全 文 ：微 生 物 学 报 27 ( l ) : 6 4一6 8 , 1 9 8 7
A
e t . 月廿` e or 材01 0州 e o s 『。 亡e 。
辽东恺木根瘤内生菌的分离和培养条件的研究
袁 长 芳
(山西省生物研究所 , 太原 )
用四氧化饿处理法 ,从辽东档木的根瘤中获得纯培养内生菌株 A , 11。 该菌株的菌丝体和
抱囊形态特征类似于已报道的恺木属内生菌株 。 泡囊在无氮限定培养液中诱导形成 。 用 sA l
菌株侵染原宿主实生苗根部 , 可形成具有固氮活性的根瘤 ,活性可达 4 3 o . o n m o l c : H . / g 根瘤
鲜重 · 分钟 。 该菌株生长最适碳源为丙酸 ,最适氮源为酪蛋白水解物 ,最适 p “ 为 6 . 8 , 最适
温度为 30 ℃ 。
关锐词 弗兰克氏 菌 ; 固氮 ;辽东恺木
目前 , 已从恺木属 ( lA nu , ) 的多种植
物根瘤分离得到内生菌纯培养物。 一 ,1 , 尚未
见到从辽东恺木根瘤中分 离内生 菌 的报
道。 作者用四氧化饿处理法 , 从其根瘤中
获得 A sl l 菌株 ,并对其形态特征和培养条
件进行了试验和观察 , 结果如下 。
材 料 和 方 法
(一 ) 灿 1 菌株的分离
辽东恺木 (河 l , ,` 5 r i占i r i c a F i s c h ) 根瘤采自山
东泰山林场三岔分场 。 参照 N or m an d ` , ’ 分离方
法 ,用 QM od 培养基进行液体培养 , 两星期获得
内生菌纯培养物 。 内生菌的扫描电镜制片 , 参照
N e w e o m b t
, ’ 等人的方法 。
回接试验 , 水培无菌实生苗 , 用 sA l 菌株纯
培养物侵染其根部 ,即可形成根瘤。 在无氮限定
培养液「, 1中培养 7 天的纯培养物 , 用乙炔还原法
测定其固氮酶活性 。
(二 ) 培养条件试驻
基础培养液 ( g / L ) : K : H p认 0 . 3 , N a H : P o ;
0
.
2 , K C I 0
.
2
,
M g s o 二 7 H : 0 0 . 2 , C a C O , 0 . 1 :
加微量元素和柠檬酸铁 “ ’ ; 生物素 0 · 。 0 ;2 碳氮
源按试验要求而定 , p H 6 · 8 。
培养周期一般 20 天 , 菌体生长情况分别测
定各组合菌休蛋白 , 按 oL w r y “ ’ 等人方法进行 ,
每一组合设 3 个重复 , 测定后取平均值 , 试验全
部用液体培养。
结 果 和 讨 论
(一 ) A sl l 菌株的甚本特征
该菌株类似于蒋建德等人 〔 , , 分离的四
川恺木内生菌株。 菌丝分枝稀疏 , 平展 , 横
隔不甚明显 , 粗细不匀 , 但很少见中间膨
大 。 菌丝直径 0 . 6一 1 . 5拼m (图 l一 A 、 C ) 。
特征性抱囊稀疏 , 多生于菌丝顶端 , 也有
间生 , 形状不规则 (图 1一 B一 D ) 。 抱子呈不
规则多面体 , 直径 2产m 。 在有氮培养液中
不形成泡囊 , 只有在无氮限定培养液中 ,才
能形成泡囊。 圆形泡囊着生于长 1。产m 左
右的泡囊柄上 , 其表面光滑 , 直径 3拌m 左
右。 在固体 Q M od 培养基上 , 培养一月多 ,
菌落呈白色 ,直径 1一 Zm m , 圆形 , 微突起 ,
表面湿润有光泽 , 无可溶性色素。
用 A sl l 菌株培养物侵染原宿主辽东
恺木无菌实生苗根部 , 10 天后可结瘤 , 根
瘤生长 1 个月 , 测定其固氮酶活性 (乙炔还
原 )可达 4 3 0 . 0 n m o l C ZH ; / g 根瘤鲜重 · 分
钟。
经无氮限定培养液培养 , 菌体产生固
氮泡囊 , 测定固氮酶活性为 3 o . s n m o l e : H 。 /
本文于 1 9 8 4 年 10 月 3 1 日收到。
DOI : 10. 13343 /j . cnki . wsxb. 1987. 01. 009
1 期 袁长芳 : 辽东抱木根瘤内生菌的分离和培养条件的研究
,
)
、 飞 图 1 A s l l 菌株
F i g
。
1 S t r a i n A s l l
^
. 菌丝体 ( 又 4 , 忿0 0 ) ; B ·间生抱襄 ( 减 8 , 6 0 0 ) ; C . 梨形抱襄 ( 火 l , 00 0 ) ; D ·端生抱班 ( 火 ` , 0 0 0 ) ;
.E 抱子 ( K 7 , 2。。;) F . 用 A sl l 菌株回接辽东恺木幼苗形成的根瘤。
^
.
H y p h a e ; B
.
nI t e r c a l a r y s p o r an 砂u m ; c · p e a r , h a p e d s oP r . 乡um ; D
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Ro o t n od
u j e s o f 概 d认乎 o f 汉 · ,i b泣r’c 口 认 o e u la t记 w i th A s l l s r r a i n .
天 · 15 m l培养液。 用基础培养液 , 氮源为 N .H CI 1 . 0 9 1
(二 ) 不祠碳派对菌株生长的影响 L, 碳源如表 l 中所列 出的 。 50 ml 三角瓶 ,
微 生 物 学 报 27 卷巧6 字 狱 刁 君
. 口. . . . . . . . . . . . . .
农 1
1
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a b l e 1C o x n pa i ros n
A . 1 1曲株在不同砚派的培井液中生长 l 的比较
o 上 g ro w t h o f F , a 。人毖a A s l l i n e u l t u r a l 5 0 玉u it o n e o n t a in i n只 , a r i o u s
e a t b o n s o u r e e s a f et r e己 it v a t i o n t o r 2 0 d a y s
碳 原 浓度 ( g l L ) 菌体蛋白 …C 二嚣。 , 。季二 浓度 ( R jL ) 菌体蛋白C a r b o 几 s o u r e e C o n e e n t r a t i o n ( ” g /1 5: , , l ) e e一l C o n e e n t r a t i o 。 (补9 115二生) 〔 l e l lP r o t e i n P r o t e l n葡萄糖 l 0 3 1 。 5 } , 萄。 酸钠 5 40 。 7
G l u e o s
e
}
N
a一 G, u ` o n , c a c `d
蔗 塘 l 0 2 7 。 0
}
。 。 酸钠 l 5 8 。 2
S u e r o s l
1
N a 一 s u c c `n `C “ c `d
麦芽塘 王0 10 。 0
}
丙酸 l 2 60 。 4
M
a l t o s e
}
P , o p , o n , c “ c` d
乳 艳 5 9。 7
}
。 酸钠 l 1 6 6 。 6
L a c t o s e }半乳塘 5 4 1 。 5 i
_ .甘油 . 2 3 5。 6
D
一 G a l a e t o s e }
` ; y e e r 。 ,
甘露箱 5 3 1 。 7 { 吐温
一
8。 2 2 1 2。 8
D 一 M a n 几 o s e }
T w
。 。 n 一 、 。
甘龙醉 5 2 7 。 7
}
山 , 。 , 9。 0
M a n “ i t o l }
木 塘 写 8 。 9
}
苹果酸 l 32 。 7
D
一
X y jo s e
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鼠李塘 5 , 1一
1{}
_ _ 无碳源 0 7。 月
L , R l t a n 创。 o s e {}
N , , c a , b on
s o o r e e
农 2 碳派浓度对 , 株生长的形晌 (菌体蛋白 邵 /1 5m l)
T a b l e 2 1
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e t t e e t o 士 e o n e e n t r a t i o n o f c a r b o n s o u r e e s on g r o w t h s t r a i n A s l l
a t t e r e u l t i v a it o n fo r 20 d a y s
门 . . . . . . . . . . . .自 . .。 源
}
碳源浓度 C O n`一 ` r ·“ 。 n (: `L , _
C a r b o n S o u r C e S 1 1 1 _ I 井 1 1 _— 卜止一 - {一二土一 }一二立一卜一兰一一阵一全兰一卜一一立立一 }一二二吐温 一 8 0 1 0 , ! : , ` l , : , 1 , , : ! , n , : 1 . o J : l 一 。 a 。月 , O 氏 1 0 . , 1 J l . U 毛 , 梦 一 ` 毛 百 , 一 j 卜 二 U J 一 J I ` O , 一 矛 l ` U 尹 . 甘一止兰竺型一一{— }— I— f— {— }— }—丙 故 { : , , l , o , } , 。 , , 1 : 二 。 , 】 , 。 j , 1 . , 二 二 1 . 。 `】 、 _ _ 二 _ 二一 _ 一 二 1 1 1 ` . J ` , V . , 1 . U ` . ` l ` 夕 J . , l 石 U , . ` 1 1 , , . J 哪 三 U , , `二竺岁竺兰兰匕 {— {— }— (— {— }— }-—醋蔽 钠 , , 八 : l , , , 1 o n l , n ` , } . 一 L 1 . 八 , , ! , 。 :、 , ` _ ~ ` l 几 甘 . 夕 l ` 二 . ` 1 Z V . U 1 I U U . , 1 1 “ . U I 孟 U ` . J 盈 , 口 . J月 a 一八 ` e ` a Le l } { } ! } l
装人 巧 m l 培养液 , 接种后置 29 ℃ 温箱中
培养 20 天 , 离心收集菌体 , 测定菌体蛋白
量 , 结果见表 l 。
表 1 表明 ,该菌株最适碳源为丙酸 , 其
次为吐温一 80 和醋酸钠 , 微弱利用葡萄糖 、
蔗糖 、 半乳糖 、甘露糖 、 甘露醇 、 鼠李糖 、 葡
萄搪酸钠 、 墟泊酸钠 、 甘油或苹果酸 , 不利
用麦芽糖 、乳糖 、 木糖或山梨糖 。
(三 ) 碳源浓度对菌株生长的影响
以丙酸 、 吐温 一80 、 醋酸钠作为碳源 ,
进行浓度试验 。 用基础培养液 , 氮源 为
N H
4 C I 1
.
0 9 / L
, 结果见表 2。 、
表 2指 出 , 菌体蛋白量随吐温一 80 浓度
增加而增加 , 一般加人量 2 . 0一 5 . 0 9 / L 适
的1 期 袁长芳 : 辽东恺木根瘤内生菌的分离和培养条件的研究
表 3A以1 菌株在不同氮谏中生长比较
T a l
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l e 31
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、 e 〔 o n , p a r i s o n o f g r o w t h o f A s l l V a r ! O U S
n l t T o g e n s o u r c e s a f t e r c u l t i
v j t i o n 求 t h e r n e d i a e o n t a in in g2 0 d a y s
、 氮濒 浓度 (
g / L ) 氮源 菌体蛋 白
N i t r 。 只 e n s o u r c e C O一飞 C e n 一 t r a t l o n
菌体 蛋白
C e l l p r o t e i n
(拼 g /一s m l )
N i t r o 只e n s o u r e e
浓度 ( R /L )
C o n e e n t r a t i o n
C r l l p r
(, t e i n
(尸 g八 5`、 , l )
N H 一C I l
。
0 5 5
.
8
多蛋白陈
l , o l y p 巴一〕 t u n e 5
。
0 1 q l
.
7
N H
一 A e l 。 0 51
.
7
牛肉膏 B e e士
e X t r a C t
5
。
0 1 5 6
.
2
N H
一 t l : p o -
。
O 1 0 7
。
5
酵母膏 Y e a 、 t
e X t r a C t
5
。
0.卜.
( N H
.
)
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。
0 55
。
8
酩素
C a s e i n
l
。
0 21 ()
。
0
N H
一
N O
、
l
。
0 79
。
3 西各蛋白水解物
C 扭 s a m in o a e id
l
。
0 2 6 4
。
0
( N H
.
)
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M
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0
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0 2 9
.
1
谷氨 酸
G lu t a m i e a e id
0
。
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.
0
无氮源
N i l n i t r o g e n 0 54
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一) H 对 A s l l 菌株生长的形响
T h e e f fe c t o f p H o f e u l t u r a l
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l 菌株生长的影响
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图 2 温度对 A sl
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Z r h e e f f e c t
、 、 g r o w t h o f s t r a in
t e l ` I P e r a t u r e o n
A s l l 50 ] u ti o n o n g r o w t h o f s t r a in A s l l
、
宜 。 丙酸浓度不宜过高 , 1 . 0一 .2 0 9 /L 为
宜 。 醋酸钠的适宜浓度与丙酸相近 。
( 四 ) A . I 菌株对不同氮源的利用
用基础培养液 , 碳源加丙酸 1 . 0 9 / L ,氮
源如表 3 , 其它条件同前述 。
表 3 说明 , N H ; H护 q 为较好的无机
氮源 。 有机氮源以酪蛋白水解物最好 , 其
次为酪素 、 多蛋 白陈 、 牛肉育 , 这说明该菌
株蛋白酶活性较高 , 而糖酵解能力退化 , 以
致对多数糖利用不佳 , 但特别适宜利用三
梭酸循环中的某几种有机酸 , 能特异地利
用吐温 , 且作为一种良好的碳源 。
6 8 微 生 物 学 报 7 2卷
(五 ) 温度对菌株生长的影响
用基础培养液 , 碳源为丙酸 1 . 0 9 / L ,氮
源为 N H ; lC l .帅 / L , 接种后分别置不同温
度下培养 14 天 , 生长情况见图 2。
图 2表明 ,在 20 一 30 ℃温度范围内 , 菌
体均能生长 , 37 ℃则几乎不生长 , 最适生
长温度为 29 一 3 ℃ 。
(六 ) 培养液 p H 对菌株生长的影响
用基础培养液 , 碳源为丙酸 1 . 。灯 L ,氮
源为 N H 、 CI 1 . 0 9 / L , 灭菌前分别用 p H计调
成 5 . 5 、 6 . 0 、 6 . 5 、 7 . 0 、 7 . 5 、 8 . 0 六种不同 p H
值 , 灭菌后微调 。 接种后置 29 ℃ 温箱中培
养 14 天 , 结果如图 3 。
sA l 菌株对 p H 的适应范围较广 , p H
,
`
5一 8 . 0都可生长 , 但最适 p H 为 7 . 0。
参 考 文 献
蒋建德等: 微生物学很 , 2 4 ( l ) : 弓7一 40 , 19 8 4 ,
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G
.
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2 6 : 1 16 6一 10 7 1 , 19 8 0 .
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B u r g g r a a f , A
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: P l a n , a 行 d 5 0 11 6 1 :
15 7一 16 8 , 19 8 1 .
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[ 9 ]
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W h e n t h e
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才 I n u s s i bi r i c a w e r e i n f e c t e d by s t r a i n A s l l,
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n i r r o g e n s o t x r c e s r e q :一i r e n : e n t , e f f o e t o f e u l: u
-
r a l t em P e r a t u r e a n d p H o n g r o w t h o f t h e o r
·
g a n is m w e r
e s t u d ie d
.
T h e o P t i , n t l r l l e a r卜均 n
s o u r e e 15 p r o P io n i e a e i d
.
T h e o P t im u m n i t r o
·
g e n s o u r e e 15 c a s a m i n o a e i d
.
T h e o P t im u 一n P H
a n d t e m Pe r a tu r e f o r g r o w t h o f A s l l a r e 6
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F r a n交, a ,. N i t r o g e n f i x a t i o n : A l n u : : i bi r ic J