全 文 ：狐米草离体培养植株再生
1蔡小宁 ,　 1佘建明 ,　 2钦　佩 ,　 2谢　民 ,　 2杨永华
( 1江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所 ,南京 210014; 2南京大学生物技术研究所 ,南京 210008)
收稿日期: 2000-03-08
基金项目:海洋“ 863”计划项目 ( 819-08-04)
作者简介:蔡小宁 ( 1962-) ,男 ,江苏海安人 ,硕士 ,副研究员 ,从事农
业生物技术研究。
　　摘　要: 以狐米草种子的无菌苗和幼穗为外植体 ,在 MS培养基上再生出完整的小植株。在培养基中添加 0. 1
mg / L GA3 ,狐米草种子的发芽率由 5. 7%提高到 20. 9%左右 ;仍不能发芽的种子 ,用刀剖开后再接种 ,发芽率达
49. 0%。获得了两种类型的愈伤组织: 白色、光滑的非胚性愈伤组织 ;绿色、结节状的胚性愈伤组织。非胚性愈伤组
织诱导再生植株的频率为 3. 0% ,胚性愈伤组织诱导再生植株的频率为 100. 0%。研究建立起狐米草离体培养植株
再生的技术体系。
关键词: 狐米草 ; 离体培养 ; 愈伤组织 ; 植株再生
中图分类号: S543. 9　　文献标识码: A　　文章编号: 1000-4440( 2000) -03-0143-05
Plant Regeneration from Spart ina patens
1
CAI Xiaoning ,　 1 SHE Jianming ,　 2QIN Pei ,　 2XIE Min,　 2YAN G Yonghua
( 1 Inst itute of Ag robiological Genetics an d Physiology , J iangsu Academy of Ag ricul tural Sciences, Nanj in g 210014; 2 Inst itu te of App lied B iotech-
nolog y, Nanj ing Univer si ty ,N anj ing 210008)
　　 Abstract: Seedlings o f seeds and young spikes of Spartina patens w ere used as explants. The regenera ted
plants w ere obtained on the modified M S medium with g rowth r egula tor s. As 0. 1 mg /L GA3 w ere supplemented in
the medium, r ate of g ermination o f seeds w ere increased fr om 5. 7% to 20. 9% . Then, seeds tha t had no t g ermina ted
w ere ripped, 49. 0% o f th ese seeds could germina te. Tw o types o f calli, white smoo th nonembryogenic callus and
g reen tuber cled em bryogenic callus, w ere gained. Only 3. 0% o f nonembryogenic ca lli could regenerate plants, while
all o f embryogenic calli could r egenera te plants. T echniques fo r plant r egenera tion o f Spartina patens have been es-
tablished in this experiment.
Key words: Spartina patens; in vitro cultur e ; ca llus; plant reg eneration
　　随着人口增长和经济发展 ,中国土地供需矛盾
日益突出 ,急待开发新的土地资源。中国现有 2. 67
× 106 hm2的沿海滩涂 ,开发适应滩涂种植、可用海
水浇灌的耐盐经济作物具有重要意义。近年来 ,南京
大学从美国引进了适宜在沿海滩涂盐土上生长的耐
盐性 极强 的 优 质 牧草—— 狐 米 草 ( Spartina
patens )。然而 ,狐米草种子结实率很低 ,难以大规模
推广应用 ,采用组织培养手段进行快速繁殖是一条
崭新的途径 ,具有极大的应用价值。迄今有关狐米草
组织培养的报道甚少 [1 ] ,且试验结果重复性差。我们
以狐米草种子和幼穗为外植体 ,试图探明影响其愈
伤组织诱导、继代培养和植株再生的因素 ,并建立离
体培养植株再生的技术体系。
1　材料与方法
狐米草幼穗采自江苏省射阳盐场 ,采样时间为
1999年 7月下旬至 8月上旬。采样时狐米草正处于
孕穗期 ,幼穗尚未抽出。将幼穗连同外包的叶鞘先在
70%酒精中浸泡 1 min,然后用 0. 1%升汞消毒 15
143江苏农业学报 (Jiangsu J . of Agr . Sci . ) , 2000, 16( 3): 143～ 147
min,用无菌水冲洗 4～ 6次 ,在无菌培养皿中剥出
幼穗 ,并切成小段 ,接种于愈伤组织诱导培养基。待
愈伤组织产生后 ,再进入继代、分化、生根培养。狐米
草种子来自美国特拉华大学盐生植物生物技术中
心。将种子用 70%酒精浸泡 1 min, 0. 1%升汞灭菌
20 min,无菌水冲洗 4次 ,接种于发芽培养基。5 d后
剔除污染种子 ,将产生的无菌苗分批接种于愈伤组
织诱导培养基。愈伤组织产生后 ,进入继代、分化培
养 ,获得的再生植株进行生根培养。
基本培养基由 MS[ 2]培养基大量元素、铁盐、微
量元素和 B5有机成分 [3 ]组成。培养基中添加 2, 4-
D、 IAA、 BA、 CPPU、 GA3等外源激素 ,含 3%蔗糖 ,
以 0. 8%的 Agar (日本进口分装 )、 0. 2%的 Gelri te
(中国科学院遗传研究所朱祯先生惠赠 )、 0. 2%的
Phytagel( Sigma公司出品 )琼脂分别作培养基固化
剂 ,灭菌前调整培养基 pH值至 5. 8。
2　结 果
2. 1　狐米草种子萌发
狐米草种子内部带菌较多 ,用升汞只能对其表
面进行消毒。因基因型和采样批次不同 ,种子被污染
的程度也不同 ,严重时污染率达 70% ,较轻时也达
30%。接种后 5～ 10 d为污染高峰期 ,此时应及时挑
选出尚未被污染的种子和无菌苗作备用。
狐米草种子成熟度差 ,种子经消毒灭菌后接种
在不含激素的 MS培养基上 ,发芽率仅为 5%～
10%。在 M S培养基中添加 0. 1 mg /L的 GA3 ,狐米
草种子的发芽率可提高到 20. 9% ;添加 2. 0 mg /L
2, 4-D、 1. 0 mg /L IAA,狐米草种子的发芽率可达
18. 6% (表 1)。在上述培养基上仍不能发芽的种子 ,
用刀片剖开 ,接种在愈伤组织诱导培养基上 ,约
50%的种子能萌发。我们采用上述方法将狐米草种
表 1　培养基中激素组合对狐米草种子发芽的影响
Table 1　 Ef fect of hormone combinations in the medium on germi-
nation of s eeds of Spart ina patens
激素组合
Hormon e
combination
接种种子数
No. of seed
发芽种子数
No. of s eed
g erminated
发芽率
Percent of
germination (% )
无激素
Hormone f ree
895. 0 51. 0 5. 7
0. 1 mg /L GA3 350. 0 73. 0 20. 9
2. 0 mg /L 2, 4-D
+ 1. 0 mg /L IAA
43. 0 8. 0 18. 6
子的发芽率由 5. 7%提高到 59. 7% ,从而大大提高
了狐米草种子的利用率。
2. 2　愈伤组织诱导培养
将狐米草种子无菌苗接种到附加 2. 0 mg /L
2, 4-D和 1. 0 mg /L IAA的培养基上 , 7 d后可见外
植体明显膨大 , 14 d后明显可见白色或黄色的愈伤
组织 (图 1A)。
琼脂的类型对愈伤组织诱导有较大的影响。 以
琼脂 Agar作培养基固化剂 ,愈伤组织诱导频率仅
为 15%左右 ,以 Gelri te或 Phy tagel取代 Agar,愈
伤组织诱导频率则提高到 50%以上 (表 2)。与 Aga r
相比 ,以 Gelri te或 Phy tagel作培养基的固化剂 ,可
明显减轻愈伤组织褐化 ,愈伤组织块也较大 ,出愈时
间也提早。
表 2　培养基固化剂种类对愈伤组织诱导的影响
Table 2　Ef fect of sorts of sol idi fying agent on callus induction
处 理
Treatment
接种无菌苗数
No. of
seedling s
获得愈伤组织
的无菌苗数
No. of seedlings
w ith callus
愈伤组织
诱导率
Percen t of callus
induction (% )
　 0. 7% Agar 36. 0 5. 0 13. 9
　 0. 2% Gelri te 84. 0 44. 0 52. 4
　 0. 2% Phytagel 172. 0 99. 0 57. 5
光、暗培养条件对愈伤组织诱导有一定影响。暗
培养条件有利于狐米草种子诱导愈伤组织 ,诱导产
生的愈伤组织块较大 ,但愈伤组织带有的粘液较多 ,
部分愈伤组织易于褐化。在光照培养条件下 ,种子愈
伤组织的诱导频率降低 ,愈伤组织生长量较小 ,但褐
化现象减轻 ,产生的粘液也减少 (表 3)。
此外 ,我们还观察到增加培养基中 2, 4-D含
量 ,诱导出的愈伤组织较大 ,但愈伤组织粘液化程度
加重。种子在添加 2, 4-D的培养基上萌发产生的无
菌苗接种于愈伤组织诱导培养基较有利于愈伤组织
的诱导 ,可获得较大的愈伤组织。在诱导培养基中降
低 NH4NO3用量 ,愈伤组织诱导率下降 ,诱导出的
愈伤组织较为干燥 ,粘液很少。以种子无菌苗作外植
体 ,愈伤组织诱导频率较低 ,诱导的愈伤组织较小 ;
将未萌发的种子剖开后接种于愈伤组织诱导培养
基 ,愈伤组织诱导频率较高 ,得到的愈伤组织较大。
将狐米草幼穗接种于含 2. 0 mg /L 2, 4-D和
1. 0 mg /L IAA的 MS或 SH[4 ]培养基上 ,约 90%的
144 江 苏 农 业 学 报 　 2000年 第 16卷 第 3期
表 3　光、暗条件对愈伤组织诱导的影响
Table 3　 Effect of light or dark condition on callus induction
外植体类型
Type of explan t
光暗条件
Light or dark condi ton
接种外植体数
No. of explan t
获得愈伤组织
的外植体数
No. of explan t wi th cal lus
愈伤组织诱导率
Percen t of callus induction
(% )
　种子无菌苗
　 Seedling f rom seed
　幼 穗
　 Young spike
光照
Ligh t
84. 0 44. 0 52. 4
黑暗
Dark
22. 0 14. 0 63. 6
光照
Ligh t
40. 0 38. 0 95. 0
黑暗
Dark
43. 0 37. 0 86. 0
A:种子愈伤组织 ; B:从幼穗愈伤组织再生植株 ; C:从种子愈伤组织再生植株 ; D:再生植株继代 ; E:再生植株生根。
A: calli f rom seeds; B: plant regeneration f rom calli of young spikes; C: plant regeneration f rom calli of seeds; D: reg enerated plants w ere
su bcul turing; E: regen erated plant w as rooting.
图 1　狐米草的组织培养
Fig. 1　 Tissue culture of Spart ina patens
145蔡小宁等:狐米草离体培养植株再生
幼穗产生了愈伤组织 (图 1B)。愈伤组织产生部位大
多为颖壳内基部 ,少量为枝梗切口和小穗柄断裂处。
光、暗条件影响狐米草幼穗外植体愈伤组织的诱导。
暗培养条件下产生的愈伤组织多为白色、黄色 ,生长
量较大 ,但褐化现象较重 ;光照培养条件下产生的愈
伤组织多为绿色 ,生长量较小。光照培养条件下幼穗
外植体愈伤组织诱导频率高于暗培养条件下 (表
3)。
2. 3　愈伤组织继代培养
从幼穗产生的愈伤组织在含 1. 0 mg /L N AA、
0. 5 mg /L BA、 50 mg /L椰子汁的培养基上进行继
代培养 ,愈伤组织体积逐渐增大 ,并由原先绿色逐渐
转变为白色或黄色 ,继续继代培养于 2, 4-D含量降
低为 0. 1 mg /L的培养基上 ,愈伤组织则趋于干燥 ,
少量会产生绒毛状根。 幼穗部位产生的愈伤组织连
同外植体一起转换培养基有利于愈伤组织生长 ,而
过早将愈伤组织从外植体上分离下来再进行培养 ,
愈伤组织生长较慢。
来自种子的愈伤组织继代于只附加生长素不含
细胞分裂素的培养基上 ,随着继代时间的延长和继
代次数的增加 ,粘液逐渐增多 ,愈伤组织褐化现象加
重 ,从而最终导致愈伤组织生长停滞或死亡。在培养
基中添加适量的细胞分裂素 BA,愈伤组织粘液化
程度减轻 ,并趋向干燥 ,少量有转绿趋势。
在暗培养条件下继代培养 ,愈伤组织的生长速
率加快 ,粘液化现象加重 ,产生较多水渍状愈伤组
织。在光照条件下继代培养 ,愈伤组织生长速度则减
慢 ,粘液减少 ,愈伤组织较干燥。
用 Agar作培养基固化剂 ,愈伤组织生长缓慢 ,
易于褐化。以 Gelrite代替 Agar,则愈伤组织的生长
速度较快 ,褐化现象明显减轻 ,便也较易产生粘液。
Phytagel的效果与 Gelri te一致。
在继代培养基中添加甘氨酸、 L-谷氨酰胺、 L-天
冬氨酸、精氨酸或水解酪蛋白等有机物 ,会导致愈伤组
织的褐化现象加重 ,最终生长停滞。将 MS培养基中的
大量元素 NH4NO3用量从 1. 9 g /L提高到 2. 5 g /L,
会导致愈伤组织褐化现象加重 ,生长停滞; 如将
N H4NO3用量减少为 0. 3 g /L,则使愈伤组织生长速
度减慢 ,趋向干燥 ,产生的粘液减少 ,愈伤组织再生植
株频率也下降。在继代培养基中添加 0. 3% NaCl,未
见对愈伤组织生长有明显的促进作用。
2. 4　植株再生
通过诱导和继代培养获得了两种不同类型的愈
伤组织。 一类为乳白色、松软、表面光滑的非胚性愈
伤组织 ;另一类为绿色、致密、表面有结节状的胚性
愈伤组织。将获得的乳白色愈伤组织转接到分化培
养基上 14～ 21 d后 ,部分愈伤组织便产生绿芽点 ,
进而产生再生植株 (图 1C,图 1D) ,再生频率平均为
3%。将获得的绿色致密的愈伤组织转接到分化培养
基上 , 100%能再生出植株。
将在含 BA的分化培养基上未产生绿芽点的愈
伤组织转接于含苯基脲类细胞分裂素 CPPU的培
养基中 ,可获得绿芽点 ,并再生出植株 ,表明 CPPU
的效果优于 BA。在分化培养基中添加 AgNO3 ,对愈
伤组织再生植株则无明显的促进作用。
将获得的再生植株接种于不含任何激素的 1 /2 M S
培养基或含 10. 0 mg /L IBA、 0. 1 mg /L KT、 5 g /L
活性炭的培养基中 , 7～ 14 d后开始生根 (图 1E) , 30 d
后绝大多数再生植株生根 ,生根率为 60%～ 100% 。
3　讨 论
狐米草种子自然发芽率很低 ,仅为 5%～ 10% 。
本研究在培养基中添加适量的 GA3或 2, 4-D、 IAA,
结果将发芽率提高到 20%左右 ,表明激素是调控狐
米草发芽率的重要因素 ,其作用机理有待探明。而将
添加激素后仍不能萌发的种子用刀片剖开 ,其中约
50%的种子能萌发 ,可见种子外壳的阻隔也是影响
狐米草发芽的重要因素。
以 Aga r作培养基固化剂 ,导致愈伤组织褐化 ,
从而降低愈伤组织诱导频率 ,抑制愈伤组织生长 ;而
以 Gelri te或 Phy tagel取代 Agar作培养基固化剂 ,
愈伤组织褐化现象则消失 ,愈伤组织生长较快。上述
现象说明 Agar中可能含有对狐米草愈伤组织有害
的成分 ,诱使狐米草愈伤组织细胞分泌有毒产物 ,进
而抑制了愈伤组织生长。
本研究结果表明 ,狐米草与许多禾本科植物一
样 ,都可以获得胚性愈伤组织 ,但狐米草的胚性愈伤
组织比较特殊。 例如玉米、水稻、小麦等作物的胚性
愈伤组织为淡黄色、颗粒状 [5～ 7 ] ,而狐米草胚性愈伤
组织则为绿色、结节状。这种特殊性是否是耐盐植物
的特点 ,还是仅仅是物种不同的缘故 ,尚有待进一步
研究。狐米草胚性愈伤组织的获得 ,为细胞悬浮培养
提供了条件 ,还为分离具有全能性的原生质体提供
146 江 苏 农 业 学 报 　 2000年 第 16卷 第 3期
了良好的材料。
参考文献:
[1 ]　 Li XG, Selisk ar DM, Moga JA, et al. Plant reg eneration f rom
callus of sal t marsh hay, Spar tina patens, and i ts cellu lar-based
salt tolerance [ J] . Aquatic Botany, 1995, 51: 103～ 113
[2 ]　 Mu rashige T, Sk oog FA. Revised medium for rapid g row th and
bioas says wi th tobacco tis sue cul tu re[ J ]. Physiol Plan t, 1962,
15: 463～ 497
[3 ]　 Gamborg O L, Mil ler RA, Ojima K. Nut rient requi rem ents of
suspension cul tu re of soybean root cell s [ J ] . Exp Cell Res,
1968, 50: 150～ 158
[ 4 ]　 Sch enk RU, Hild ebrandt AC. Medium and techniques fo r in-
duction and g row th of monoco tyledonous and dicotyledonous
plan t cell cul tures [ J] . Can J Bo t, 1972, 50: 199～ 204
[5 ]　王海波 ,方　仁 ,王　培 ,等 . 小麦胚性细胞系的建立及原生质
体培养 [ J] .作物杂志 , 1989, ( 3): 26～ 29
[6 ]　颜秋生 ,张雪琴 . 水稻原生质体培养 [ A] . 见:颜昌敬 ,主编 .
农作物组织培养 [M ] .上海:上海科学技术出版社 , 1991. 129～
134
[7 ]　孙世孟 ,宋再华 ,何忠诚 ,等 . 玉米组织培养及其遗传转化的研
究进展 [ J] .莱阳农学院学报 , 1995, 12( 1): 31～ 36
科技短讯
“蛋鸡规模化养殖场生产管理系统技术研究与开发”专题的研究进展
陆昌华 ,　王立方 ,　胡肄农
(江苏省农业科学院农业现代化研究所 ,南京 210014)
Research Progress in the Subject of Studying and Developing Produc-
tion Management System in A Large Scale Egg Factory
LU Changhua,　W ANG Lifang ,　 HU Yinong
( Inst itute of Agr icul tural Mod ernizat ion , Jiang su Academy of Agr icul tural Sciences ,N an jin g 210014)
“蛋鸡规模化养殖场生产管理系统技术研究与开发”专题是“九五”国家重中之重科技攻关项目 “主要畜禽规模化养殖及
产业化技术研究与开发”的一个重要组成部分 ,受国家科学技术部委托 ,由江苏省农业科学院农业现代化研究所主持承担。
调查结果显示 ,蛋鸡防疫隔离条件差 ,疫病严重 ;管理环境、设备更新与信息管理落后 ,已成为制约国内大型养鸡场发展
的“瓶颈”。 国内众多大型养鸡场虽然养的是世界一流鸡种 ,用的是当代先进的配合饲料和药品疫苗 ,而蛋鸡生产水平与劳动
生产率却明显落后于世界发达国家。为此 ,我们设计了数据库、专家系统与自动化监控技术相结合的规模化 20× 104羽蛋鸡场
生产管理系统 ,探索建设养鸡场生产网络信息系统的技术和方法。 在已有的“七五”《一个机械化蛋鸡生产电脑辅助管理系统》
和“八五”《鸡常见疾病临床诊断专家系统》等成果的基础上 ,集科学计算、数据分析、绘图处理、人工智能和自动化监控技术于
一体 ,已建成可在单机或网络上运行的两种管理系统。 该系统不仅可提高我国规模化蛋鸡企业的生产水平 ,为科学饲养与鸡
病防治提供早期预测和专家咨询 ,而且可为管理人员进行蛋鸡生产动态管理及科学决策提供依据。
该套系统包括信息管理系统 (生产统计 、生产计划、饲料库存管理、优化饲料配方、免疫接种备忘等子系统 )、专家系统和
以鸡舍为单元的自动化监控系统 ,已在北京、上海和南京等规模化养鸡场示范应用。用户报告表明: ①南京象山蛋鸡场实施后
取得良好的经济效益 , 1999年 ,全群产蛋率提高 8% ,死亡率下降 5% ,饲料成本每公斤节省 0. 5元。②中荷农业部-畜牧培训示
范中心实施后 ,系统运行良好 ,操作人员感到简便、易懂、实用 ,具有灵活的查询手段以及多种输出途径 ,可以进行日报、周报、
月报、季报、年报的查询和打印输出 ,绘制各项生产性能曲线 ,设有联机帮助系统。 ③北京市华都峪口禽业有限责任公司结合
本公司实际情况在试用过程中 ,重新设计并添加了新内容:孵化厂管理 ,饲料配方与库存的自动连接 ,雏鸡、鸡产品销售管理 ,
销售代理商管理等 ,系统运行良好 ,软件设计合理。
当前 ,该专题正在报请验收和鉴定。 其研究成果和内容得到国家“ 863”计划“ 306” (智能计算机系统 )主题负责人及专家们
的关注 ,有望被吸纳为“ 863”的推广项目。 在此基础上 ,“十五”除与有关养鸡企业联合申报“蛋鸡产业化管理及智能系统研究
与示范”项目外 ,还受国家科技部、农业部委托 ,撰写“十五”农业科技重大建议书“现代集约高效畜禽养殖业生产管理智能信
息系统” ,将研究从蛋鸡拓展到猪和奶牛 ,并对“七五”、“八五”和“九五”已取得的成果进行系统集成 ,研制一个能满足高层管理
者使用的“傻瓜型”生产管理智能信息系统。
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