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蕨麻正丁醇提取物对急性卵巢缺血再灌注损伤大鼠肿瘤坏死因子α的影响



全 文 :书DOI:10.7683/xxyxyxb.2014.05.001
收稿日期:2014-02-17
基金项目:国家十一五科技支撑计划资助项目(编号:2007BAK38B05);武警后勤学院科研创新团队资助项目(编号:WHTD2013082)
作者简介:邹晓萍(1984-),女,湖北大冶人,硕士,医师,主要从事妇产科临床研究。
通信作者:董化江(1983-),男,山东淄博人,硕士,讲师,主要从事缺血再灌注损伤的研究
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本文引用:邹晓萍,董化江,单娜娜,等.蕨麻正丁醇提取物对急性卵巢缺血再灌注损伤大鼠肿瘤坏死因子α的
影响[J].新乡医学院学报,2014,31(5):321323. 【基础研究】
蕨麻正丁醇提取物对急性卵巢缺血再灌注损伤大鼠
肿瘤坏死因子α的影响
邹晓萍1,董化江2,单娜娜3,臧照辉4,单云官2
(1.武警后勤学院附属医院妇产科,天津 300162;2.武警后勤学院人体解剖学与组织胚胎学教研室 天津市遗体防
腐与整形整容重点实验室,天津 300162;3.武警后勤学院教育技术中心,天津 300162;4.武警后勤学院研究生处,
天津 300162)
摘要: 目的 探讨蕨麻正丁醇(Pa)提取物对卵巢缺血再灌注损伤大鼠肿瘤坏死因子α(TNFα)的影响。方法
 60只Wistar大鼠随机分为对照组(C组)、缺血24h组(I24h组)、缺血+再灌注24h组(R24h组)、缺血+再灌注
48h组(R48h组)、Pa提取物预处理+缺血再灌注24h组(Pa+R24h组)和Pa提取物预处理+缺血再灌注48h组
(Pa+R48h组),每组10只。放射免疫法检测各组大鼠血清TNFα水平;反转录聚合酶链反应、蛋白质印迹法检测各
组大鼠卵巢组织中TNFαmRNA和蛋白的表达水平。结果 与 C组比较,I24h组、R24h组、R48h组大鼠血清
TNFα水平、卵巢组织TNFαmRNA和蛋白水平均明显升高,差异有统计学意义(P<005);与 I24h组比较,R24h
组、R48h组大鼠血清 TNFα水平、卵巢组织 TNFαmRNA和蛋白表达水平均显著升高,差异有统计学意义(P<
005);Pa干预后,Pa+R24h组和 Pa+R48h组大鼠血清 TNFα水平、卵巢组织 TNFαmRNA和蛋白表达水平与
R24h组、R48h组比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 TNFα在大鼠卵巢缺血再灌注损伤过程中
表达上调,用Pa提取物进行干预可降低TNFα的表达水平。
关键词: 蕨麻正丁醇;大鼠;卵巢缺血再灌注损伤;肿瘤坏死因子α
中图分类号:R965 文献标志码:A 文章编号:10047239(2014)05032103
Efectofpotentilaanserinaextractontumornecrosisfactorαinacuteovaryischemiareperfusion
injuryrats
ZOUXiaoping1,DONGHuajiang2,SHANNana3,ZANGZhaohui4,SHANYunguan2
(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,theAfiliatedHospitalofLogisticsUniversityofCAPF,Tianjin300162,China;2.
DepartmentofAnatomyandHistologyandEmbryology,LogisticsUniversityofCAPF,theKeyLaboratoryoftheCorosionProtec
tionandMortalRemainsofTianjin,Tianjin300162,China;3.DepartmentofEducationalTechnology,LogisticsUniversityof
CAPF,Tianjin300162,China;4.GraduateSchool,LogisticsUniversityofCAPF,Tianjin300162,China)
Abstract: Objective Toinvestigatetheefectofpotentilaanserina(Pa)extractontumornecrosisfactorα(TNFα)
inacuteovaryischemiareperfusioninjuryrats.Methods SixtyWistarratswererandomlydividedintocontrolgroup(group
C),ischemic24hoursgroup(I24hgroup),ischemic24hours+reperfusion24hoursgroup(R24hgroup),ischemic
24hours+reperfusion48hoursgroup(R48hgroup),Papretreatment+ischemic24hours+reperfusion24hoursgroup
(Pa+R24hgroup),Papretreatment+ischemic24hours+reperfusion48hoursgroup(Pa+R48hgroup),withtenratsin
eachgroup.ThelevelsofTNFαweredetectedbyradioimmunitymethod;theexpressionofTNFαmRNAandproteinwere
detectedbyreversetranscriptionpolymerasechainreactionandWesternblotmethods.Results ComparedwithgroupC,the
serumTNFαlevel,TNFαmRNAandproteinlevelsinovarytissueofI24h,R24h,R48hgroupwereincreased(P<0.05);
comparedwithI24hgroup,theTNFαlevel,TNFαmRNAandproteinlevelsinovarytissueofR24h,R48hgroupwerein
creased(P<0.05).ComparedwithR24handR48hgroup,theserumTNFαlevel,TNFαmRNAandproteinlevelsinovary
tissueofPa+R24hgroupandPa+R48hgroupweredecreased(P<0.05).Conclusion TheexpressionofTNFαincreases
inovaryischemiaandreperfusioninjuryrats.PacanreducetheexpressionofTNFα.
Keywords: potentilaanserina;rat;ovaryischemiareperfusion;tumornecrosisfactorα
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 第31卷 第5期
2014年5月
            新乡医学院学报
JournalofXinxiangMedicalUniversity
           Vol.31 No.5 
May2014
网络出版时间:2014-04-29 16:01
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/doi/10.7683/xxyxyxb.2014.05.001.html
  附件扭转是妇科门诊常见的急腹症之一,近年
来发病率呈上升趋势,如及时干预恢复血流即为卵
巢的缺血再灌注过程;如治疗失当则可造成卵巢缺
血、坏死。本研究应用实验动物大鼠,通过扭转阻断
卵巢营养供应的血管,再现卵巢的缺血过程,再将扭
转卵巢进行复位来制作卵巢缺血再灌注模型[12]。
蕨麻正丁醇(potentilaanserina,Pa)具有抗缺血、耐
缺氧、抗感染、抗氧化等作用[35]。本研究利用大鼠
附件扭转的动物模型,复制卵巢缺血再灌注损伤,并
用中药Pa进行预处理,旨在通过大鼠卵巢缺血再灌
注损伤模型探讨 Pa对炎性因子肿瘤坏死因子α
(tumornecrosisfactorα,TNFα)的对抗作用,为临
床治疗附件扭转寻求新的治疗靶点和思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物 实验动物为健康雌性成年 Wistar
大鼠60只,体质量249~299g,军事医学科学院实
验动物中心提供,实验动物合格证号:0050143,无特
定病原体动物。
1.2 动物分组 随机数字法将60只大鼠分为假手
术组(C组)、缺血24h组(I24h组)、缺血再灌注
24h组(R24h组)、缺血再灌注 48h组(R48h
组)、Pa提取物喂养 30d+缺血再灌注 24h组
(Pa+R24h组)和Pa提取物喂养30d+缺血再灌
注 48h组(Pa+R48h组),每组10只。
1.3 实验试剂 TNFα酶联免疫吸附测定(enzyme
linkedimmunosorbentassay,ELISA)试剂盒、甘油醛
3磷酸脱氢酶(glyceraldehyde3phosphatedehydro
genase,GAPDH)抗体由上海西唐生物科技公司提
供,羧甲基纤维素由天津科瑞斯公司提供,正丁醇购
于天津大茂化学试剂厂;Pa由天津中医药大学提
供,经正丁醇萃取并经减压浓缩冷冻干燥后制得
其正丁醇浸膏,经由质量分数0.3%的羧甲基纤维
素钠溶解,配制成100mg·kg-1混悬液。
1.4 实验仪器 微创缝合针(上海医菱医疗器械
有限公司)、PT0200聚合酶链反应仪(美国 MJRe
search公司)、Westernblot电泳仪与 Westernblot电
转仪(美国BioRad公司)、手术剪、眼科镊、普通镊
子、止血钳等。
1.5 动物模型制作 (1)各组大鼠测体质量后以
氯胺酮40mg·kg-1采用腹腔注射进行麻醉,待角
膜反射减弱或消失、四肢肌张力降低后将各组大鼠
仰卧位固定至手术台。(2)选取下腹部正中切口打
开腹腔,暴露双侧输卵管、卵巢,将 I24h、R24h、
R48h、Pa+R24h、Pa+R48h组大鼠双侧附件旋转
2周,待60s后卵巢由灰白变成深红色后快速以4
号丝线将其固定于腹壁。(3)24h后复位,恢复血
流灌注,分别于24、48h后取双侧卵巢组织。对照
组仅开腹后提拉出左侧附件至切口,再放回原处关
腹。(4)Pa+R24h、Pa+R48h组则用Pa提取物进
行预处理,按0.2g·kg-1·d-1灌胃,连续30d,余同
R24h、R48h组。除Pa+R24h、Pa+R48h组,其余
组大鼠灌胃同等剂量的生理盐水。该实验所采用动
物处置方法均符合实验动物伦理学标准。
1.6 大鼠血清TNFα、卵巢组织 TNFαmRNA和
蛋白表达水平检测 各组大鼠到达目的时间点后右
心房取血,4℃,800r·min-1分离血清,按照TNFα
试剂盒说明书检测 TNFα水平;取各实验组大鼠卵
巢组织,RNA裂解液(totalRNAisolationreagent,
TRIzol)匀浆,提取总 RNA,紫外光检测样品吸光度
(A),A260/A280为1.95~2.10,应用反转录聚合酶链
反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,
RTPCR)检测TNFαmRNA表达水平;卵巢组织加
入裂解液,研磨至组织无肉眼可见的碎片,用
200μL裂解液冲洗研磨器,低温离心机,4℃
5000r·min-1离心15min,取上清液;蛋白质印迹
法检测TNFα蛋白水平变化。
1.7 统计学处理 应用 SPSS13.0统计软件进行
分析,计量资料以均数±标准差(珋x±s)表示,组间比
较采用单因素方差分析,两两比较采用 t检验,P<
0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠血清 TNFα水平变化 结果见表
1。与C组比较,I24h、R24h、R48h、Pa+R24h和
Pa+R48h组大鼠血清 TNFα水平均明显升高,差
异有统计学意义(P<0.05);与 I24h组比较,
R24h、R48h、Pa+R24h和Pa+R48h组大鼠血清
TNFα表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<
005);与 R24h组比较,R48h组大鼠血清 TNFα
水平升高显著,差异有统计学意义(P<0.05);Pa
干预后Pa+R24h组大鼠血清TNFα水平较R24h
组明显下调,差异有统计学意义(P<0.05);与
R48h组比较,Pa+R48h组大鼠血清 TNFα水平
下调显著,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2 各组大鼠卵巢组织 TNFαmRNA和蛋白表
达水平变化 结果见表 1。与 C组比较,I24h、
R24h、R48h、Pa+R24h和Pa+R48h组大鼠卵巢
组织TNFαmRNA及蛋白表达水平均明显升高,差
异有统计学意义(P<0.05);与 I24h组比较,
R24h、R48h组大鼠卵巢组织TNFαmRNA及蛋白
表达水平均明显升高,差异有统计学意义(P<
005);与 R24h组比较,R48h组大鼠卵巢组织
TNFαmRNA及蛋白表达水平升高显著,差异有统
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计学意义(P<0.05);Pa预处理后与R24h组比较,
Pa+R24h组大鼠卵巢组织TNFαmRNA及蛋白表
达水平较 R24h组下调显著,差异有统计学意义
(P<005);与R48h组比较,Pa+R48h组大鼠卵
巢组织TNFαmRNA及蛋白表达水平亦明显下调,
差异有统计学意义(P<0.05)。
表1 各组大鼠血清TNFα及卵巢组织TNFαmRNA和蛋
白的表达
Tab.1 TNFαlevelinserumandtheexpressionofTNFα
mRNAandproteininovarytissueofratsineachgroup
(珔x±s)
组别 n 血清TNFα/(μg·L-1) 卵巢TNFαmRNA 卵巢TNFα蛋白
C组 10 11.2±2.3   0.19±0.08  0.14±0.03 
I24h组 10 39.2±4.4a 0.36±0.01a 0.33±0.04a
R24h组 10 66.7±11.3ab 0.71±0.02ab 0.66±0.12ab
R48h组 10 90.0±9.4abc 0.89±0.08ab 0.81±0.07abc
Pa+R24h组 10 49.9±5.7abcd 0.55±0.03abcd 0.49±0.19abcd
Pa+R48h组 10 68.4±9.9acd 0.69±0.08abd 0.70±0.14abcd
  注:与C组比较aP<0.05;与 I24h组比较bP<0.05;与 R24h
组比较cP<0.05;与 R48h组比较dP<0.05。
3 讨论
卵巢扭转(adnexaltorsion,AT)是妇科急诊手术
的5大常见病因之一,因扭转引起卵巢损伤可导致
内分泌及生殖功能等问题,越来越受到人们的关注,
然而对扭转的卵巢进行保守性处理是非常棘手
的[13],临床多以突然发生下腹剧痛为主要症状,轻
者可在短时间内自行缓解,但易反复发作,重症 AT
不易恢复,组织缺血如及时干预恢复血液灌注即可
产生再灌注损伤,如进一步发展也可发生破裂[4]。
蕨麻为蔷薇科委陵菜属多年生草本植物,其富
含有维生素及镁、锌、钾、钙等微量元素,具有较高的
医疗和营养价值,它有着健胃补脾、生津止渴、益气
补血的功能,故藏医称其为卓老沙僧,常以其入药。
其可用来收敛止血、止咳利痰,亦作滋补。蕨麻含有
大量的淀粉、蛋白质、脂肪、无机盐和维生素,故长期
食之,确有延年益寿的功效,因此,被人们美誉为
“人参果”,具有较高的医疗和营养价值[56]。研究
表明,Pa亦具有抗缺血、耐缺氧等作用[45],基于此,
本研究力求阐明Pa对卵巢缺血再灌注损伤的保护
性作用。
TNFα是炎症早期最具影响的炎性因子之一,
是一种内源性热原质,引起发热,并诱导肝细胞急性
期蛋白的合成,还可通过白细胞介素(interleukin)
1、TNFα刺激其他细胞产生 IL6,参与了炎性损伤
的级联放大;亦可提高中性粒细胞的吞噬能力,并促
进中性粒细胞黏附到内皮细胞上,从而刺激机体局
部炎症反应,TNFα的这种诱导作用较 TNFβ
强[68]。
本实验利用大鼠AT复位制作卵巢缺血再灌注
损伤模型,阐明 Pa对 TNFα的抑制作用及间接对
缺血缺氧卵巢的保护作用,力求为卵巢的缺血再灌
注损伤寻找新的药物作用靶点。本研究结果发现,
TNFα在卵巢的缺血再灌注损伤过程中表达上调,
且Pa在卵巢缺血再灌注损伤中有明显抑制 TNFα
的作用,间接起到保护受损卵巢的作用,为 Pa在该
领域的开发利用提供了重要的实验依据。
本研究运用大鼠AT复位制作卵巢缺血再灌注
损伤模型,探讨 Pa抑制 TNFα表达水平及其间接
的卵巢保护作用,结果显示,在AT复位模型大鼠血
清TNFα、卵巢组织 mRNA、蛋白表达变化存在一
定规律,即在一定的时间范围内再灌注时间越长,
TNFα的表达水平越高;在大鼠 AT复位模型上,在
Pa干预24、48h后可降低TNFα表达水平,从而起
到保护缺血再灌注损伤后受损的卵巢。
研究表明,在缺血缺氧状态下,卵巢产生大量炎
性因子,触发自身功能异常,黏附活性改变,继而中
性粒细胞黏附内皮,侵入内皮下,释放多种促细胞损
伤的炎症介质,造成细胞损伤,其中 TNFα的炎症
效应不容小觑;而中药 Pa可作为 TNFα抑制剂的
一种天然替代品,在某些阶段可下调血清及卵巢组
织中 TNFα的表达,对受损卵巢起保护作用,减轻
卵巢缺血再灌注损伤,作为一种纯天然中药成分进
一步显示了其优势,为今后的临床应用提供一定的
理论基础。但其具体的作用机制仍需进一步深入
探讨。
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(本文编辑:徐刚珍 英文编辑:孟 月)
·323·第5期        邹晓萍,等:蕨麻正丁醇提取物对急性卵巢缺血再灌注损伤大鼠肿瘤坏死因子α的影响