全 文 ：中国农学通报 2012,28(18):260-265
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
薏米为一年生禾本科植物薏苡的种仁，又名薏苡
仁、米仁、薏仁、水玉米、六谷米、药玉米、菩提珠等，原
产于中国，是古老的药食皆佳的作物之一，薏米的营养
价值很高，堪称为“禾本科之王”[1]，它不仅含有蛋白
质、脂肪、碳水化合物、粗纤维、Ca、P、Fe等，而且还含
有人体必需的 8种氨基酸，是一种营养平衡的谷物[2]，
目前对薏米的精深加工、功能因子研究报道主要集中
在薏苡仁酯[3]、多糖[4]、薏苡仁油[5]、饼干[6]、乳饮料[7]等研
究上，对薏米蛋白质的研究较少，且尚处于初始阶段，
第一作者简介：尚宏丽，女，1977年出生，辽宁辽阳人，讲师，硕士，研究方向为食品生物技术。通信地址：121001辽宁锦州市古塔区人民街五段48号
辽宁医学院食品学院，Tel：0416-4982336，E-mail：shanghongli007@126.com。
通讯作者：孟鑫，女，1981年出生，辽宁辽阳人，讲师，博士，研究方向为微生物催化剂的分子定向改造。通信地址：121001辽宁锦州市古塔区人民街
五段48号辽宁医学院食品学院，Tel：0416-4982336，E-mail：woxing1981@163.com。
收稿日期：2011-12-05，修回日期：2012-03-28。
薏米蛋白提取及其SDS-PAGE电泳分析
尚宏丽，孟 鑫，张 挺
（辽宁医学院，辽宁锦州 121001）
摘 要：为了提高薏米蛋白的提取得率，确定提取pH、料液比、提取温度、提取时间对蛋白提取率的影响，
进一步得到薏米蛋白SDS-PAGE电泳图谱。采用碱法提取薏米蛋白，通过响应面回归分析，得到碱法提
取薏米蛋白的优化工艺条件并且进行SDS-PAGE凝胶电泳分析薏米蛋白电泳图谱。结果表明，碱法提
取薏米蛋白的优化工艺条件为料液比为1:11.8，提取时间4.93 h，提取温度为35℃，提取pH 10.47。在最
优条件下，薏米蛋白提取率达到43.94%。薏米蛋白SDS-PAGE凝胶电泳分析，薏米蛋白电泳图谱共分
离出2条蛋白亚基条带，较大薏米蛋白亚基分子量143 kD，较小薏米蛋白亚基分子量为85 kD。通过响
应面碱法提取薏米蛋白，提取率明显提高，采用SDS-PAGE法对薏米蛋白进行分析，为构建薏米蛋白质
指纹图谱提供理论依据。
关键词：薏米蛋白；提取得率；响应面法；SDS-PAGE
中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 论文编号：2011-3587
Extraction and SDS-PAGE Analysis of Proteins from Job’s Tears Seed
Shang Hongli, Meng Xin,Zhang Ting
(Liaoning Medical University, Jinzhou Liaoning 121001)
Abstract: In order to increase the protein extraction rate from Job’s Tears seed, determine the pH,
solid-liquid ratio, treatment temperature, time on the extraction rate of protein effects, further barley protein
SDS-PAGE electrophoresis. Based on single-factor test, the optimum extraction conditions were confirmed by
response surface method, and made SDS-PAGE analysis of Job’s Tears seed electrophoresis. The results
showed that, the optimum extraction conditions were confirmed by response surface method as follows: solid to
liquid ratio 1:11.8, pH 10.47, treatment temperature 35℃ , and time 4.93 h. Under these conditions, the
extraction rate was 43.94% . The SDS-PAGE analysis showed that, the proteins from Job’s Tears seed
contained approximately 2 subunits, larger barley protein subunit molecular weight was 143 kD, little barley
protein subunit molecular weight was 85 kD. Through the response surface alkali extraction from Job’s Tears
seed, extraction rate increased significantly, the SDS-PAGE method was adopted to analyze, to construct the
protein fingerprint and provide a theoretical basis.
Key words: Job’s Tears seed protein; extraction rate; response surface methodology; SDS-PAGE
尚宏丽等：薏米蛋白提取及其SDS-PAGE电泳分析
而薏米蛋白不仅具有重要营养价值，还具有重要保健
功能，氨基酸组成丰富、合理，其中亮氨酸、酪氨酸含量
均高于小麦，对人体非常有益，属于优质蛋白。可见深
入开展薏米蛋白质的研究，使其拥有更高的开发价值
和利用前景有着十分重要的意义。
十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS-PAGE)在蛋白质的量化、比较及特性鉴定中是一
种经济、快速、重复性好的方法。笔者通过响应面优选
出薏米蛋白提取最佳工艺条件，在此条件下提取薏米
蛋白，运用SDS-PAGE法对薏米蛋白进行分析，预建立
适宜薏米蛋白提取和SDS-PAGE的一套方法，以期为
薏米的品种纯度检测和构建薏米蛋白质指纹图谱提供
一定的依据，也为薏米的开发综合利用提供一定的参
考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
薏米购置于辽宁朝阳天丰香香米业加工厂，
SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂为 Sigma公司，其他试
剂为国产分析纯。
721型分光光度计（上海精密仪器有限公司分析
仪器厂），HH-型数显恒温水浴锅（国华电器有限公
司），LNK-871型凯氏定氮仪（江苏省宜兴市科教仪器
研究所），PB-10标准型 pH计（德国 Sartorius公司），
LDZ5-2型台式低速离心机（上海安亭科学仪器厂），
DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）。
1.2 方法
1.2.1 薏米总蛋白的测定 原料薏米中总蛋白含量测定
采用GB/T 5009.5—2010，凯氏定氮法[11]。
1.2.2 薏米蛋白的提取工艺 取100 g薏米粉碎过筛后，
按照一定料液比加入不同 pH碱溶液浸泡后放入恒温
水浴中保温一段时间，待提取反应结束后，用离心机
3000 r/min离心 15 min，收集上清液将其用 1 mol/L
HCl调节pH至5.0[8-9]，进行酸沉蛋白操作，蛋白质沉淀
经过再次离心后，弃去上清液，收集酸沉蛋白沉淀，经
过去离子水洗涤后，再经冷冻干燥后称重[10]。
薏米蛋白提取率=(上清液蛋白质的质量/原料薏
米中的总蛋白质质量)×100%
1.2.3 薏米蛋白提取的单因素试验 选定碱液pH、提取
温度、提取时间、料液比 4个因素[12]作单因素试验，考
察各单因素对蛋白提取率的影响，每组3次重复。
1.2.4 薏米蛋白提取响应曲面设计 在单因素试验的基
础上，采用Design-Expert 8.0.5中的Box-Behnken中心
组合试验设计响应面试验，选择碱液pH、提取温度、提
取时间、料液比为自变量，以薏米蛋白提取率为响应
值，采用响应面分析法，对薏米蛋白提取工艺条件参数
进行优化[13-14]。其因素水平编码表见表1。
1.2.5 数据处理 利用Design-Expert 8.0.5b软件，采用
Box-Behnken中心组合试验设计响应面试验，优化薏
米蛋白提取条件，每个组合重复试验3次。
1.2.6 SDS-PAGE凝胶电泳 在最佳条件下提取的薏米
蛋白液装入透析袋中用PEG6000吸水浓缩24 h后，将
薏米蛋白浓缩后的提取液加入 2×SDS上样 Buffer，
100℃煮沸 5 min后，取 20 μL点样，采用 5%浓缩胶及
其 15%运用分离胶进行不连续垂直平板电泳分析，蛋
白质质量运用Quality one软件进行分析[15-16]。
2 结果与分析
2.1 影响薏米蛋白提取率的单因素试验
2.1.1 碱液 pH对薏米蛋白提取率的影响 提取温度
35℃，提取时间 5 h，料液比 1:12，研究碱液 pH分别取
9.0、9.5、10.0、10.5、11、11.5、12对薏米蛋白提取率的影
响，结果如图1所示。从图1中可以看出，薏米蛋白提取
率在pH 9~10.5范围内是逐渐升高，到达pH 10.5达到提
取率最高值，随后提取率随pH增加略有下降，但下降不
是很多，这可能与薏米蛋白大部分是碱溶性蛋白有关。
当碱液pH过高时候，也可能造成淀粉糊化，使其蛋白质
性质受到破坏，所以确定较佳的提取pH 10.5。
2.1.2 温度对薏米蛋白提取率的影响 提取时间5 h，料
36
37
38
39
40
41
42
9 9.5 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13pH
蛋
白
提
取
率
/%
图1 不同pH对薏米蛋白提取率的影响
因素
料液比X1
时间X2/h
温度X3/℃
碱液 pH X4
水平
-1
1: 8
4
35
10
0
1:10
5
40
10.5
-1
1:12
6
45
11
表 1 碱法提取薏米蛋白试验因素水平及编码
·· 261
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液比 1:12，pH 10.5、调节温度分别为 25、30、35、40、
45、50、55、60℃，分别考察不同温度对薏米蛋白提取
率的影响，结果如图2所示。由图2可知，随着温度升
高，蛋白提取率缓慢上升，在25~40℃之间有较大的增
幅，这是因为随温度升高，提取溶液内部分子运动速
度加快，导致粉碎后薏米糊中蛋白溶解速度加快，从
细胞迁移到溶剂中速度增加；当温度高于 45℃后，提
取率随温度上升出现下降，有可能是温度升高后，薏
米糊中蛋白质遇到高温导致变性。故提取温度 40℃
比较合适。
2.1.3 时间对薏米蛋白提取的影响 料液比 1:12，pH
10.5、提取温度为40℃，分别采用时间为1、2、3、4、5、6、
7 h，考察不同时间对薏米蛋白提取率的影响，结果如
图3所示。当时间低于4 h时，蛋白提取率呈快速上升
趋势，变化程度较明显，当时间超过4 h后，蛋白提取率
趋于平稳，蛋白提取最适提取时间为4 h。
30
35
40
45
50
25 30 35 40 45 50 55 60 65
温度/℃
蛋
白
提
取
率
/%
图2 提取温度对薏米蛋白提取率的影响
30
35
40
45
50
1 2 3 4 5 6 7
时间/h
蛋
白
提
取
率
/%
图3 提取时间对薏米蛋白提取率的影响
2.1.4 料液比对薏米蛋白提取率的影响 pH 10.5、提取
温度为40℃，时间为5 h，调节料液比分别为1:4、1:6、1:
8、1:10、1:12、1:14 (g/mL)，分别考察不同料液比对薏米
蛋白提取率的影响，结果如图4所示。由图4可知，随
着料液比的增大，薏米蛋白的提取率逐渐增大，在料液
比达到1:10之后，趋于平缓。故选蛋白提取最适料液
比取1:10。
2.2 碱法提取薏米蛋白响应曲面设计与结果
2.2.1 Box-Behnken试验设计方案及试验结果 根据上
述单因素试验，利用Design-Expert 8.0.5b软件，采用
Box-Behnken中心组合试验设计，选择液料比(X1)、时
间(X2)、温度(X3)和碱液pH(X4)作为响应面优化的考察
因素，以薏米蛋白提取率为响应值，试验结果见表2。
通过利用Design-Expert 8.0.5b软件对表 2中的数
据进行分析，获得回归方程：
Y=42.72+0.51X1+0.22X2-0.38X3-0.28X4+1.05X1X3
+ 0.18X1X4 + 0.25X2X3 + 0.3X2X4 + 0.35X3X4-1.41X12-
0.37X22-0.2X32-5.84X42
2.2.2 模型的显著性检验 进一步对该回归模型进行显
著性检验，响应曲面数据的方差分析结果见表 3。由
表3方差分析结果可看出，模型P<0.0001，说明该模型
显著回归，失拟项P= 0.0964 > 0.05，不显著，模型的拟
合性好，并且该模R2=95.77%，R2Adj=91.53%，说明该模
型的拟合性非常好，可以用此模型来分析和预测碱法
提取薏米蛋白的结果。
X1，X3，X4，X2X3，X12，X22，X42其P < 0.01，表明该几
项差异极显著，说明它们对响应值的影响大，X2，X3X4
的P < 0.016，说明这 2项为显著项。根据多元二次回
归方程，各个系数绝对值的大小可判断 4个因素对提
取率的影响顺序为X1>X3>X4>X2。其中料液比、提取
温度及碱液pH达到极显著程度，提取时间为显著。且
料液比与提取温度存在交互作用，达到极显著水平，碱
液 pH与时间、温度与碱液 pH、碱液 pH以及温度存在
3435
3637
3839
4041
4243
1/4 1/6 1/8 1/1 1/1 1/1
料液比/(g/mL)
蛋
白
提
取
率
/%
图4 料液比对薏米蛋白提取率的影响
·· 262
尚宏丽等：薏米蛋白提取及其SDS-PAGE电泳分析
交互作用，达到显著水平。
2.2.3 响应面交互作用分析 响应面图能比较直观的反
映各因素和各因素间的交互作用，通过得率回归方得
到的响应面图和等高线图[15]。由图 5可知，响应面曲
线较陡，说明料液比和提取温度对薏米蛋白提取率的
影响较显著，这与方差分析的结果相一致。从图 6中
可以看出，随着温度的增大，响应值薏米蛋白提取率缓
慢降低，说明在提取蛋白时候，温度不宜过高。响应值
随着料液比增加表现为先增大后降低。从图6可以看
出，随着温度和pH提高，薏米蛋白提取率表现为先增
大后降低，在图 7中，提取时间及 pH对薏米蛋白提取
率的影响与图6相似，从两者等高线图中清晰看到，温
度和 pH之间及其提取时间及 pH的交互作用显著，表
现为等高线呈椭圆形，这与方差分析的结果也相一致。
2.2.4 最优提取条件确定及其试验模型的验证 由响应
面分析得到，响应值最大时料液比为1:11.8、提取时间
4.93 h、温度为35℃、pH 10.47，理论薏米蛋白提取率预
测为 43.67%，根据最佳工艺条件，做 3组验证性实验，
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
X1
-1
1
-1
1
0
0
0
0
-1
1
X2
-1
-1
1
1
0
0
0
0
0
0
X3
0
0
0
0
-1
1
-1
1
0
0
X4
0
0
0
0
-1
-1
1
1
-1
-1
提取率/%
40.1
41.2
40.4
41.5
37.7
36.1
36.3
36.1
35.3
36.4
试验号
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
X1
-1
1
0
0
0
0
-1
1
-1
1
X2
0
0
-1
1
-1
1
0
0
0
0
X3
0
0
-1
-1
1
1
-1
-1
1
1
X4
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
提取率/%
34.4
36.2
42.5
42.7
41.3
42.5
42.3
40.7
39.5
42.1
试验号
21
22
23
24
25
26
27
28
29
X1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
X2
-1
1
-1
1
0
0
0
0
0
X3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
X4
-1
-1
1
1
0
0
0
0
0
提取率/%
36.9
36.6
35.9
36.8
42.9
42.5
42.7
42.8
42.7
注：R2=0.9577；R2Adj=0.9153。
表 2 二次回归旋转组合试验设计及结果
变异源
模型
X1
X2
X3
X4
X1X2
X1X3
X1X4
X2X3
X2X4
X3X4
X12
X22
X32
X42
残差
失拟项
误差项
合计
平方和
242.70
3.10
0.56
1.76
0.91
0.000
4.41
0.12
0.25
0.36
0.49
12.90
0.90
0.25
220.85
0.97
0.88
0.088
243.67
自由度
14
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
14
10
4
28
均方
17.34
3.10
0.56
1.76
0.91
0.000
4.41
0.12
0.25
0.36
0.49
12.90
0.90
0.25
220.85
0.069
0.088
0.022
F值
250.08
44.73
8.13
25.44
13.09
0.000
63.62
1.77
3.61
5.19
7.07
186.03
12.98
3.65
3185.84
4.01
P值
< 0.0001
< 0.0001
0.0128
0.0002
0.0028
1.0000
< 0.0001
0.2050
0.0784
0.0389
0.0187
< 0.0001
0.0029
0.0768
< 0.0001
0.0964
表 3 回归方程模型方差分析及其系数的显著性检验
·· 263
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
结果 3次平行试验得到的实际平均提取得率为
43.94%，比理论值高，与理论最大值接近，而且比文献
报道高[12]，说明模型可以较好的反映出薏米蛋白的提
取条件，进一步说明了响应面法对薏米蛋白提取条件
的优化时可行的，得到的薏米蛋白提取条件具有实际
应用价值。
2.2.5 薏米蛋白质亚基分布及其分子质量 通过前期提
取工作，在最佳条件下提取的薏米蛋白通过SDS-PAGE
凝胶电泳分析，取得了较好的分离效果，结果如图 8所
示。从图 8中可以看出，薏米可溶性蛋白电泳图谱共
分离出2条蛋白亚基条带,较大薏米蛋白亚基分子量为
143 kD，较小薏米蛋白亚基分子量为 85 kD。从薏米
提
取
率
/%
提取温度/℃
液料比
提
取
率
/%
温度/℃
图 6 提取温度和pH对薏米蛋白提取率的影响图 5 提取温度和料液比对薏米蛋白提取率的影响
提
取
率
/%
时间/h
pH
图 7 提取时间和pH对薏米蛋白提取率的影响
1 M 2
97.0 kD

66.2 kD

43.0 kD

31.0 kD
M：标准蛋白；1、2：薏米蛋白
图8 薏米蛋白的SDS-PAGE图
蛋白的SDS-PAGE图谱可以清晰看出，薏米蛋白多以
大分子的结构存在，其分子质量主要集中在85~145 kD
之间，85 kD分子量以下蛋白亚基几乎不存在。图谱
中出现轻微拖尾现象可能由于样品离心时脂肪成分未
处理完全造成的。经过多次重复试验，薏米可溶性蛋
白电泳谱带重现性良好，稳定性良好，每次都能得到相
同的结果，这也为构建薏米蛋白质指纹图谱提供一定
的依据。
3 结论
本实验通过碱法分离提取薏米蛋白，采用响应曲
97.0 kD
66.2 kD
43.0 kD
31.0 kD
1 M 2
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尚宏丽等：薏米蛋白提取及其SDS-PAGE电泳分析
面法确定影响薏米蛋白提取率主要因素料液比、提取时
间、提取温度、pH 4个因素。其4个因素对提取率的影响
顺序为X1>X3>X4>X2。获得薏米蛋白提取率最高的优化
的提取工艺为：料液比为1:11.8、提取时间4.93 h、提取温
度为 35℃、pH 10.47，在此工艺条件下，薏米蛋白提取
率达到 43.94%。在最佳条件下提取的薏米蛋白通过
SDS-PAGE凝胶电泳分析，薏米蛋白电泳图谱共分离
出 2条蛋白亚基条带，较大薏米蛋白亚基分子量为
143 kD，较小薏米蛋白亚基分子量为 85 kD。从薏米
蛋白的SDS-PAGE图谱可以清晰看出，薏米蛋白多以
大分子的结构存在，其分子质量主要集中在 85~
145 kD之间，85 kD分子量以下蛋白亚基几乎不存在。
4 讨论
通过碱法分离提取薏米蛋白，首次采用响应曲面
法确定影响薏米蛋白提取率主要因素，获得薏米蛋白
提取率最高的优化的提取工艺，薏米蛋白提取率达到
43.94%。而且比文献[12]报道提取得率高，说明通过该
响应面建立的模型充分反映出薏米蛋白的提取条件之
间关系，对今后工业化提取薏米蛋白具有实际指导价
值。同时通过薏米蛋白SDS-PAGE凝胶电泳分析，薏
米蛋白电泳图谱较为清晰并且条带不多，分子量在大
于 85 kD之上，图谱中出现轻微拖尾现象可能由于样
品离心时候脂肪成分未处理完全造成的。经过多次重
复试验，薏米可溶性蛋白电泳谱带重现性良好，稳定性
良好，每次都能得到相同的结果，这也为构建薏米蛋白
质指纹图谱提供一定的依据。今后本课题组将继续研
究水解薏米蛋白制备活性肽其功能性质及蛋白提取的
副产物所剩淀粉的性质，使提取薏米蛋白更有实际应
用价值。
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