全 文 ：田 敏，蹇洪英，张 婷，等． 月季和香水月季不同变种的染色体荧光原位杂交研究［J］． 江苏农业科学，2013，41(12) :183 － 185．
月季和香水月季不同变种的染色体荧光原位杂交研究
田 敏，蹇洪英，张 婷，莫锡君，桂 敏，张 颢，唐开学
(云南省农业科学院花卉研究所 /云南省花卉育种重点实验室，云南昆明 650205)
摘要:以 45S rDNA为探针对月季、香水月季不同变种进行了染色体荧光原位杂交，结果表明:月季、香水月季中，
不同变种 45S rDNA杂交位点数与染色体倍性变化基本一致，四倍体“大白花”有 4 个杂交位点，三倍体“杏花村”、粉
红香水月季“维西永春”有 3 个杂交位点，二倍体紫月季、香水月季、大花香水月季和粉红香水月季‘昆明富民’均有 2
个杂交位点;月季和香水月季不同变种之间在 45S rDNA杂交信号的强弱上存在差异，说明不同变种之间在染色体结
构及 45S rDNA拷贝数上存在多样性。
关键词:蔷薇属;FISH;45S rDNA;月季;香水月季
中图分类号:S685． 120． 3 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2013)12 － 0183 － 03
收稿日期:2013 － 04 － 14
基金项目:国家自然科学基金(编号:31060267) ;云南省自然科学基
金面上项目(编号:2008CD183) ;云南省科技攻关项目(编号:
2011BB013)。
作者简介:田 敏(1985—) ，女，云南红河人，硕士，研究实习员，从事
花卉种质资源细胞遗传学研究。E － mail:tminfl@ yeah． net。
通信作者:唐开学，博士，研究员。E － mail:kxtang@ hotmail． com。
月季(Ｒosa chinensis)和香水月季(Ｒ． odorata)属于蔷薇
科蔷薇属月季组。月季种下包含月季原变种(Ｒ． chinensis
var． chinensis)、单瓣月季(Ｒ． chinensis var． spontanea)和紫月
季(Ｒ． chinensis var． semperflorens) ，香水月季种下包含香水月
季原变种(Ｒ． odorata var． odorata)、大花香水月季(Ｒ． odora-
ta var． gigantea)、粉红香水月季(Ｒ． odorata var． erubescens)
和桔黄香水月季(Ｒ． odorata var． pseudoindica)［1］。月季和香
水月季都原产于中国，其中香水月季原产云南［2］。月季和香
水月季不仅是非常重要的园林植物［3］和现代月季的重要原
始亲本［4］，也是现代月季最重要的两大性状即连续开花和芳
香怡人(茶香)的来源［5］，因此对其进行基础细胞遗传学研究
具有重要意义。荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridiza-
tion，FISH)技术是一种非放射性原位杂交技术，可以用于核
酸研究的各个方面［6］。用 FISH 进行核酸序列研究具有试验
周期短、灵敏度高、分辨率高、直观可见等优点［7］。Ma 等对
月季原变种、香水月季原变种、大花香水月季、单瓣月季进行
了原位杂交分析［8 － 10］，但紫月季、粉红香水月季和桔黄香水
月季还没有任何相关研究，同时还缺乏把月季和香水月季作
为一个整体对中国野生月季资源在现代月季形成过程中所起
作用的系统研究。因此，对月季和香水月季不同变种开展荧
光原位杂交研究，一方面为其遗传多样性和亲缘关系研究提
供分子细胞遗传学方面的依据，另一方面可为研究中国古老
月季起源和现代月季形成提供基础信息。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
试验材料及相关信息见表 1，均以嫁接苗形式保存在云
南省农业科学院花卉研究所月季资源圃中。
45S rDNA克隆自番茄基因组，由武汉大学生命科学学院
李立家教授提供。45S rDNA片段长度为 9． 1 kb，包括 5． 8S、
18S、25S亚单位和内转录间隔区(ITS) ;克隆载体为 pUC18，
酶切位点为 KpnⅠ。
1． 2 试验方法
靶染色体的制备方法参考 Ma 等的方法［8］，并作适当修
改。具体如下:在天气晴朗的春季上午，选取植株尚未形成花
芽且生长旺盛的茎尖，用 0． 001 mol /L 8 －羟基喹啉和 0． 01%
秋水仙素混合液预处理 4 h;0． 075 mol /L KCl 溶液低渗
30 min，再于卡诺固定液(无水乙醇 ∶ 冰乙酸 = 3 ∶ 1)中固定
过夜;分离出茎尖生长点，在 0． 25 mol /L HCl 溶液中解离
10 ～ 15 min，置于 4%纤维素酶(Yakult 或 Sigma)与 2%果胶
酶(Yakult或 Sigma)1 ∶ 1 配制组成的混合液中 37 ℃酶解 3 ～
4 h，37 ℃无菌水低渗 90 min;将无菌水去除，加入卡诺固定液
混匀为原生质体悬液，滴于事先清洗并冰冻的防脱载玻片上，
并迅速置于乙醇灯上烘烤干燥。
探针标记采用缺口平移法(Nick translation)［13］，用地高
辛(Digoxigenin － 11 － dUTP)标记该质粒，标记试剂购自
Ｒoche公司(Dig － Nick Translation Mix，No． 11745816910) ，按
其说明书操作。
原位杂交:染色体制片 60 ℃烘干 1 ～ 2 h;10 μg /mL胃蛋
白酶液 37 ℃处理 40 min，2 × SSC 漂洗后，于 75%→95%→
100%乙醇溶液中各级脱水 5 min;再于 70% FAD 溶液中
70 ℃ 变性染色体，然后立即用 75%→95%→100%冰乙醇依
次脱水 5 min;将 50 μL杂交混合液滴加到染色体制片上，于
90 ℃共变性 10 min，37 ℃杂交过夜。杂交混合液配制:50%
FAD，10% DS、3 μg /mL Probe DNA、0． 1 mg /mL鲑鱼精 DNA、
10% 20 × SSC、0． 1% SDS，将杂交混合液于 75 ℃变性 10 min
后迅速冰浴 10 ～ 20 min。
信号检测:2 × SSC 37 ℃洗脱 2 次，每次 5 min;室温下分
别用 2 × SSC、1 × PBS洗脱 1 次，每次 5 min。加入 50 μL抗体
(1% BSA /PBS) ，于保湿皿中 37 ℃培育 30 min。1 × PBS 洗
脱 3 次，DAPI复染 5 min，1 × PBS 漂洗后滴加抗荧光淬灭剂
封片。在激光共聚焦显微镜(Olympus FV1000)观察荧光信
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DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2013.12.130
表 1 供试月季组资源的来源及已有染色体信息
编号 类群 变种 /品种 来源 染色体倍性
1 月季 Ｒ． chinensis Ｒ． chinensis var． chinensis‘Dabaihua’大白花 江苏南京 2n = 4x(unpublished data)
2 月季 Ｒ． chinensis Ｒ． chinensis‘Betty Prior’杏花村 中国农科院赠送 2n = 3x(unpublished data)
3 月季 Ｒ． chinensis Ｒ． chinensis var． semperflorens 紫月季 云南昆明 2n = 2x［11］
4 香水月季 Ｒ． odorata Ｒ． odorata var． odorata 香水月季(原变种) 云南昆明双龙 2n = 2x［12］
5 － 1 香水月季 Ｒ． odorata Ｒ． odorata var． erubescens 粉红香水月季 云南昆明富民 2n = 2x［12］
5 － 2 香水月季 Ｒ． odorata Ｒ． odorata var． erubescens 粉红香水月季 云南维西永春 2n = 3x［12］
6 香水月季 Ｒ． odorata Ｒ． odorata var． gigantea 大花香水月季 云南玉溪新平 2n = 2x［12］
注:月季在中国栽培与应用历史悠久，经过长期的人工栽培和反复杂交，已难以清楚区分野生月季和栽培月季品种，在本研究中，用相似的
“大白花”代替月季原变种;用丰花月季品种“杏花村”(单瓣)代替单瓣月季。桔黄香水月季由于移栽后长势较弱，在试验期间一直未采到适宜
的材料。
号，去除背景后拍照得到染色体物理图谱。用 FV10 － ASW
2． 0 成像系统软件进行原位杂交图像的摄取、采集和加工;并
用 Adobe Photoshop软件进行图片处理。用于各类杂交信号
统计的细胞数目在 10 个以上。
2 结果与分析
图 1 中显示了 7 份试验材料的 45S rDNA 荧光原位杂交
结果，其中信号点为罗丹明染成的红色，染色体或染色质被
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DAPI染为蓝色。
四倍体的“大白花”在间期染色质和前期的染色体上都
显示出 4 个 45S rDNA杂交位点(图 1 中 1 － A、1 － a) ，4 个杂
交信号都位于染色体末端(图 1 中 1 － A)。在间期核和分裂
前期中，都表现出其中有 3 个信号较强，而另 1 个杂交信号较
弱(图 1 中 1 － A、1 － a)。
三倍体的“杏花村”在分裂前期有 3 个 45S rDNA杂交位点
(图 1中 2 －A)，在间期核中也表现出同样的数量(图 1 中 2 －
a)。杂交点在强度和大小上都比较一致(图 1中 2 －A、2 － a)。
二倍体的紫月季在间期染色质和前期的染色体上都显示
出 2 个 45S rDNA杂交位点(图 1 中 3 － A、3 － a) ，2 个杂交信
号都位于染色体末端(图 1 中 3 － A)。杂交点在强度和大小
上都比较一致(图 1 中 3 － A、3 － a)。
二倍体的香水月季在分裂前期有 2 个 45S rDNA 杂交位
点(图 1 中 4 － A) ，在间期核中也表现出同样数量的位点(图
1 中 4 － a) ，2 个杂交信号都位于染色体末端(图 4 － A)。在
间期核和分裂前期中，都表现出其中有 1 个信号较强，而另 1
个杂交信号较弱(图 1 中 4 － A、4 － a)。
二倍体的粉红香水月季在间期染色质和前期的染色体上
都显示出 2 个 45S rDNA杂交位点，在间期核和分裂前期中，
都表现出其中有 1 个信号较强，而另 1 个杂交信号较弱
(图 1 中 5 － 1 － A、5 － 1 － a)。
三倍体的粉红香水月季在间期染色质和前期的染色体上
都显示出 3 个 45S rDNA杂交位点(图 1 中 5 － 2 － A、5 － 2 －
a) ，3 个杂交信号都位于染色体末端(图 1 中 5 － 2 － A)。在
前期 3 个杂交信号中 2 个信号较强，而另 1 个杂交信号较弱
(图 1 中 5 － 2 － A) ;在间期中，信号大小和强弱没有明显差别
(图 1 中 5 － 2 － a)。
二倍体的大花香水月季在分裂前期有 2 个 45S rDNA 杂
交位点(图 1 中 6 － A) ，在间期核中也表现出同样的数量(图
1 中 6 － a)。在间期核和分裂前期中，都表现出其中有 1 个信
号较强，而另 1 个杂交信号较弱(图 1 中 6 － A、6 － a)。
3 小结与讨论
45S rDNA在细胞分裂间期大量转录表达形成特殊的区
域，成为核仁。在染色体上含有此串联重复单位的部位称为
核仁组织区(Nucleolus organizing regions，NOＲs)。核仁组织
区是细胞分裂不可缺少的结构，通常 1 个物种至少要有 1 对
同源染色体具有核仁组织区;核仁组织区一旦缺失，植物细胞
将分裂异常，植物体将不能生存［14］。rDNA 位点数通常与物
种多倍化过程紧密相关［15］，而多倍化过程中 45S rDNA 位点
倾向于被保留，具有相对保守的数量［16］，即 1 个染色体组有 1
个 45S rDNA杂交位点。月季和香水月季及其种下变种也具
备上述特征，45S rDNA位点数与染色体组数即倍性成对应关
系，也就是二倍体变种有 2 个杂交位点，三倍体变种有 3 个杂
交位点，四倍体变种有 4 个杂交位点，这与 Ma 等的研究结
果［8 － 10］一致，也与蔷薇科地榆属(Sanguisorba L．)的研究结果
一致。因此，45S rDNA为探针的分裂间期 FISH 可以作为一
种检测蔷薇属种及种下单位倍性的方法。
FISH是一种半定量技术，尽管其结果不能直接显示基因
的实际拷贝数，但通过杂交信号的大小和强弱，可以间接反映
基因拷贝数的多少［17］。45S rDNA 是一个串联的高度重复序
列，在植物进化的过程中相当保守，在许多物种中不仅存在于
随体染色体上，也存在于某些非随体染色体上，但拷贝数一般
较少。本研究中，紫月季、大花香水月季和香水月季都为二倍
体，均有 2个 45S rDNA位点，但杂交信号强弱有差异:紫月季
的 2个杂交位点都较弱，香水月季和大花香水月季则 1 个信号
较强另 1个信号较弱，表明它们在分子水平上存在显著遗传差
异。供试的 7个变种 45S rDNA 在染色体上表达量的差异，表
明其在染色体结构及 45S rDNA拷贝数量上存在多样性。
致谢:感谢武汉大学生命科学学院李立家教授指导蔷薇
属荧光原位杂交体系的建立，并提供杂交所用探针。
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