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长春花黄素单加氧酶基因的克隆与组织表达分析



全 文 :书第32卷第4期
2014年8月
上 海 交 通 大 学 学 报 (农 业 科 学 版)
JOURNAL OF SHANGHAI JIAOTONG UNIVERSITY(AGRICULTURAL SCIENCE)
Vol.32No.4
  Aug.2014
文章编号:1671-9964(2014)04-0001-07  DOI:10.3969/J.ISSN.1671-9964.2014.04.001
收稿日期:2013-11-14
基金项目:国家高技术研究发展计划(863)(2011AA100605)
作者简介:许 菲(1989-),女,硕士生,研究方向:植物代谢基因工程,E-mail:thewinterbest@yeah.net;
赵静雅(1974-)为本文通讯作者,女,硕士生导师,副教授,研究方向:植物代谢基因工程,E-mail:zhaojy0825@gmail.com
长春花黄素单加氧酶基因的克隆与组织表达分析
许 菲,张 颖,潘琪芳,唐克轩,赵静雅
(上海交通大学 农业与生物学院,上海200240)
摘 要:利用RACE方法克隆到长春花中编码黄素单加氧酶的基因(YUCCA),YUCCA(YUC)是
植物生长素吲哚乙酸(IAA)合成通路上的关键酶。长春花YUC(CrYUC,GeneBank登陆号
KF827426)cDNA序列全长1 863bp,包括编码405个氨基酸的1 218bp开放阅读框、5’非编码
区、3’非编码区和poly A尾巴;其相应的DNA中有3个内含子。生物信息学分析结果显示:预测
CrYUC的分子量为45.3kDa,等电点为9.01;有16个磷酸化活性位点;与其他物种的YUC 有较
高相似度。初步表达分析发现:YUC 在长春花的叶片、花、根及茎中均有表达,且茎及叶片中表达
量高于花及根中表达量。
关键词:长春花;黄素单加氧酶基因;吲哚乙酸合成途径;基因克隆;组织表达分析
中图分类号:Q943    文献标识码:A
Cloning and Tissue Expression of Flavin Monooxygenase YUC
Gene from Catharanthus roseus
XU Fei,ZHANG Ying,PAN Qi-fang,TANG Ke-xuan,ZHAO Jing-ya
(School of Agriculture and Biology,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,China)
Abstract:In this study,the YUCCA gene which encodes flavin monooxygenase(named as CrYUC,
GeneBank number:KF827426)was cloned from Catharanthus roseus.YUC plays an important role in the
auxin biosynthesis.The ful length of CrYUCcDNA is 1 863bp including 1 218bp open reading frame
which encodes 405amino acids,3’,5’-unencoding area and Poly A tail area.The DNA sequence of CrYUC
contains three introns.The results of biovinformation analysis showed that the molecular weight of CrYUC
was 45.3and the isoelectric point was 9.01.There was 16phosphorylation activity sites and CrYUC was
homologous with YUCs of other plant species.The RT-qPCR result showed that CrYUCmRNA existed in
leaf,flower,stem and root.But the expression level of stem and leaf were higher than that of root and
flower.
Key words:Catharanthus roseus;Flavin monooxygenase YUCgene;IAA synthetic pathway;clone;tissue
expression
   长 春 花 (Catharanthus roseus)属 夹 竹 桃 科
(Apocynaceae)长春花属(Catharanthus),是一种有名
的药用植物。长春花(C.roseus)代谢过程中产生的萜
类吲哚生物碱(Terpenoid indole alkaloids-TIAs,一类
上 海 交 通 大 学 学 报 (农 业 科 学 版) 第32卷
次生代谢物,是以异戊二烯为结构单元组成的,含芳
香杂环的生物碱),可用于治疗恶性淋巴肿瘤、急性淋
巴细胞型白血病等其他癌症,是应用较广的抗癌药
物[1]。这些具有药用价值的TIAs在长春花植物体内
的含量极低,其中长春碱(vinblastine)的含量仅为
0.01~0.04mg/g[2]。此外长春花中生物碱的合成具
有组织特异性,长春碱和长春新碱(vincristine)仅在叶
片中合成,并且其含量受外界环境和生长周期的影
响[3],导致从长春花中提取的天然药物的价格非常
高。日益增长的对长春花中有效抗病成分的需求和
植物体内较低产出率的冲突,促使我们加深对长春花
的了解,加快对其研究的速度,以找到有效的提高其
抗病成分产量的手段。
天然长春花TIAs的实际生产方法是将植株地
上部分全部收割,烘干后提取其中有效抗病物质[4]。
因此种植区单位面积的TIAs产出量取决于以下两
个因素,即植株地上部分的生物量及植株中 TIAs
的含量。生长素(auxin)作为植物的内源激素,参与
诸多植物的生长发育过程,包括根和茎的发育、器官
衰老、维管组织的形成等[5]。因此,若通过提高长春
花体内生长素含量,增大长春花地上部分的生物量,
进而有望提高TIAs单位面积的产出量。吲哚乙酸
(indole-3-acetic acid,IAA)是植物产生的主要生长
素,YUCCA (YUC)基因编码的黄素单加氧酶
(flavin monooxygenase,FMO)是参与催化IAA合
成的最重要的酶之一[6-7]。研究发现,YUC 过量表
达,可通过促进生长素的合成,引起下胚轴的伸
长[8]。目前,拟南芥、番茄[9]、矮牵牛[10]等中编码
FMO的基因已被克隆研究,但未见长春花中关于
此基因的研究。
为了解长春花中YUC 这一基因,本实验通过
cDNA末端快速克隆(rapid amplification of cDNA
ends,RACE)技术,克隆了长春花中CrYUC基因,
并对该基因进行了生物信息学分析。利用实时荧光
定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)
法,测定了CrYUC在长春花不同部位的表达量,为
将来研究CrYUC及内源生长素对长春花生物量及
TIAs代谢的影响提供了理论基础。
1 材料和方法
1.1 材料
选用的长春花(C.roseus)(太平洋樱桃红系列)
种子购自美国保尔种子有限公司。长春花种子经消
毒后置于 MS培养基上培养,待长出2片真叶后移
栽到土壤中,置于温室里培育。
1.2 方法
1.2.1 长春花RNA的提取及反转录反应
用RNA prep pure植物总 RNA 提取试剂盒
(购自天根生化科技有限公司)提取长春花植株中总
RNA;随后按照 PrimeScript? RT-PCR Kit(购自
Takara公司)步骤,将RNA反转录成cDNA,用于
基因克隆及基因表达量分析。
1.2.2 CrYUC基因中间序列的克隆
查找 NCBI数据库中已登陆的多个物种的
YUC蛋白序列,用多序列比对软件 Clustal X
(1.81)进行比对,找到同源性高的区域。根据同源
区域及长春花密码子偏好性,设计中间序列的简并
引物YUC1-f和YUC1-r、YUC2-f和YUC2-r(见表
1)。以反转录而得的cDNA为模版,rTaq酶(购自
Takara公司)为扩增酶,分别用YUC1-f和YUC1-r、
YUC2-f和YUC2-r 2对引物进行巢式PCR。第1
轮PCR反应条件为:94℃3min;94℃30s,50℃
30s,72℃1min,30个循环;72℃10min。第2轮
PCR的模板为第1轮PCR产物,反应条件:94℃3
min;94℃30s,52℃30s,72℃1min,30个循环;
72℃10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后
回收(回收试剂盒购自 GENOMED公司),连接到
pMD18-T载体上,转化到大肠杆菌后送上海英竣公
司测序。
1.2.3 CrYUC基因5′端的克隆
利用 5′RACE 试 剂 盒 (SMARTTM RACE
cDNA Amplification Kit,购自 Clontech公司),按
照试剂盒提供的步骤,先将 RNA 反转录成5′-
RACE ready-cDNA,待后续的5′-末端克隆用。根
据得到的CrYUC基因的中间序列,设计进行5′-末
端克隆用的巢式PCR引物YUC-5-1和YUC-5-2(表
1)。第1轮PCR以5′-RACE ready-cDNA为模板,
引物为接头引物 UPM(试剂盒提供)和特异引物
YUC-5-1,扩增酶为LA Taq酶(Takara公司),反应
条件为94℃3min;94℃30s,68℃30s,72℃2
min,30个循环;72℃10min。第2轮PCR的模板
为第1轮PCR产物,引物为 NUP(试剂盒提供)和
YUC-5-2,反应条件:94℃3min;94℃30s,68℃
30s,72℃2min,35个循环;72℃10min。按照
1.2.2的方法,进行目的片段的回收及测序。
1.2.4 CrYUC基因3′端的克隆
利用3′-Ful RACE Core Set试剂盒(TaKaRa

第4期 许 菲,等:长春花黄素单加氧酶基因的克隆与组织表达分析
公司),按照试剂盒提供的步骤,先将RNA反转录
成3′-RACE ready-cDNA,待后续的3′-末端克隆
用。根据得到的CrYUC基因的中间序列,设计进
行3′-末端克隆用的巢式 PCR 引物YUC-3-1和
YUC-3-2(表1)。第1轮PCR以3′-RACE ready-
cDNA为模板,引物为3′-RACE Outer Primer(试剂
盒提供)和特异引物YUC-3-1,扩增酶为 LA Taq
酶,反应条件为94℃3min;94℃30s,56℃30s,
72℃2min,30个循环;72℃10min。第2轮PCR
的模板为第1轮PCR产物,引物为3′-RACE Inner
Primer(试剂盒提供)和YUC-3-2,反应条件:94℃3
min;94℃30s,60℃30s,72℃2min,35个循环;
72℃10min。按照1.2.2的方法,进行目的片段的
回收及测序。
1.2.5 CrYUC基因cDNA全长的拼接与克隆
将中间序列及RACE扩增得到的5′-末端和3′-
末端序列进行拼接,获得长春花YUC 基因的全长
cDNA序列。根据拼接序列,设计完整cDNA序列
的引物YUC-ful-f和YUC-ful-r(表1),扩增cDNA
全长。以总RNA反转录成的cDNA为PCR模版,
LA Taq酶为扩增酶,反应条件:94℃3min;94℃
30s,56℃30s,72℃2min 30s,30个循环;72℃
10min。按照1.2.2的方法,进行目的片段的回收
及测序。
1.2.6 CrYUC基因DNA全长的克隆
用 CTAB 法提取长春花中总 DNA。以总
DNA为PCR模版,扩增DNA全长。引物为YUC-
ful-f和YUC-ful-r,LA Taq酶为扩增酶,反应条
件:94℃3min;94℃30s,56℃30s,72℃5min,
30个循环;72℃10min。按照1.2.2的方法,进行
目的片段的回收及测序。测序结果用 Vector NTI
11软件,与cDNA序列进行比对,确定内含子个数
及序列。
1.2.7 CrYUC基因的生物信息学分析
在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
上进行CrYUC基因开放阅读框(Open reading frame,
ORF)的查找及相应的氨基酸序列;利用Compute pI/
Mw tool-ExPASy(http://web.expasy.org/compute_
pi/)分析CrYUC蛋白的分子量和等电点;利用在线
软 件 NetPHos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/
services/NetPhos/)分析蛋白的磷酸化作用位点;利用
在线分析工具SOPMA(http://www.expasy.org/
tools)进行二级结构的分析;使用软件Phyre2(http://
www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=
index)进行蛋白质三级结构预测。利用 MEGA 6软
件,采用邻近(Neighbor-joining,NJ)法,根据核苷酸序
列构建YUC的系统发育进化树。
表1 长春花YUC基因克隆及分析所用引物
Tab.1 Primers used in the cloning and analysis of YUCin C.roseus
引物Primer 引物序列Primer sequence
YUC1-f  5′-ATTRTTGGWGCWGGWCCWKCWGGWYTKGCW-3′
YUC1-r  5′-TCCATWCCAGARTTWCCRCAWCCAACAACMARAAC-3′
YUC2-f  5′-TAYGATAGRYTKAARYTKCAYYTK-3′
YUC2-r  5′-TTYTCWCCWGTWGCAACAAYMAR-3′
YUC-5-1  5′-TCTTCAGTTTTAACCCTCCAAGC-3′
YUC-5-2  5′-CCAATAACATGATCAAACTCAGCAT-3′
YUC-3-1  5′-TCTGTGAGATTCCTTTACTTGGT-3′
YUC-3-2  5′-ATTGTGAGTATATTTCAAAGTGG-3′
YUC-ful-f  5′-ACATGGGGAACAAAACAGAGAGA-3′
YUC-ful-r  5′-TGGAAAAAAAAAAAGTGTGTTTCTT-3′
YUC-RT-f  5′-ATGGGAGAGTGGTTCATACAAGT-3′
YUC-RT-r  5′-TGTGAGGAGTGGCATTGTGTCTA-3′
Rsp9-f  5′-TCCACCATGCCAGAGTGCTCATTAGG-3′
Rsp9-r  5′-TCCATCACCACCAGATGCCTTCTTCG-3′

上 海 交 通 大 学 学 报 (农 业 科 学 版) 第32卷
1.2.8 实时荧光定量PCR(Real-time quantitative
PCR,RT-qPCR)进行基因表达量分析
分别提取长春花植株不同生长状态的叶(幼
叶、中 叶、老 叶)和 花 (花 蕾、盛 花)、根 及 茎 中
RNA,并反转录成cDNA,用于进行YUC在长春花
不同部位的表达分析。根据CrYUC的cDNA序
列,设 计 用 于 RT-qPCR 的 引 物:YUC-RT-f和
YUC-RT-r(表 1)。以 长 春 花 组 成 型 表 达 基 因
RPS9作为内参,RT-qPCR按照SuperReal PreMix
Plus(SYBR Green)试剂盒(购自天根公司)说明进
行,反应条件:95℃15min;95℃10s,58℃20
s,72℃20s,40个循环。采用Ct比较法进行基因
的相对表达量分析。
2 结果与分析
2.1 CrYUC基因的克隆
以长春花cDNA为模板,利用简并引物进行巢
式PCR,得到260bp的中间片段(图1,A),经NCBI
的Blast比对,该序列与其他物种的YUC 有较高的
相似度,确定该序列为YUC 基因cDNA部分片段。
以中间片段为依据,进行5′-RACE和3′-RACE,分
别得到763bp(图1,B)和1 131bp片段(图1,C)。
将所克隆到的5′-末端、中间片段和3′-末端序列进
行拼接,得到1 863bp的cDNA序列,利用 NCBI
的ORF finder工具,找到该序列包含完整的ORF。
根据拼接得到的序列,设计全长cDNA 的引物:
YUC-ful-f和YUC-ful-r,扩增得到1 831bp的片
段(图1,D),该片段的测序结果与拼接序列一致。
图1 长春花YUC基因的克隆片段
Fig.1 Cloning of YUCin C.roseus
    CrYUC 基 因 的 cDNA 全 长 1 863 bp
(GeneBank登陆号 KF827426),包括1 218bp的
ORF,编码405个氨基酸(图2)。以DNA为模板,
YUC-ful-f和YUC-ful-r为引物,扩增到YUC 基因
的DNA片度,测序结果用Vector NTI 11软件比对
后发现,该基因序列包含3个内含子。
2.2 CrYUC的生物信息学分析
利用软件分析CrYUC基因编码的蛋白,其分
子量为45.3kDa,等电点为9.01,为将来分离纯化
长春花中的YUC蛋白提供了理论参考。磷酸化是
蛋白质翻译后修饰之一,参与调控信号转导、基因表
达等生命活动[11]。NetPHos 2.0软件预测到此蛋
白中有8个丝氨酸、5个苏氨酸和3个酪氨酸磷酸
化位点(图2)。目前关于YUC蛋白活性调节机制
的报道还很少,磷酸化位点的预测为将来研究
CrYUC的翻译后修饰等活动提供了理论基础。
SOPMA软件[12]分析CrYUC蛋白的二级结构,显
示其中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲各占
32.84%、16.30%、7.41%、43.46% (图 3,A)。
Phyre2软件[13]基于同源建模,预测了CrYUC蛋白
的三级结构(图3,B)。
YUC 编码的 FMO 属 FAD-containing 酶类,
CrYUC蛋白具有 FAD-cotaining酶的特征序列:
FAD和 NADPH 结合域[14],对应的氨基酸序列分
别为GAGPSGLA和GCGNSGM(图2)。经在线蛋
白质比对工具Blastp分析,长春花中YUC与可可、
番茄、葡萄、毛果杨、黄瓜、草莓等多个物种中的
YUC有70%以上的相似度。基于 NJ法,构建10
个物种内YUC的核苷酸序列的系统进化树。系统
进化树(图4)显示,长春花中的CrYUC与茄科中的
矮牵牛和番茄处于同一进化分支,说明CrYUC和
矮牵牛、番茄中的YUC 同源性较高。植物分类上,
矮牵牛、番茄和长春花均属于双子叶植物下的菊亚
纲,与传统的植物进化分类一致,结合之前的同源比
对结果,可见YUC在进化上是保守的。
2.3 CrYUC在不同部位的表达分析
Ljung等[15]研究发现,细胞分裂较活跃的幼嫩
叶片中生长素较多;而随着细胞分裂逐渐停止,成熟
叶片的生长主要依赖细胞扩大,其生长素含量显著
降低。本实验发现YUC 在幼、中、老不同生长状态
的长春花叶片中的表达水平基本一致(图5),由此
推测,所选取的各生长状态下的叶片中生长素含量
相同,各状态下叶片的生长已主要依赖细胞扩大。
这一推测与杨颖等[16]对长春花不同生长阶段下叶
片表皮数目的研究结果一致。
RT-qPCR的结果显示,CrYUC不仅在长春花
叶片,在花、根及茎等各部位也均有表达,但不同部
位呈现不同的表达水平(图5)。其中茎中的表达量
最高,远高于其他部位;花和根中的表达水平均较
低;叶片中的表达量介于茎和根之间。CrYUC在长

第4期 许 菲,等:长春花黄素单加氧酶基因的克隆与组织表达分析
图2 CrYUC基因全长cDNA序列及相应的氨基酸序列
注:预测的丝氨酸(S)、苏氨酸(T)及酪氨酸(Y)的磷酸化位点用圆圈标识;FAD、NADPH-结合域用方框标识
Fig.2 The ful length cDNA sequence and amino acid sequence of YUCin C.roseus
Note:The predicted serine(S),threonine(T)and tyrosine(Y)phosphorylation sites are indicted by circles.The FAD,NADPH-binding
motifs are indicated by boxes.
图3 CrYUC的二级结构(A)及预测的三级结构(B)
注:B中箭头方向表示N段到C端。
Fig.3 The secondary structure(A)and the predicted 3D
structure(B)of CrYUC
Note:Image of B coloured by rainbow indicate N C terminus.
春花中的表达模式与YUC2在八倍体草莓中的表达
模式一致[17],但与番茄[9]和矮牵牛[10]的表达模式不
同。这可能是由于不同遗传背景下,YUC发挥的功
能存在一定差异,导致YUC 的表达水平也不尽相
同。CrYUC可能对处于花期的长春花的茎及叶片
生长起着重要作用,尚待进一步研究。
3 讨论
长春花从萌发到开花整个过程中体内IAA的
含量都很低,但随发育阶段的增进IAA的含量呈整
体上升趋势[18],可见生长素在调控长春花生长发育
等活动中发挥一定的作用。研究发现参与内源生长
素IAA合成的YUC酶基因的表达量提高,相应的
IAA的合成量也增多[7-8,19]。而Fujino等[20]发现,

上 海 交 通 大 学 学 报 (农 业 科 学 版) 第32卷
图4 不同物种的YUC核苷酸序列的系统进化树
Fig.4 Phylogenetic tree of YUC nucleotides sequence from various species
图5 CrYUC在长春花植株不同部位的相对表达
Fig.5 The relative expression of CrYUCin
different parts of C.roesus
水稻内源IAA含量因YUC 基因的过表达而升高,
水稻叶片的宽度相应增大。这为通过改变YUC 的
表达量,影响长春花内源IAA的合成,进而改变长
春花植株和叶片大小提供了参考。
本实验利用RACE方法,首次从长春花中克隆
到YUC 基因,并对其进行了初步分析。CrYUC基
因编码的黄素单加氧酶含405个氨基酸,其相应的
cDNA序列全长1 863bp。CrYUC的DNA序列中
有3个内含子,与番茄中编码相同酶基因的内含子
数相同[9]。生物信息学分析显示,CrYUC与其他物
种的YUC 有较高的相似度,具有FAD-containing
酶类的保守序列,与茄科的矮牵牛和番茄处于同一
进化分支,在进化上具有较高的保守性。通过不同
部位CrYUC表达量的分析,可初步揭示CrYUC在
长春花生长发育过程中发挥的作用。荧光定量
PCR结果显示,YUC 在长春花茎及叶中表达量较
高,在花及根中的表达量很低,由此推测CrYUC可
能在长春花的茎及叶的生长中发挥一定的作用。
Rob 等[21] 发 现,类 生 长 素 吲 哚 丁 酸
(indolebutyric acid,IBA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,
4-dichlorophenoxyacetic,即2,4-D)可提高长春花
TIAs合 成 通 路 上 色 氨 酸 脱 羧 酶 (tryptophan
decarboxylase,TDC,参与催化TIAs上游合成途径
中色胺转化为色氨酸这一反应)的活性。在含
IAA的培养条件下,长春花愈伤组织中的舌根碱、
阿玛碱及长春质碱等TIAs的含量均显著升高[22]。
结合以上研究,有望通过提高外源或内源IAA的
含量,提高长春花 TIAs的产出量。而YUC 过表
达,可提高植物体内生长素的合成及积累量[8]。
若利用本实验室的长春花转基因技术[23-24],使
CrYUC在长春花中过表达,不仅有可能提高长春
花的生物量,提高土地资源的利用率;同时还有可
能提高长春花 TIAs的产量。目前关于内源生长
素对长春花TIAs代谢的影响尚未研究清楚,本实
验克隆到CrYUC,为进一步研究内源生长素对长
春花的影响奠定了基础。

第4期 许 菲,等:长春花黄素单加氧酶基因的克隆与组织表达分析
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