全 文 ：收稿日期:2004-12-19
基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(G19990116-02)
作者简介:白建荣(1961-),女 ,山西太原人 ,研究员 ,博士 ,主要从事植物分子生物学研究工作。
一粒系小麦的微卫星分析
白建荣1 , 2 ,宋彦霞1 ,朱银峰2 ,刘坤凡2 ,贾　旭2
(1.山西省农业科学院作物遗传研究所 ,山西太原　030031;2.中国科学院遗传与发育生物学研究所 ,北京　100101)
　　摘要:利用普通小麦 A基因组含有微卫星位点的引物对在 3 种一粒系小麦的部分同源微卫星位点进行了检测。
结果发现 , 59%的小麦 A基因组微卫星位点的引物对可在 3种一粒系小麦的多个种质中检测到部分同源微卫星位点 ,
表明A 基因组含有的微卫星位点在普通小麦和一粒系小麦间并不完全保守。 一粒系小麦的微卫星位点之间在扩增
条带数目以及扩增条带长度上均存在广泛差异 ,同一微卫星位点在不同一粒系小麦种质中的扩增条带数目以及扩增
条带长度上也表现明显差异。
关键词:一粒系小麦;微卫星
中图分类号:S512.1　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2005)04-0012-05
SSR Analysis of Einkorn Wheats
BAI Jian-rong1, 2 , SONG Yan-xia1 , ZHU Yin-feng2 , LIU Kun-fan2 , JIA Xu2
(1.Crop Genetics Institute ,Shanxi Academy of Agricultural Sciences ,Taiyuan　030031 ,China;
2.Institute of Genetics and Developmental Biology ,Chinese Academy of Sciences ,Beijing　100101 ,China)
Abstract:The presence in einkorn wheats of microsatellite loci homoeologous to those in the A genome of hexaploid
wheat were studied.Up to 59%of the PCR primer sets for the microsatellite loci of the A genome of hexaploid wheat de-
tected homoeologous loci in multiple accessions of T.urartu , T.monococcum and T .boeoticum , indicating that A
genome encoded microsatellite loci are highly , but not completely , conserved between hexaploid wheat and einkorn
wheats.Microsatellite loci in einkorn wheats differed from each other in both allele number and the length of individual
alleles.For a given locus , its allele number and allele length could also vary among different accessions of T.urartu ,
T.monococcum or T.boeoticum.
Key words:Einkorn wheats;Microsatellite
　　品种间的多态性是基因标签和分子标记辅助育
种的前提 。虽然分子标记技术的不断进步促进了这
项工作的发展 ,但普通小麦基因组的高倍性 、大量重
复序列的存在和品种间有限的多态性使得高密度的
分子图谱构建缓慢。所以近几年来人们开始研究普
通小麦的二倍体供体种 ,例如 D染色体组的供体
———粗山羊草(Ae tauschii),结果得到的遗传连锁图
比相应的普通小麦D染色体组的长[ 1] 。A染色体组
是小麦属的基本染色体组之一。在具有 A染色体
组的一粒系小麦(二倍体小麦)中 ,有3个种:乌拉尔
图小麦(T.urartu)、野生一粒小麦(T.boeoticum)和
栽培一粒小麦 (T.monococcum)。许多研究表明 ,
T.boeoticum 是T.monococcum 的祖先 ,染色体组成为
Am ,乌拉尔图小麦是普通小麦 A染色体组的供体 ,
染色体组成为 Au[ 2] 。构建具有 A 染色体组的一粒
系小麦遗传图谱对普通小麦的遗传和育种研究有着
重要意义 。
评价一粒系小麦遗传多样性是遗传作图的必要
准备 。近十几年来 ,已有多种方法用于该项研究 ,如
种子储藏蛋白 、同工酶 、RFLP 和 RAPD 等技术[ 3 , 4] 。
尽管 RFLP 有许多优点 ,但需大量的 DNA 和时间 ,
并且需要复杂的操作;RAPD 标记虽然可在重复区
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作图 ,但它们的多态性低而且在小麦中不稳定 。微
卫星 DNA ,又叫简单序列重复(simple sequence re-
peats , SSRs),是一些长度小于 5 bp的串联单位 ,广
泛分布在基因组中。微卫星 DNA 在同源位点具有
高度变异 ,因而可以作为一种分子标记。微卫星作
为遗传标记已在小麦遗传作图和遗传多样性的研究
中显示出它的优点 , 如多态性高 、共显性 、易操作
等[ 5 ,6] 。但需要大量的时间和经费去鉴定含有微卫
星DNA的克隆和设计微卫星DNA引物 。
尽管由于进化和选择的作用有一些变异 ,但普
通小麦的A 染色体组和一粒系小麦的基因组有很
大的同源性。如果在二倍体小麦的研究中能利用普
通小麦A染色体组微卫星 DNA引物 ,无疑对成本和
时间的节约以及比较遗传作图是有利的。虽然有人
已在了解普通小麦微卫星 DNA 引物在小麦族二倍
体种中的扩增情况有所尝试 ,但已有的结果还不完
善[ 7] 。本研究的目的是要了解普通小麦 A 染色体
组微卫星 DNA引物在二倍体小麦中的扩增情况 ,为
以后用微卫星标记构建具有 A染色体组的一粒系
小麦的遗传图谱和基因定位奠定基础 。
1　材料和方法
1.1　材料
本实验选用 7份乌拉尔图小麦 、两份野生一粒
小麦和两份栽培一粒小麦 ,以普通小麦中国春(CS)
作为对照(表 1)。
表 1　研究所用的一粒系小麦和普通小麦材料
Tab.1　Accessions of diploid wheats and common wheat used in this study
序号
No.
基因组
Genome
种
Species
材料编号
Accession
起源
Origins
来源
sources
1 Au T.urartu Tum IZ29-1 叙利亚　Syria 美国　America
2 Au T.urartu Tum DV868 亚美尼亚　Armenia 美国　America
3 A
u T.urartu Tum DV867 亚美尼亚　Armenia 美国　America
4 A
u T.urartu Tum DV877 亚美尼亚　Armenia 美国　America
5 Au T.urartu Tum DV865 伊朗　Iran 美国　America
6 Au T.urartu Tum G1958 土尔其　Turkey 美国　America
7 Au T.urartu Tum G3159 黎巴嫩　Lebanon 美国　America
8 Am T.boeoticum Bosis As261 中国　四川　Sichuan China
9 Am T.boeoticum Bosis As262 中国　四川　Sichuan China
10 Am T.monococcum L As264 中国　四川　Sichuan China
11 Am T.monococcum L As265 中国　四川　Sichuan China
12 ABD T.aestivum Chinese Spring 中国 China 北京　Beijing
1.2　DNA的提取
参照Guidet[ 8]等的方法并略有修改。取 1 ～ 2
片幼嫩叶片用研钵在液氮中磨碎 ,转入预冷的 ep-
pendorf 管中 , 加入约 600 μL 的提取缓冲液(4%
Sarkosyl , 100 mmol/L Tris-HCl , 10 mmol/L EDTA , pH
8.5),颠倒混匀后加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶
24∶1)混匀后离心(12 000 r/min , 10 min);吸出上清
转入另一管 ,加等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)再
纯化一次;吸出上清转入另一管 ,然后加入 60 μL 3
mol/L 醋酸纳(pH 5.2)和 600 μL 异丙醇 ,轻轻颠倒
数次后离心(12 000 r/min ,10 min);倒掉上清液 ,将
DNA沉淀用1 mL 70%酒精漂洗 2次后离心(12 000
r/min , 2 min);室温干燥后加入 30 ～ 50 μL 含有 40
μg/mL RNase 的 TE溶液中 , 4 ℃放置过夜使其完全
溶解 。
1.3　SSR的扩增
按照 R¨oder[ 9]等发表的微卫星引物序列由上海
生工合成引物。扩增体系为 25 μL ,其中模板 80 ～
100 ng , dNTP 0.2 mmol/L ,引物P1/P2各 1μmol/L ,1
×Taq DNA 聚合酶 buffer , Taq DNA 聚合酶 0.2 U。
PCR扩增在 Perkin Elmer 9600 PCR仪上进行。反应
程序为:95 ℃预变性 3 min , 1个循环;94 ℃变性 1
min ,复性 1 min ,72 ℃延伸 1.5 min ,共 35个循环;最
后在 72 ℃延伸 10 min 。
1.4　扩增产物的胶凝胶电泳
扩增产物变性后在 6%的测序胶上分离。在恒
定功率 40W 条件下预电泳约 30 min后加扩增样品
DNA 4 ～ 6μL ,电泳约 2 h。
1.5　银染
电泳结束后 ,将凝胶放入 10%冰乙酸中轻摇 30
min至指示剂无色;用重蒸水漂洗 3次 ,每次 5 min。
放入染色液(0.2%AgNO3 , 0.5%甲醛)中 ,轻摇 30
min;用重蒸水洗约 5 s后放入显影液(3%Na2CO3 ,
0.5%甲醛 , 0.02%Na2S2O3)至 DNA 条带显出;用
4期 白建荣等:一粒系小麦的微卫星分析 13　 A　C　T　AAGRICULTURAE
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10%冰乙酸终止反应 ,约 5 min后 ,用重蒸水洗 。室
温干燥后统计带型或照相 。
1.6　数据统计和分析方法
有带出现赋值为 1 ,没带出现的赋值为 0。供试
材料间的 Nei 氏遗传距离按照下列公式计算:D=
1-2Nxy/(Nx +Ny),其中 Nx 为样品 x 的条带数 ,
Ny 为样品 y 的条带数 ,N xy 为两样品共有的条带
数。利用 STATIC CLUSTER软件进行聚类分析。
M:Marker;1～ 12依次是 IZ29-1 , DV868 , DV867 ,DV877 , DV865 ,G1958 , G3159 ,AS261 , AS262, AS264 ,AS265 , CS
M , DNA markers;Lanes 1～ 12 , products amplified f rom IZ29-1 , DV868 , DV867, DV877 , DV865 ,G1958 , G3159, AS261 ,AS262 , AS264 ,AS265 , CS
图 1　Xgwm471 位点在二倍体小麦的扩增
Fig.1　Amplification of homoeologous microsatellite locus in three diploid wheats using the primer set for Xgwm471
表 2　32套普通小麦 A染色体组的引物在二倍体小麦材料中的扩增情况
Tab.2　The alleles amplified from three diploid wheats with 32 primer sets
Locus(Xgwm) AT(℃) Allele
0a 1b 2 3 4 5 6 7 8
164-1AL 56 1c 1 3 3 3
135-1AL 62 1 3 3 4
99-1AL 62 1 4 2 4
359-2AS 56 4 1 2 1 3
372-2AS 62 1 1 4 1 4
356-2AL 56 2 1 1 1 3 3
265-2AL 56 7 4
95-2AL 56 1 3 2 5
339-2AL 51 1 2 3 5
294-2Al 56 4 3 1 1 2
369-3AS 62 1 1 2 1 4 2
5-3AS 51 1 1 1 1 1 3 2 1
480-3AL 62 4 5 2
391-3AL 56 1 1 2 4 1 2
4-4AL 56 10 1
397-4Al 56 4 1 3 2 1
415-5AS 56 1 2 1 1 3 2 1
293-5AS 56 3 4 4
156-5AL 56 4 1 1 1 4
186-5AL 56 1 1 1 3 1 1 1 2
126-5Al 56 2 7 2
179-5Al 56 8 2 1
334-6AS 51 2 2 1 6
570-6AL 62 6 1 4
169-6AL 62 4 7
471-7AS 62 1 1 1 1 3 2 2
130-7AS 62 1 1 2 1 1 2 3
60-1-7ASd 62 4 4 2 1
60-2-7ASd 62 7 4
332-7AL 62 6 1 4
32-3A 55 11
601-4A 60 11
494-6A(cent) 60 11
　注:“ a”代表在 4个 T.monococcum 和 T.boeoticum 种质系中产生缺等位基因;“b”代表从不同的二倍体小麦中扩增出的等位变异数(1～ 8);“ c”
代表二倍体小麦在每一个位点的种质数;“ d”代表用引物 Xgwm60在二倍体小麦中检测出两个位点
　Note:“ a” indicating denotes primer set s for these loci produced null alleles in one , two or all of the four accessions of T monococcum and T boeoticum;“ b” indi-
cating the numbers(1 to 8)represent different alleles amplified f rom three diploid wheats;“ c” indicating the number of einkorn wheat accessions possessing par-
ticular alleles;“ d”indicating the primer set for Xgwm60 detected two loci in einkorn wheats
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2　结果与分析
2.1　微卫星位点在 3个二倍体小麦种的扩增
我们利用普通小麦中 A 基因组含有微卫星位
点的 54对引物对 3个二倍体小麦中的同源微卫星
位点进行了检测。图 1 显示了 Xgwm471的扩增情
况。表 2总结了 54对引物在 3 个二倍体小麦种的
扩增。结果发现 ,分布在普通小麦A 基因组 7条染
色体的32对(59%)引物可在 3 个二倍体小麦种得
到清晰的 、可读的 、在乌拉尔图小麦中没有缺等位变
异的条带 。Xgwm32 , Xgwm601 和 Xgwm494三对引
物的扩增为单态 。位于第 7染色体的 Xgwm60扩增
出2个位点 ,其余的 28对引物的扩增是单位点 。共
得到 125个等位变异 ,位点的变异从 1(Xgwm169)到
8(Xgwm186),平均每个位点的等位变异是 4.17。在
部分 T.monococcum 和 T.boeoticum 材料中 , 用 Xg-
wm60 , Xgwm156 , Xgwm169 , Xgwm294 和 Xgwm359
引物扩增时发现是缺等位变异 ,还有5对引物 (Xg-
wm95 , Xgwm126 , Xgwm334 , Xgwm471 和 Xgwm130)
或在 T.monococcum 或在 T.boeoticum 材料中不扩
增。这些结果表明 ,A 基因组含有的微卫星位点在
普通小麦和一粒系小麦间并不完全保守。一粒系小
麦的微卫星位点之间在扩增条带数目以及扩增条带
长度上均存在广泛差异 ,同一微卫星位点在不同一
粒系小麦种质间的扩增条带数目以及扩增条带长度
上也表现明显差异 。
2.2　遗传距离及聚类分析
根据扩增的情况 ,我们利用 Jaccard相似系数得
出了试验材料的遗传距离(表 3)。从表中我们可以
看到 ,乌拉尔图小麦种质间的 GD 值不超过 0.32 ,
而乌拉尔图小麦与 T.monococcum 和 T.boeoticum 的
GD值都超过 0.32。基于GD值 ,我们进行了聚类分
析(图 2)。聚类结果明显表明 ,乌拉尔图小麦与中
国春聚为一大类 ,乌拉尔图小麦本身则聚为 3小亚
类 ,第 1亚类是 IZ29-1 (来源于叙利亚)和 G1958
(来源于土尔其),第 2亚类包括 DV865(来源于伊
朗)、DV867(来源于亚美尼亚)和 DV868(来源于亚
美尼亚),第 3 亚类由 DV877(来源于亚美尼亚)和
G3159(来源于黎巴嫩)组成 。 T.monococcum 和
T.boeoticum 另外聚成一大类 。
表 3　12 份材料之间的遗传距离
Tab.3　Genetic distances(GDs)among the 12 accessions
IZ29-1 DV868 DV867 DV877 DV865 G1958 G3159 As261 As262 As264 As265 CS
IZ29-1 0.00
DV868 0.25 0.00
DV857 0.24 0.15 0.00
DV877 0.26 0.29 0.21 0.00
DV865 0.23 0.10 0.14 0.29 0.00
G1958 0.23 0.29 0.23 0.23 0.29 0.00
G3159 0.26 0.32 0.26 0.24 0.26 0.29 0.00
As261 0.34 0.35 0.37 0.37 0.36 0.38 0.38 0.00
As262 0.32 0.34 0.32 0.32 0.35 0.36 0.35 0.07 0.00
As264 0.34 0.38 0.37 0.38 0.38 0.38 0.36 0.16 0.18 0.00
As265 0.32 0.35 0.34 0.35 0.35 0.35 0.35 0.15 0.18 0.16 0.00
CS 0.29 0.37 0.33 0.32 0.35 0.34 0.29 0.35 0.32 0.33 0.32 0.00
图 2　应用 Statistics Cluster软件构建的聚类图
Fig.2　A tree diagram of the clustering of 12
accessions using Statistics Cluster software
3　讨　　论
微卫星是真核生物的重要组成 。根据它们在不
同种内和种间的分布 ,我们知道它们是非常活跃的 ,
因而种内和种间的微卫星位点在许多方面是不同的。
例如 ,水稻微卫星 OS1E6位点 ,当在不同的品种和野
生稻中扩增时 ,不但重复单位而且侧翼序列都有区
别[ 10] 。在我们的研究中 ,普通小麦A 染色体组上的
54对引物只有 32对能扩增出清晰 、可读的条带 ,其中
29对具有多态性 。在这些位点中 , 有 5对(Xgwm60 ,
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Xgwm156 , Xgwm169 , Xgwm294 和 Xgwm359)在
T.monococcum 和T.boeoticum 中均不扩增。还有一些
(Xgwm95 , Xgwm126 , Xgwm334 , Xgwm471 和
Xgwm130)或在 T.monococcum 或在 T.boeoticum 中不
扩增 。这些缺等位基因的出现 ,说明引物结合位点的
序列发生了突变 。而缺等位基因出现的频率可以反
映进化关系的远近。很清楚 ,PCR标记比杂交技术获
得的标记更具有特异性 ,因为与引物结合的模板序列
的点突变能够阻止扩增。而探针与模板即使有部分
同源杂交仍然可以进行。在本研究中 ,基于 29个微
卫星引物产生的多态性 ,我们进行了聚类分析 。聚类
结果与目前普遍接受的观点一致 ,即乌拉尔图小麦与
普通小麦聚为一类 , T.monococcum 和 T.boeoticum 聚
为一类[ 11] 。
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