化
图 1 　物理技术 (a)和化学技术 (b)对酶的固定
Fig. 1 Immobilization of enzymes by physical techniques (a) and chemi2
cal techniques (b) .
酶比游离酶更稳定 ,更能抵抗其它蛋白的侵扰和分解 ,就是
因为基质与酶的结合而形成了对酶的保护使酶不易被分
解[27 ] .
　　固定化酶的转化率受底物、产物的扩散性影响很大. 以
反应物的扩散来说 ,在所有的酶反应过程中有 5 个步骤 :1)
底物从体系中扩散到固定化的催化复合体上 ;2)底物与固定
化的酶粒子连接 ,即底物从承载物表面扩散到酶的活性部
位 ;3)酶进行催化反应而生成产物 ;4) 产物从固定化粒子上
扩散到外部表面 ;5)产物从外部表面扩散到反应体系中 [42 ] .
固定化酶的活性受 p H 值影响 ,而 p H 值的变化常取决于微
域环境的变异. 在有电荷的基质上 ,p H 值常常取决于在固定
化酶的主要部分和外部空间里有电荷的底物和产物的比
例[39 ] .存在于环境中的固定化酶与溶液中的酶的性质不同.
固定化酶底物浓度 ,影响因素和/ 或氢离子或氢氧根 (如果基
质是有电荷的)会与溶液中的不同. 也许会发生静电反应或
疏水反应 ,从而使酶周围的微域环境的一系列性质改变.
　　固定化酶对温度的响应是在较高的温度下比同样的游
离酶活性高 ,说明酶的固定使其稳定性提高从而有这样的效
果.这种稳定性的提高是由于酶的固定而使其三级结构更加
稳定而抵抗了温度提高带来的影响 ,因为温度提高易使蛋白
质的三级结构发生变化 [48 ] .
　　固定化酶的动力学特征研究是了解固定化酶反应特点
的重要手段 ,但目前对固定化酶的动力学研究很少. 有研究
表明在固定化状态 ,虫漆酶和过氧化物酶保持了较高的活
性 ,而酸性磷酸酶的活性有所下降. 同时 ,虫漆酶和过氧化物
酶对底物的亲合力保持不变 (即相同的 Km 值) ,酸性磷酸酶
对底物的亲合力有所下降 ( Km 值上升) [42 ] .
6 　几种氧化还原酶的来源及其去污作用
　　土壤中有机污染物的去除可通过各种氧化还原酶的作
用进行 ,因此在污染土壤的酶学修复研究中 ,氧化还原酶是
关注的焦点 ,根据文献总结出的几种主要的可以用于土壤污
表 1 　氧化还原酶及在有机污染土壤修复中的作用
Table 1 Oxidoreductases and their function of remediation to soil organic pollutants
酶
Enzymes
来源
Source
作用
Applications
过氧化物酶 Peroxidases 辣根 Horseradish 氯酚的降解[24 ,40 ,58 ]
植物物料 Plant material 多聚芳香族化合物降解[23 ,31 ,49 ]
除草剂降解[22 ,41 ]
氯过氧化物酶 Chloroperoxidase 卡尔里霉素 Caldariomyces f unago 酚类化合物氧化[10 ,45 ,52 ,61 ]
木质素过氧化物酶 Lignin peroxidase 白霉菌 Phanerochaete chrysosporium 芳香族化合物降解[4 ,21 ,25 ,36 ]
锰过氧化物酶 Manganese peroxidase 白霉菌 Phanerochaete chrysosporium 苯酚和木质素降解[1 ,20 ,59 ]
香 茹 Lentinula edodes 氯苯酚降解[29 ,30 ]
酪氨酸酶 Tyrosinase 双孢茹 A garicus bisporus 异生命体化合物去除[15 ]
云 芝 Trametes versicolor 尿素衍生物降解[37 ]
漆 酶 Laccase 植物物料 Plant materials 异生命体与腐殖质的结合[7 ,17 ,18 ]
染物转化的氧化还原酶的来源及其潜在作用见表 1.
7 　氧化还原酶去除土壤污染的机理
　　土壤中的酶是通过特定底物的反应来消除土壤中污染
物的毒害 . 过氧化物酶和酚氧化酶通过将污染物转化为其它
产物的方法来消除污染物的毒害 ;酪氨酸酶通过催化酚的羟
基化和氧联苯酚的脱氢作用来消除土壤中有毒物质的污
染[19 ] ;漆酶是通过聚合过程来起作用 [16 ,26 ] . 聚合反应对酚类
物质的去除受其化学结构、底物浓度、反应体系 p H 值、酶活
性、以及培养时间和温度的影响. Bollag 提出通过向土壤中加
入漆酶进而促进异生命体与腐殖质的合成和聚集以减少土
壤污染[17 ,18 ] ;对木质素酶作用于有机氯与腐殖酸的结合方
4432 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　14 卷
面也进行了一些研究 [20～22 ] ;氧化还原酶会促进土壤有机物
质与腐殖质的聚合 [55 ] ;带有氯的苯酚和苯胺会由漆酶和过
氧化物酶在土壤中进行氧化而解毒 [51 ] .
　　多环芳香烃和五氯苯酚的转化与锰过氧化物酶有
关[28 ] .氧化物酶和漆酶芳香烃和五氯苯酚的氧化则是过氧
化物酶和漆酶作用的结果 [23 ,31 ,40 ,49 ,50 ] .
　　除草剂是相对惰性的化学物质 ,漆酶对其有一定的作
用 ,其氧化作用及产物的吸附受到腐殖质的影响 [41 ] .
　　提纯的漆酶对尿素衍生物的转化作用受 p H 值影响很
大. p H 值也影响反应产物存在的状态 [37 ] .
　　所有的酪氨酸酶 ,例如铜酚氧化酶能够通过聚合途径催
化酚类物质的转化. 这不仅是酚类污染修复的途径 ,也是土
壤腐殖化的一个过程 [27 ] .
　　用光谱法和电泳方法检测种植在有污染和无污染的土
壤上的 12 种植物 ,结果表明 ,种植在无污染土壤上的植物中
含有蛋白酶、酯酶和脂肪酶. 而未消除土壤污染的提取液中
除了这些酶以外还包括了高达 10 %的过氧化物酶和单酚单
加氧酶. 这说明这些植物体产生了足够的氧化还原酶来参与
特定土壤物质的氧化降解 [32 ] .
　　工业废水的排放与土壤污染密切相关 ,Munnecke[45 ,46 ]
和 Caldwell[9 ]分别用固定化的对硫磷水解酶和磷酸三酯酶 ,
在流化床反应器中处理有机磷农药污染的污水 ,污染物 (包
括甲基对硫磷、乙基对硫磷、对氧磷、二嗪农及蝇毒磷) 的去
除率达到了 90 %以上 ;另有研究用游离的或固定化的多酚氧
化酶和过氧化物酶去除不同类型工业废水中的酚类化合物 ,
取得了良好的效果 [3 ,14 ,15 ,37 ] .
　　也有研究用游离的或固定化的虫漆酶和过氧化物酶消
除土壤中的氯酚的污染 [26 ,54 ] . 在低有机质含量的土壤中 ,所
述酶类能去除 60 %的氯酚 ;土壤有机质含量的增多 ,对所述
酶的活性有抑制作用. 漆酶催化氧化反应机理主要表现在底
物自由基的生成和漆酶分子中 4 个铜离子的协同作用 [59 ] .
当漆酶催化酚类如氢醌氧化时 ,首先是底物氢醌向漆酶转移
一个电子 ,生成半醌2氧自由基中间体 ,其次是不均等非酶反
应 ,2 分子半醌生成 1 分子对苯醌和 1 分子氢醌. 氧自由基中
间体还能转变成碳自由基中间体 ,它们可以自身结合或相互
偶联 ,产物中除醌外还有聚合物和 C - O ,C - C 偶联产物. 在
O2 存在下 ,还原态漆酶被氧化 ,O2 被还原为水. 漆酶催化底
物的氧化和对 O2 的还原是通过 4 个铜离子协同地传递电子
和价态变化实现的. 其过程可用下式表示 :
Cu2 + Cu2 + Cu4 + →
2e
底物
Cu2 + Cu2 + Cu4 + →
分子内
电子转移
Cu2 + Cu2 + Cu4 + →
2e
底物
(氧化态)
Ⅰ　　Ⅱ　　Ⅲ
Cu2 + Cu2 + Cu2 + →
2H+ O2
- H2O ,快
Cu2 + Cu2 + Cu2O3 + →
2H+
- H2O ,慢
Cu2 + Cu2 + Cu24 + (氧化态)
　(还原态) 　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ⅰ　　Ⅱ　　Ⅲ
　　另外 ,Masaphy 模拟土壤环境 ,将 Xanthomonas sp . 的粗
酶提取物附着在蒙脱石上 ,研究了对硫磷的酶促降解[44 ] .
Cervelli[11 ]将吸附在烧结粘土上的β2糖苷酶和酸性磷酸酶加
入部分灭菌和完全灭菌的土壤发现 ,在随后的 8 天里 ,这些
酶仍保持了 80 %以上的活性 ,可用于污染土壤酶学修复.
　　Se、As、Cr 和 Hg 在国际上被列为优先重金属/ 准金属污
染物. 它们在土中的生物学毒性取决于其存在的价态 ,而后
者在一定程度上与诸多的生物化学过程 (氧化、还原、甲基化
和去甲基化)有关. 因此 ,曾对许多土壤微生物学解毒机理进
行过研究 ,而利用氧化态重金属/ 准金属至不溶态或挥发态
重金属/ 准金属的微生物学转化来修复污染土壤 ,更是当前
研究的一个新兴领域. 在这些研究中 ,曾零星地提到有关酶
的作用 ,但未看到有关酶修复的报道.
8 　展 　　望
　　在上述研究工作的基础上 ,还应加强以下几个方面的研
究 :1)国内外多数研究都集中在酶对污染土壤处理后污染物
的减少 ,即污染土壤酶修复的效果上. 在实际的反应中 ,会伴
随一些副产物的生成 ,对有毒副产物的去除同样是这个研究
领域的重要课题. 2)对酶修复过程的机理研究和影响因子的
研究还比较少 ,因为土壤 p H 值、底物浓度、温度、反应时间、
抑制剂等对酶修复过程会产生很大的影响. 对理化状况不同
的土壤分别进行影响因子的研究 ,对它的实际应用能提供较
准确的理论依据. 3)目前应用于这种技术的酶都来源于微生
物 ,从微生物体内对酶的提取和纯化是一个复杂的过程 ,并
且成本比较高 ,如果能将植物 (根、组织等) 作用为酶的来源
物不失为一个良好的研究途径.
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作者简介 　张丽莉 ,女 ,1977 年生 ,硕士生 ,主要从事土壤酶
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6432 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　14 卷