全 文 ：2010年 12月 第 4期（总第 149期） 草食家畜（季刊）
干旱胁迫下新疆野生沙生冰草的
银染 mRNA差异显示分析
李 莉 1，贾纳提 1，朱 昊 1，王希东 2,3
（1.新疆畜牧科学院草业研究所，新疆 乌鲁木齐 830000；
2.新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐 830052；
3.新疆农业大学农业技术重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052）
摘 要： 运用非同位素银染 mRNA 差异显示方法， 分析新疆野生沙生冰草抗旱基因表达差异。 用 10％(-
1.0Mpa)PEG-6000 溶液处理三叶一心期冰草，以叶片 mRNA 为模板采用锚定引物和随机引物组合，进行反
转录差异显示 PCR 扩增，经 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后用银染方法差异显示 DNA 条带，在直观下，从
凝胶中回收差异带并进行再扩增，2%琼脂糖电泳得到了 DNA的单一条带。 通过分离与冰草抗旱性状相关
的基因片段 ，为进一步从分子水平上认识冰草抗旱机理 、进行抗旱相关基因的遗传操作奠定基础 。
关 键 词：银染方法；差异显示；锚定引物；mRNA
中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：1003－6377(2010)04－0026－04
收稿日期：2010-08-04
基金项目：新疆自然科学基金项目（200721109），科技支
疆项目“新疆荒漠逆境植物抗旱功能基因的筛
选与应用”（ 200840102-05）。
作者简介：李 莉（1977-），女，新疆人，助理研究员，主要
从事牧草遗传育种研究工作。
通讯作者：贾纳提（1969-），女，副研究员，研究方向为牧
草遗传育种。
mRNA 差异显示技术 (mRNA differential display，
mRNA DD—PCR) 也 称 差 示 反 转 录 PCR
(Differentialdisplay of reverse transcriptional PCR，DDRT-
PCR)，它是将 mRNA 反转录技术与 PCR 技术相互结合
发展起来的一种 RNA指纹图谱技术。 由两位美国科学
家（Liang and Pardee,1992）根据高等生物成熟的 mRNA
都带有 poly A 的特性 ［1］，用特定的锚定引物反转录后，
进行 PCR扩增，首次建立了 mRNA差异显示技术，该方
法克服了以往方法的不足， 操作简单， 快捷， 所需的
RNA 量少，重复性好，并且能同时检测到不同表达的基
因， 从而迅速成为分析植物基因差异表达的有利工具，
目前已广泛应用于生物技术各个领域，如农业、植物 ［2］、
动物［3］、医学［4］、菌类等，涉及基因诱导表达、杂种优势机
理、植物抗逆性、发育分子机理、基因克隆等方面的研
究，已成功分离到数百种基因，成为当前分离编码产物
未知目的基因的一种快速而有效的方法。 通过 PEG 一
6000(polyethyleneglycol)高渗溶液胁迫 ［5］，分离与冰草抗
旱性状相关的基因片段，为进一步从分子水平上认识冰
草抗旱机理、进行抗旱相关基因的遗传操作奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
新疆南山地区采集的野生冰草种质。DD-PCR 引物
为北京莱贝斯公司合成。分子生物试剂盒均购自上海生
工。 琼脂糖回收试剂盒购自北京天根，其它试剂均为国
产分析纯试剂。
1.2 试验方法
1.2.1 冰草幼苗的胁迫处理 幼苗 hoagland 营养液水培
法培育至三叶一心期，用 10％PEG-6000(-1.0Mpa)处理
冰草幼苗 72h 采样。
1.2.2 冰草幼苗总 RNA提取 参照 UNIQ-10柱式 Trizol
总 RNA抽提试剂盒的操作方法提取总 RNA。
1.2.3总 RNA的检测 取 5μl RNA溶液， 依次加入 1μl
5×甲醛变性胶加样缓冲液、1μl EB （800μg·ml-1），在
1%琼脂糖凝胶电泳 (缓冲液为 1×MOPS 甲醛变性缓冲
液，电压 120V)30min 后，置于 AlphaImage IS 3400 型快
速成像仪中观察、拍照。
1.2.4 DDRT-PCR
1.2.4.1 反转录合成 cDNA 参照 MMLV 第一链 cDNA
合成试剂盒的操作方法 ， 将锚定引物 5—Poly ( d T)
11G—3 与随机引物 AP4、AP6、AP8、AP9、AP10、AP11、
AP12、AP13、AP14、AP15、AP16、AP17、AP18、AP19、AP20
分别组合,按下列反应体系进行反转录。
反应体系:
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混匀后 37℃保温 1 h ,然后 72℃作用 10 min，结束
反应。
1.2.4.2 PCR 扩增及变性胶电泳检测 以反转录合成的
cDNA 为材料，按下列体系进行 PCR 扩增。
扩增程序为：94℃ 300 s, 94℃ 30 s ,40℃ 120 s,72℃
30 s 42个循环,最后 72℃延伸 10 min 。
取 8 μl 扩增产物在 6%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳 ,
200 U 电泳至第二条 loading buffer 带至胶板底部停止
电泳。
1.2.4.3 银染 （1）固定 ：脱色盘中加入 200 mL10%乙
醇，1000μL 冰乙酸混匀后剥入凝胶，摇动 3~5 min。 （2）
银染：脱色盘中加入 1000μL 的 0.4 g/mLAgNO3，摇动 5-
8 min。 （3）水洗：倒掉定影液，用蒸馏水冲洗 2~3次。 （4）
显影： 将 1000μL40%的甲醛溶液加入 200 mL3%NaOH
溶液中混匀，然后加入脱色盘中，迅速水平摇动 5 min，
至条带清晰。（5）水洗：显影清晰后，倒掉显影液，用蒸馏
水冲洗 1~2次，彻底洗净显影液，保存并读取条带数据。
1.2.5 差异带的回收、重扩增、琼脂糖电泳检测 用干净
手术刀将所需的差异带用洁净的锋利刀片切下， 置于
1.5ml EP 管中，编号并作好差异情况记录；加入无菌超
纯水 50μl，用 Tip 枪头将凝胶捣碎，煮沸 10~20min；室
温下，12000rpm，离心 5min，取上清于-20℃保存备用 。
用于 PCR 重扩增。反应体系和程序同前 PCR 扩增,注意
引物一致性。 取重扩增后反应液,用 2 %的琼脂糖电泳
检测,小心切下琼脂糖单一条带的 DNA 回收,留作阳性
鉴定。
2 结果与分析
2.1 RNA 的质量
新疆野生冰草总 RNA 经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳
观察 RNA 连续性好 , 可见 28s，18s ，5s 条带且 28s/18s
约为 2:1，OD 为 1.82。 表明提取的 RNA 符合要求,完整
性好、无蛋白质、苯酚、DNA 等的污染, 可进行后续实验
部分结果如图 1。
图 1 冰草总 RNA 的甲醛变性凝胶电泳
Fig. 1 Formaldehyde agarose gel electrophoresis of total
RNA from wheatgrass
2.2 三叶一心期冰草幼苗叶片 mRNA 差异展示的银染
图谱
程序优化后的 DDRT-PCR 银染部分结果如图 2 所
示，DNA 条带直观可见， 每一泳道均有 50 条左右大小
不同的扩增产物。 通过各组间的比较可见，1、3、5、7、9、
11、13、15、17、19、21 为新疆野生冰草即对照组，2、4、6、
8、10、12、14、16、18、20、22 为 PEG-6000 渗透胁迫下的
处理组。从图中可以看出有的差异表达片段在表达丰度
上有差异，即量的差异，有的表现为质的差异，即带的有
无（如箭头所指为特异性条带），造成这种差异现象的原
因可能是经 PEG6000 处理后，诱导一些基因的开启，或
抑制一些基因的表达，还有某些基因表达量的增加或减
少，对于仅在胁迫后表达的差异条带在以后应进行重点
验证分析，部分结果如图 2。
图 2 冰草苗期水分胁迫诱导的 mRNA 差异显示
Fig.2 Differential display analysis of mRNA induced by
water stress on wheatgrass seedling stage
2.3 差异条带重扩增

    
  
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对采用煮沸法回收后的 60 条差异条带取 2ul 作模
板进行再次 PCR 扩增，二次扩增产物用 1.0%琼脂糖电
泳检测，部分结果如图 。 差异条带经 PCR 再扩增后，出
现 4 种结果，其中（1）差异条带再扩增后无产物；（2）差
异条带再扩增后有多条带；（3） 差异条带再扩增后与原
来大小不一致；（4） 差异条带再扩增后产物多为单一条
带，目标条带片段大小与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果
基本一致，条带的大小分布范围较广，一般在 100bp 到
800bp 之间。 选择再扩增产物为单条带的差异片段进行
下一步实验。
图3 特异 cDNA 片段二次扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig.3 Agarose gel electrophoresis of reamplified specific
cDNA fragments
3 讨 论
3.1 提高 RNA 的质量
DD—PCR 是以细胞或组织的总 RNA 为模板，模板
质量的好坏直接关系到 DD—PCR 的成败 ［6］。 在提取
RNA 时，首先要保证 RNA 的完整性，不被 RNase 降解，
经过变性琼脂糖电泳检测，28S 带的亮度应是 18S 带的
两倍，表明 RNA 未被降解。 其次，RNA 要不受 DNA 污
染， 如有 DNA 污染， 在 PCR 扩增过程中， 优先扩增
DNA，造成假阳性的背景。提取的 RNA 须用无 RNase 的
DNase l 消化，去除痕量的 DNA 污染。 在实验中可设一
对照来检验 RNA 的纯度， 即省略逆转录过程而直接进
行 PCR 反应，纯 RNA 不应有扩增产物。另外，RNA 应尽
可能在相同条件下分离提取，以减少偶然误差。
3.2 PCR 循环参数的优化
降低 dNTP 浓度：有的研究表明 ［7］，将 dNTP 终浓度
降低到 10 mmol/ L， 在保证产物产量和特异性的前提
下，能最大限度地提高同位素的掺人率，从而提高序列
胶的分辨率。 退火温度：研究表明，当退火温度在 42℃
以上时，电泳条带急剧减少；低于 40℃时，则特异性显
著降低，扩增产物增多，电泳带呈 smear 状。 因此，退火
温度多选用 40℃~42℃。 也有研究采用前几个循环在
40℃，1～5 个循环后提高到 45℃的方法。
3.3 凝胶电泳及银染显色
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）为低相对分子质量核
酸提供高分辨率分离 ［8］，特别是小于 500bp 的 DNA 片
段，用一般琼脂糖凝胶电泳很难分离，而在 PAGE 上很
容易就把它们分开。随着网眼的大小（3.5%~20%聚丙烯
酰胺），可以把 10~1000bp 的片段区分开来。 Bauer 等初
次将非变性凝胶电泳用在差显技术上,依据是大多数双
链 DNA 在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率大略与
其大小的 log 对数值成反比, 但迁移率也受其碱基组成
和序列的影响, 以致大小完全相同的 DNA 其迁移率可
相差达 10%。 本研究采用了非变性凝胶电泳,此方法降
低了显示谱带的复杂性。
我们应用银染差异显示法通过优化实验程序 ［9］,发
现银染 mRNA 差异显示法分离差异基因快速简便,灵敏
度高。 可保证获得足够的 DNA 条带总数和产量,每一泳
道上可显示 10～50 个条带；DNA 条带直观可见, 回收时
只需在肉眼下将 DNA 差异条带直接从湿的凝胶上切
下。 银染的灵敏度相当高,有证据 5～10pg 的 DNA 条带
即可显色,DD-PCR 结束即可电泳银染,时间周期短。 避
免了放射自显影同位素污染、效率低、周期长等问题，
资料表明 ［10］：为提高同位素标记参入量，需降低相应的
dNTP 浓度和 PCR 反应动力学矛盾， 降低了反应效率，
常导致扩增失败；凝胶条带肉眼不可见 ,放射自显影与
真实带的轻微错位常导致回收失败,干燥凝胶切下的条
带常常不是单一条带； 需要同位素配套设备带来不便,
虽然有替代同位素,如荧光标记的非同位素操作方法,避
免了同位素污染, 但实验成本仍较高, 对引物设计,PCR
条件、凝胶电泳条件、标记物要求严格,很难证明特别降
低假阳性克隆,实验操作不如银染简单易行,但仅是银染
技术也无法完全避免差异显示技术假阳生率高的弱点。
本实验验证了银染差异显示对基因表达差异分析的简
便性、灵敏性 ,用此方法将进一步结合 Reverse Northern
筛选阳性克隆,最终通过 Northen 分析、克隆、测序,为在
分子水平上探讨抗旱机理、预测、利用抗旱基因作一些
努力提供了一条较好的途径。
4 结 论
1)采用 UNIQ-10 柱式 Trizol 总 RNA 抽提试剂盒可
以高质量提取冰草叶片中的总 RNA, 提取的总 RNA 完
整性好 , 无蛋白质、 苯酚、DNA 等的污染 , 可用于 RT-
PCR 等分子生物学实验。 2) 新疆野生冰草即对照组与
PEG-6000 渗透胁迫下的处理组对 26 个随机引物进行
筛选， 其中引物 AP1、AP2、AP3、AP4、AP5、AP6、AP7 扩
增结果较好，扩增出差异性条带,表明在渗透胁迫下 ,基
因表达有较大差异。
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（下转第 32 页）
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2010年 12月 第 4期（总第 149期） 草食家畜（季刊）
Silver - staining mRNA Differential Display Analysis of
Agropyron desertorum Schult at Drought Stress
LI Li, JIA Na-ti,ZHU Hao,WANG Xi-dong
((1.Grsaaland Research Institute,Xinjiang Academy of Animal Sciences,Urumqi 830000,China,2.College of
Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China,3.Key Lab.of Agricultural Technology,
Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China)
Abstract : mRNA differential display polymerase chain reaction (DD - PCR) method with silver - staining ,
was used to isolate the differentially expressed gene of Agropyron desertorum (Fisch.) Schult. With 10% (-
1.0Mpa) PEG-6000 solution treatment with wheatgrass, Total RNA was extracted from Wheatgrass at the
three - leaf stage. The cDNA copies of differentially expressed mRNA were identified by means of reverse
transcription with anchor primer and amplified by subsequent PCR with sets of anchor primer and arbitrary
primer. The DNA bands on gel were displayed by silver stain method after electrophoring in urea - denaturing
sequencing gel . The differentially expressed bands were visually retrieved and reamplified , most of which
obtained one band when visualized in 2 % agarose gels. Isolated the drought-related gene fragments from
wheatgrass, in order to further understand the drought resistance mechanism in molecular level, and lay the
foundation for the genetic operation of wheatgrass.
Key words :silver - staining ;differential display ; anchor primer ; mRNA
（上接第 28页）
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!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
Analysis of the Genetic Structure of Laoshan Milk Goat
GE Xin1,LI Pei-pei1，LI Cheng-bo2，WANG Jian-hua1，ZHANG Bao-xun1，WANG Jian-min2
(1.Qingdao Research Institute of Husbanary and Veterinary, Shandong Qingdao 266100, China；
2.College of Animal Science and technology, Shandong Agricultural University,Taian, Shandong271018,China)
Abstract：The genetic diversity of Laoshan Milk Goat was surveyed using microsatellite technology. By means
of the average number of effective migrants exchanged per generation, genetic distance, F -statistics and
bottleneck analysis, the genetic structure of Laoshan Milk Goat was estimated. The results were as follows: the
polymorphism information contents of population were 0.4180 to 0.8019. The average heterozygosity of
population was 0.7035, the Fst was 38.8%. The result of bottleneck analysis showed the Laoshan Milk Goat
population hasnt exhibited a significant number of loci with heterozygosity excess under infinite allele model;
the Laoshan Milk Goat population exhibited a significant number of loci with heterozygosity excess under
stepwise mutation model under stepwise mutation model (the average heterozygosity was 0.765), which
indicated the Laoshan Milk Goat population had experienced a recent reduction of its effective population
size. The results could establish scientific basis for the conservation and utilization of Laoshan Milk Goat
breed resource.
Key words：microsatellite; Laoshan milk goat; genetic structure
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