全 文 ：书第 43卷 第 3期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol．43 No．3
2015年 3月 JOUＲNAL OF NOＲTHEAST FOＲESTＲY UNIVEＲSITY Mar． 2015
1)中国博士后基金项目(20110491124) ;东北林业大学大学生
创新项目(201310225110)。
第一作者简介:夏彦玲，1974 年 10 月生，东北林业大学野生动
物资源学院，副教授;黑龙江省农业科学院博士后科研工作站，博士
后。E－mail:xiayanling1974@ 163．com。
收稿日期:2014年 9月 24日。
责任编辑:程 红。
鹿茸不同生长期 MALAT1基因的差异表达1)
夏彦玲 桂姗姗 喻月婷 敖艳霖 曲昊淼
(东北林业大学，哈尔滨，150040)
摘 要 以不同生长期的鹿茸尖端组织为材料，采用 mＲNA 差异显示技术检测不同生长期鹿茸尖端间充质
组织的差异表达基因。对其中一条差异表达片段进行克隆测序分析，得到 400 bp左右的片段，与野猪的非编码基
因 MALAT1有高度同源性，同源性为 90%。进一步实时荧光定量 ＲT－PCＲ鉴定发现，该基因在鹿茸生长发育的前
期和中期表达量高于后期，该基因在鹿茸快速生长期的上调表达暗示其在鹿茸生长发育过程中发挥作用，是鹿茸
生长发育相关基因的候选基因。
关键词 鹿茸;mＲNA差异显示;差异表达基因;MALAT1;实时荧光定量 ＲT－PCＲ
分类号 S825．2
MALAT1 Gene Differential Expression of the Antler Tissue in Different Stages / /Xia Yanling，Gui Shanshan，Yu
Yueting，Ao Yanlin，Qu Haomiao(Northeast Forestry University，Harbin 150040，P． Ｒ． China)/ / Journal of Northeast
Forestry University，2015，43(3):104－106．
We screened the specially expressed cDNA fragments of mesenchymal layer in different stages by mＲNA differential
display polymerase chain reaction (DD-PCＲ)． We chose a band displayed significantly differential expression to clone，
check and analyze． The fragment (400 bp)had highly homology to Metastasis-associated in lung adenocarcinoma transcript
1(MALAT1)with the homology of 90% to Sus scrofa’s MALAT1． By real time ＲT-PCＲ，the expression level of MALAT1
gene in early and middle stages was higher than the expression level in late stage． The special up-regulation of MALAT1
gene in rapid growth period implied it might be an important factor in the process of growth and development of antler．
Keywords Antler;mＲNA differential display;Differential expression gene;MALAT1;Ｒeal time ＲT-PCＲ
肺腺癌转移相关转录本(MALAT1)全长 8．7 kb，
缺乏有意义的开放式阅读框，该基因高度进化保守，
部分区域存在种属间序列高度同源的特点。MAL-
AT1属于核内保留 ＲNA，主要通过与细胞核内多种
蛋白质相互作用，在转录水平和转录后水平参与基
因的表达调控。该基因虽然不直接编码蛋白，但对
多种肿瘤的增殖、凋亡、侵袭转移、耐药都有不同程
度的影响［1－3］。
鹿茸是鹿科雄性动物的第二性征，是唯一可以
进行再生的组织器官，鹿茸组织在快速生长期增殖
分化非常迅速，鹿茸生长速度最快可达每天 2 cm，
超过任何哺乳动物骨组织的生长速度。高光志［4］
对梅花鹿(Cervus nippon)鹿茸的生长发育过程进行
研究，发现鹿茸生长过程分为生长期和骨化期。生
长期生长占优势，骨化缓慢。骨化期内，鹿茸迅速骨
化，沉积大量矿物质，阻碍鹿茸的生长，所以，鹿茸的
生长速度快速下降。据此可以推断其所表现的各种
独特性状必定来源于基因表达的差异。
鹿茸尖端组织是茸角的生长分化中心，鹿茸的
快速生长主要取决于尖端组织生长中心细胞的分裂
增值速度，生长中心细胞主要分布在增殖区，即间充
质、前软骨和软骨区，间充质组织是未分化的细胞。
本研究以不同生长期的鹿茸尖端间充质组织为材
料，通过 DD－PCＲ检测出一条 400 bp左右的差异表
达片段，对其进行克隆测序分析，通过 real－time ＲT－
PCＲ验证该基因在鹿茸不同生长期的表达差异，进
一步研究其在鹿茸生长发育过程中的作用。
1 材料与方法
1．1 材料
选取人工驯养的一头健康成年东北梅花鹿作为
试验动物。小鞍子茸期型时采集左茸顶端组织作为
前期试验样品，二杠茸型时采集右茸顶端组织作为
中期试验样品，被锯的左茸再长至三杈茸型时采集
其顶端组织作为后期试验样品，分别截取 3 个时期
的鹿茸顶端 5 cm左右，表面迅速消毒，纵向剖开，按
照 Li等［5］所述的方法采取鹿茸顶端的间充质组织，
按每管大约 100 mg分装于冻存管中，迅速放入液氮
罐中保存，备用。
1．2 方法
差异显示 PCＲ:按照 Trizol 试剂的操作步骤分
别提取不同生长期鹿茸间充质组织的总 ＲNA，1%
琼脂糖凝胶电泳和紫外分光法检测总 ＲNA 质量。
以提取的总 ＲNA 为模板，以锚定引物为反转录引
物，以 M－MLVⅢ逆转录酶反转录合成 cDNA。差异
显示 PCＲ反应体系为 25．00 μL，2．50 μL 10×PCＲ缓
DOI:10.13759/j.cnki.dlxb.20150120.013
冲液，2．50 μL dNTP(2．5 mmol) ，2．00 μL MgCl2(25
mmol·L－1) ，4．00 μL 锚定引物 M(10 mmol·L－1) ，
0．80 μL随机引物 S(10 mmol·L－1) ，0．125 μL rTaq
DNA聚合酶(5 U·μL－1) ，3．00 μL cDNA，用超纯水
补足 25．00 μL。在 PCＲ 仪上，94 ℃预变性，5 min;
94 ℃ 30 s，42 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min(40 个循环);最
后 72 ℃延伸 10 min。引物序列见表 1。
表 1 引物序列
引物 扩增长度 /bp 序列(5－3)
M AAG CTT TTT TTT TTG
S1 GGT ACA TTG G
S2 TAC CTA AGC G
S3 CTG CTT GAT G
MALAT1F /Ｒ 119 F:CCTCTCCTCCTCCCTTCCC
Ｒ:ACGCTTGGCTCTGCCTTCT
β－actin F /Ｒ 173 F:GCGTGACATCAAGGAGAAGC
Ｒ:GGAAGGACGGCTGGAAGA
银染、差异显示条带的回收及再扩增:差异显示
PCＲ产物采用 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，
银染后切下差异表达条带，并用煮沸法回收。以回收
产物为模板进行二次 PCＲ 扩增，反应体系及条件同
差异显示 PCＲ。将 PCＲ产物在 1%琼脂糖凝胶上电
泳，以鉴定二次扩增的产物是否与回收片段一致。
克隆及序列分析:按照 DNA胶回收试剂盒使用
说明，将二次扩增 PCＲ 产物进行纯化回收，并与
pMD18－T 载体连接后转入感受态细胞。挑选白色
单菌落进行 PCＲ鉴定，含阳性重组质粒的菌液送于
华大公司测序。
MALAT1实时荧光定量 ＲT－PCＲ 分析:分别以
不同生长期鹿茸间充质组织的总 ＲNA 为模板，以
Oligo－dT 为引物，以 M－MLVⅢ逆转录酶反转录合
成 cDNA。根据 GenBank 上发表的野猪等物种
MALAT1基因序列合成同源性引物(表 1)，对鹿茸不
同生长时期的 MALAT1 基因表达量进行定量分析。
PCＲ 反应体系(25 μL)包括，SYBＲ Premix EX Taq
TM Ⅱ(2×)12．5 μL，cDNA模板 1．0 μL，上游及下游
引物(10 mmol·L－1)各 1．5 μL，加高压灭菌水补足
体积至 25 μL。反应程序，95 ℃ 30 s，在 95 ℃ 5 s，58
℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环 40次，通过 2－ΔΔCt法来计算
分析基因在不同时期的相对表达量。每个样品 3 个
重复，C t 值取平均值;计算目的基因的平均 C t 值与
内参基因的平均 C t 值的差 ΔC t;通过每个样品的
ΔC t 值减去对照样品的 ΔC t 来确定 ΔΔC t 值。
2 结果与分析
2．1 鹿茸生长发育差异表达基因的筛选
3个不同时期的间充质总 ＲNA经琼脂糖凝胶检
测后，清晰可见 28 S、18 S和 5 S条带(图 1)，OD260/280
比值为 1．8～2．0。检测结果表明，所提 ＲNA完整性较
好，纯度较高，符合 DDＲT－PCＲ对模板的要求。
M 后期 中期 前期
图 1 不同生长期鹿茸间充质组织的总 ＲNA电泳
将 3个不同时期的鹿茸间充质 ＲNA 经反转录
后，以 cDNA为模板利用锚定引物和随机引物 3 对
物组合进行 DDＲT－PCＲ 扩增，PCＲ 产物经 8%非变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染及显色后即可进行差
异表达片段的筛选(图 2)，选取其中的一条差异条
带经二次 PCＲ 后(图 3) ，进行 PCＲ 产物的回收、纯
化及克隆。
后 中 前 M
图 2 差异表达片段聚丙烯酰胺凝胶电泳
2．2 差异表达基因的克隆及序列比对
选取一条中期表达量最高的差异条带，经二次
PCＲ扩增成功后，将该片段纯化连接到 pMD18－T
载体后转入感受态细胞，37 ℃培养过夜后挑取白色
单菌落进行 PCＲ 鉴定，PCＲ 鉴定结果与预期相符，
且条带单一，证明所挑取的单菌落为阳性克隆，送交
华大公司测序。片段大小在 400 bp 左右，它在鹿茸
生长中期表达量最高，前期至中期表达上调，中期至
后期表达下调。登陆到 NCBI 网站 http:/ /www．nc-
bi．nlm．nih． gov /，用 BLAST 软件对测出的差异条带
序列与 GenBank 中的 EST 库中已有的序列进行比
对。结果显示，该差显基因与野猪的 MALAT1 基因
501第 3期 夏彦玲，等:鹿茸不同生长期 MALAT1基因的差异表达
高度同源，同源性为 90%。
M 差异条带
图 3 差异片段的二次扩增
2．3 MALAT1基因的 real time ＲT－PCＲ分析
经熔解曲线分析，β－actin 和 MALAT1 基因分别
在 89 ℃和 81．5 ℃出现单一产物峰。表明引物特异性
良好，无非特异性产物及引物二聚体等生成(图 4)。
图 4 MALAT1、β－actin溶解曲线
实时荧光定量 ＲT－PCＲ 的结果显示，MALAT1
基因在鹿茸生长前期和中期表达量显著高于后期，
中期表达量最高(表 2)。
表 2 鹿茸间充质组织不同生长期 MALAT1基因表达水平的
检测结果
生长期
β－actin
平均 CT值
MALAT1
平均 CT值
ΔCT ΔΔCT1 2－ΔΔct1
前期 17．95±0．32 20．14±0．03 2．20±0．34 0 1
中期 17．99±0．10 19．72±0．23 1．73±0．32 －(0．47±0．21) 1．39±0．20
后期 17．25±0．43 21．79±0．10 4．54±0．46 2．34±0．64 0．21±0．08
3 结论与讨论
利用 3对引物进行 DD－PCＲ 筛选鹿茸生长发
育相关功能基因，共发现 7 条差异条带，每对引物 3
个重复，选取重现性高，二次 PCＲ 扩增正确的一条
差异条带进行回收克隆测序，降低了假阳性，增加了
差异表达条带的可靠性，利用 NCBI 上的 BLAST 软
件进行比对，确定该基因为长链非编码基因———
MALAT1基因。
MALAT1虽然不编码蛋白质，但却广泛参与机
体生理和病理的过程。MALAT1 广泛表达于哺乳动
物正常组织，并在人类多种肿瘤组织中高表达。研
究显示，MALAT1 在骨髓、脑、软骨、胚胎干细胞、食
管、胆囊、卵巢、肌肉等组织恶性肿瘤中的表达均不
同程度上调［6］。Garen 等［7］指出 MALAT1 过度表达
可下调肿瘤抑制因子 PSF，共同参与肿瘤发生。也有
研究发现下调 MALAT1 能有效抑制直肠癌细胞转
移［8］。Guo等［9］发现在宫颈癌细胞株中，沉默 MAL-
AT1会导致 Bcl－2、Bcl－xL 下调、Bax 上调，从而促进
细胞凋亡。Bernard等［1］在对心肌、脑、肾、脾脏等细胞
进行 ＲNA原位荧光杂交后发现，MALAT1在上述细胞
的核内定位，均集中在核小斑结构。核小斑是储存、加
工mＲNA前体剪接因子的重要场所，可招募、储存、修
饰、组装信使 ＲNA 前体加工因子［10］，这说明 MALAT1
在 mＲNA前体的加工过程中可能发挥重要作用。
鹿茸生长发育分为生长期和骨化期，生长期以
生长为主，骨化缓慢，骨化期生长速度下降，骨化增
强。本试验通过实时荧光定量 ＲT－PCＲ 发现 MAL-
AT1基因的表达量前期至中期表达上调，中期至后
期表达下调，中期(快速生长期)MALAT1 基因的表
达量最高，该基因在生长期表达量显著高于骨化期，
提示该基因可能是促使鹿茸快速生长的候选基因之
一，其发挥作用的机制可能与 MALAT1 参与鹿茸发
育相关功能基因的转录水平和转录后水平的表达调
控有关，也可能通过调控鹿茸间充质细胞凋亡通路
中的 Bcl－2和 Bcl－XL来影响细胞的凋亡实现。
参 考 文 献
［1］ Bernard D，Prasanth K V，Tripathi V，et al． A long nuclear-re-
tained non-coding ＲNA regulates synaptogenesis by modulating
gene expression［J］． EMBO J，2010，29(18):3082－3093．
［2］ 王国娟，余文燕，季青．长非编码 MALAT1的研究进展［J］．实用
医学杂志，2012，2(2):3662－3667．
［3］ 江艳，李跃辉，李官成． MALAT － 1 与肿瘤［J］．生命的化学，
2013，3(2):101－105．
［4］ 高志光．梅花鹿鹿茸生长与骨化关系的研究［J］．特产研究，
1999(3):51－53．
［5］ Li Chunyi，Clark D E，Lord E A，et al． Sampling technique to
discriminate the different tissue layers of growing antler tips for
gene discovery［J］． Anat Ｒec，2002，268(2) :125－130．
［6］ Wilusz J E，Sunwoo H，Spector D L． Long noncoding ＲNAs:func-
tional surprises from the ＲNA world［J］． Genes Dev，2009，23
(13) :1494－1504．
［7］ Garen A，Song X． Ｒegulatory roles of tumor-suppressor proteins
and noncoding ＲNA in cancer and normal cell functions［J］． Int J
Cancer，2008，122(8) :1687－1689．
［8］ Xu Chuan，Yang Minhui，Tian Jie，et al． MALAT-1:a long non-
coding ＲNA and its important 3 end functional motif in colorectal
cancer metastasis［J］． Int J Oncol，2011，39(1) :169－175．
［9］ Guo F，Li Y，Liu Y，et al． Inhibition of metastasis － associated
lung adenocarcinoma transcript 1 in CaSki human cervical cancer
cells suppresses cell proliferation and invasion［J］． Acta Biochim
Biophys Sin (Shanghai) ，2010，42(3) :224－229．
［10］ Carter K C，Taneja K L，Lawrence J B，et al． Discrete nuclear
domains of poly(A)ＲNA and their relationship to the functional
organization of the nucleus［J］． J Cell Biol，1991，115(5) :1191－
1202．
601 东 北 林 业 大 学 学 报 第 43卷