全 文 ：土壤盐害是制约农业发展的非生物胁迫因素
之一，为了适应盐胁迫，植物在进化过程中形成了
适应高盐环境的机制[1-2]。 盐胁迫对植物的影响主要
表现为离子胁迫、渗透胁迫和氧化胁 [3]，植物液泡膜
Cloning and Expression Analysis of Vacuolar H+-PPase Gene
from Salsola ferganica
HE Yi1,QIAN Wenjie1,YUAN Lei1,LI Rong1,TAN Lan1,XIE Quanliang1,LI Hongbin1,2
(1 College of Life Sciences of Shihezi University,Shihezi 832003, China;
2 Key laboratory of Agrobiotechnology of Shihezi University,Shihezi 832003,China)
Abstract:Plant vacuolar H+-translocating inorganic pyrophosphatase （V-H+-PPase）can acidify vacuoles and power the vacuolar secondary
active transport system,which plays an important role in plant salt tolerance.In this study,a vacuolar H+-PPase gene was cloned
from Salsola ferganica by RT-PCR and RACE with a 2738 bp full-length cDNA sequence and a 2301 bp open reading frame
（ORF）which encoding a putative polypeptide of 766 amino acids.Sequence analysis showed that SfVP protein belonged to the H +-
translocating inorganic pyrophosphatase superfamily and had classic H +-PPase multidomain.SfVP protein contains 12
transmembrane structures with strong hydrophobicity.Sequence alignment analysis based on amino acid sequences indicated that
SfVP had 3 conservative sequence regions including CS1,CS2 and CS3.CS1 contains conservative substrate binding sites,which
showed 95.3% similarity with tobacco NtVP.Semi -quantitative RT -PCR results revealed that transcription level of SfVP
increases gradually with the increase of treatment time under 600 mmol/L NaCl stress,and maintains a high express abundance
after 12 hour treatment.
Key words：Salsola ferganica;vacuolar H+-PPase;RACE;salt stress
收稿日期：2013-10-22
基金项目：新疆兵团种质资源创新专项（2012BB050），石河子大学创新团队项目（2011ZRKXTD-0603），石河子大学 SRP 项目
（SRP20130068）
作者简介：贺怡(1989-)，女，硕士研究生，专业方向为植物分子遗传学，e-mail:heyiecho@126.com。
通信作者：李鸿彬(1980-)，男，教授，硕士生导师，从事植物分子生物学与基因工程研究，e-mail:lihb@shzu.edu.cn。
文章编号：1007-7383(2014)03-0319-06
费尔干猪毛菜液泡膜氢离子焦磷酸酶基因SfVP
的克隆、序列分析及表达
贺怡 1,钱雯婕 1,袁磊 1,李榕 1,谭兰 1, 谢全亮 1,李鸿彬 1,2
（1 石河子大学生命科学学院，石河子 832003; 2 石河子大学农业生物技术重点实验室，石河子 832003）
摘要：植物液泡膜氢离子焦磷酸酶（Vacuolar H+-PPase,VP）能够酸化液泡并为液泡的次级转运系统提供能量，在植物耐
盐性方面发挥着着重要作用。 本研究采用 RT-PCR 结合 RACE 方法，从费尔干猪毛菜中（Salsola ferganica）克隆得到液
泡膜质子焦磷酸酶基因 SfVP，该基因的 cDNA 全长 2738 bp，包含 1 个 2301 bp 的完整开放读码框（ORF），编码 766 个
氨基酸的多肽。氨基酸序列分析表明其属于 H+-转运无机焦磷酸酶超家族成员，具有典型的 H+-PPase 结构域，其疏水性
较强，含有 12 个跨膜螺旋结构。 SfVP 序列比对显示具有 H+-PPase 的 3 个保守序列 CS1、CS2 和 CS3，其中 CS1 中含有
保守的底物催化位点，与烟草的 NtVP 氨基酸序列相似性为 95.3％。 半定量 RT-PCR 结果表明，SfVP 的转录表达丰度随
着 600 mmol/L NaCl 处理时间的增加而升高，处理 12 h 后显著增加并一直维持在较高水平。
关键词：费尔干猪毛菜；液泡膜氢离子焦磷酸酶；RACE；盐响应表达
中图分类号：Q781；Q949.745.1 文献标志码：A
第 32 卷 第 3 期
2014年 6月
石河子大学学报(自然科学版)
Journal of Shihezi University(Natural Science)
Vol.32 No.3
Jun.2014
DOI:10.13880/j.cnki.65-1174/n.2014.03.003
氢离子焦磷酸酶 （vacuolar H+-Pyrophosphatase，V-
H+-PPase）作为质子泵，能够水解 PPi 将 H+泵到液
泡中，从而形成 H+梯度，驱动 Na+/H+逆向运输体将
进入植物细胞质内的 Na+离子区隔化到液泡中，降
低 Na+对植物细胞器的伤害[4-6]。
在植物液泡膜中存在着大量的 V-H+-PPase，由
大约 71~80 ku 分子量的单一多肽链组 [7]。 V-H+-
PPase 作为一种有效的质子泵调节细胞的酸度，在
驱动各种离子在液泡内的区隔化方面发挥着重要
作用 [8]。 研究表明盐胁迫下 V-H+-PPase 的活性增
加，在植物耐盐性方面起着重要作[9]。
泌盐植物费尔干猪毛菜（Salsola ferganica）是藜
科植物中适应盐碱生境为数不多的先锋植物之一，
具有重要的经济和生态价值[10]。 在长期的自然选择
进化中，费尔干猪毛菜形成了稳定的耐盐机制。 本
研究以费尔干猪毛菜为材料， 克隆了 1 个编码 V-
H+-PPase 的同源基因，对获得的基因序列进行分析
和比较， 并分析了该基因响应盐胁迫时表达特征，
旨在为该基因的利用奠定基础，为费尔干猪毛菜耐
盐机制的解析提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
费尔干猪毛菜种子采自新疆石河子蘑菇湖。 种
子用 70%酒精浸泡 90 s，0.1% HgCl2 处理 6 min，
无菌水冲洗 5 次后接入 MS 基本培养基上， 在 23
℃、12 h光照/12 h黑暗的培养箱中培养。 当幼苗生
长至 20 d 时， 移入沙土中 （沙土采自石河子蘑菇
湖）， 继续生长 30 d 后幼苗用 600 mM NaCl 胁迫
幼苗 0、6、12、24、48、96 和 144 h， 将处理后的材料
经液氮速冻后-70 ℃保存备用。
1.1.2 菌株与质粒
大肠杆菌菌株 E.coli DH5ɑ 由本实验室保存；
克隆载体为大连宝生物 pMD19-T vector。
1.1.3 酶及生化试剂
TRIzol 试剂购自 Invitrogen 公司 ，SMARTTM
RACE cDNA Amplification Kit 购自 Clontech 公司，
RNA反转录试剂盒、TaKaRa LA Taq DNA 聚合酶、
T4-DNA连接酶、XmaⅠ、SacⅠ等相关酶购自大连宝
生物公司；DNA 凝胶回收试剂盒、 质粒提取微量试
剂盒购自 TIANGEN 公司； 其他相关试剂均为国产
分析纯，购自上海生工生物工程公司。
1.2. 方法
1.2.1 费尔干猪毛菜总 RNA的提取和 cDNA合成
用 TRIzol抽提费尔干猪毛菜总 RNA，提取方法
见试剂盒说明书。 整个实验操作严格按相关要求进
行，防止 RNase污染。 提取的 RNA在经 DEPC处理
的 1%琼脂糖凝胶上电泳 ，Goldview 染色后检查
RNA 的完整性。 所使用的研钵经 180 ℃高温烘烤
8 h，其他器皿均用 DEPC 水处理。 以总 RNA 为起
始材料 ， 根据 TaKaRa RNA 反转录试剂盒获得
cDNA。
1.2.2 SfVP 基因的克隆
1.2.2.1 核心片段扩增
根据 NCBI 上登录的液泡膜 V-H+-PPase 基因
的保守序列，利用 Primer Premier 5.0 设计 RT-PCR
扩增引物 P1和 P2（表 1）。
表 1 引物序列
Tab.1 primer sequences
引物名称 引物序列
P1 5′-AAGGCATTCAACTGACCGTG-3′
P2 5′-TCAGTAGGTGAGCCTGGGAC-3′
引物用途
SfVP 基因核心片段扩增
5′-GSP1 5′-AAGCAACCACAAGAGCAGCACAGGA-3′
5′-RACE
5′-GSP2 5′-TCCTGTGCTGCTCTTGTGGTTGCTT-3′
3′-GSP1 5′-CGGCAAAGTTGAAAGAAACATCCCGG-3′
3′-RACE
3′-GSP2 5′-GATCAGCTCCATTGGTATCCTGGTTTGC-3′
Forward 5′-TCCCCCCGGGATGGGTTCTATTCTTCCTCCAGATCT-3′
SfVP基因 ORF扩增
Reverse 5′-TTGCGAGCTCGAGGAACTTGAAGAGCAAGCCACC-3′
RT-SfVP-F 5′-AAGCCCGCTCTTTTCACTG-3′ 半定量 RT-PCR目的
基因引物RT-SfVP-R 5′-AAAGACCTTCCCAGTCATCG-3′
RT-Actin-F 5′-ATCCTCCGTCTTGACCTTG-3′ 半定量 RT-PCR内参
基因引物RT-Actin-R 5′-TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3′
石河子大学学报（自然科学版）320 第 32 卷
图 1 显示： 提取的总 RNA 呈现 28S、18S 完整
条带，前者含量约为后者的 2 倍，说明 RNA 完好，
可以用于继续进行后续的实验工作(图 1A)。 以反转
录得到的费尔干猪毛菜 cDNA 为模板，利用保守引
物扩增获得 1 条约为 1100 bp 的中间条带，将此片
段测序， 经 Blast X 比对分析， 发现该序列与烟草
NtVP（GenBbank 登录号：CAA58701）氨基酸相似性
为 94%，表明该序列可能为费尔干猪毛菜质子焦磷
酸酶基因。 通过 5′RACE扩增得到约 770 bp的 5′
端 cDNA 序列，通过 3′ RACE 扩增得到约 1800 bp
的 3′端 cDNA 序列，将 3 个片段拼接起来得到 1 条
全长 2738 bp 的 cDNA 序列，预测得到最长的开放
阅读框（ORF）为 2301 bp。 根据该 ORF序列设计扩
增引物，扩增得到 1 个约 2.3 kb 的 cDNA 序列（图
1B）。 测序结果与拼接的编码序列完全吻合，扩增得
到了费尔干猪毛菜质子焦磷酸化酶基因，将该基因
以上述获得的 cDNA 为模板，进行 RT-PCR 扩
增，反应条件：94 ℃预变性 3 min 后，94 ℃变性 30
s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环后，
72 ℃延伸 10 min。
PCR产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回
收试剂盒回收目的片段并连接到 pMD19-T 载体
上，转化大肠杆菌 DH5ɑ。 挑取阳性克隆于 LB 培养
基中过夜摇菌，小量提取质粒经酶切鉴定，将鉴定
正确的质粒交由北京六合华大基因科技股份有限
公司测序。
1.2.2.2 5′RACE和 3′RACE扩增
根据 SfVP 基因的核心片段序列，设计 5′RACE
和 3′RACE 特异性引物分别为 5′-GSP1、5′-GSP2
和 3′-GSP1、3′-GSP2（表 1）。 RACE 反应体系和扩
增条件均按照。
SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 说
明书进行，目的片段的检测和测序同 1.2.2.1。
1.2.2.3 SfVP 基因开放阅读框（ORF）的扩增
根据核心片段序列、5′RACE 和 3′RACE 序列，
拼接得到 SfVP 基因全长 cDNA 序列 ， 利用 ORF
Finder （www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf/.html） 寻 找
ORF， 在上下游引物的两端添加 XmaⅠ、SacⅠ的酶
切位点 (下划线 )， 设计引物命名为 Forward 和
Reverse（表 1）进行 ORF扩增。
反应条件：94 ℃预变性 3 min 后，94 ℃预变性
30 s，60 ℃退火 30 s，72℃延伸 1.5 min，35 个循环
后，72 ℃延伸 10 min， 目的片段的检测和测序同
1.2.2.1。
1.2.3 蛋白质序列比对和结构域分析
蛋白质序列比对通过 DNAMAN 软件和 NCBI
网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/完成， 利用MEGA
5.0软件完成进化树构建。
1.2.4 半定量 RT-PCR检测
采用 RT-PCR 技术检测 600 mmol/L NaCl 处
理 0、6、12、24、48、96、144 h 全株 SfVP 的表达量差
异， 反转录操作按照试剂盒说明进行。 引物序列
RT-SfVP-F和 RT-SfVP-R（表 1）。 反应条件：94 ℃
预变性 3 min 后，94 ℃预变性 30 s，57℃退火 30
s，72 ℃延伸 30 s，25 个循环后，72 ℃延伸 5 min。
内参基因 Actin（GenBbank 登录号：FJ560483）引物
RT-Actin-F和 RT-Actin-R（表 1）。反应条件：94 ℃
预变性 3 min 后，94 ℃预变性 30 s，57 ℃退火 30
s，72 ℃延伸 30 s，25个循环后，72 ℃延伸 5 min。
2 结果与分析
2.1 费尔干猪毛菜 SfVP基因克隆
利用 TRIzol抽提费尔干猪毛菜叶片总 RNA，结
果见图 1。
M:Marker Ⅲ；1：中间片段扩增产物；2：5′RACE PCR 扩增产物；3：3′RACE PCR扩增产物；4：SfVP 全长基因 PCR 扩增产物
图 1 SfVP 基因的克隆
Fig.1 Cloning of SfVP gene
A：费尔干猪毛菜总 RNA 提取电泳图 B：全长 SfVP 基因扩增
第 3 期 321贺怡，等：费尔干猪毛菜液泡膜氢离子焦磷酸酶基因 SfVP 的克隆、序列分析及表达
粗线框：保守区域 CS1；虚线框：保守区域 CS2；细线框：保守区域 CS3；*：底物结合位点
图 4 SfVP 的序列比对分析
Fig.4 Sequence alignment analysis of SfVP protein with other plant V-H+-PPase proteins
图 3 SfVP 跨膜结构域测
Fig.3 Transmembrane region prediction of SfVP
SfVP 蛋白包含 12 个跨膜结构域 。 利用
DNAMAN 软件对 H+-PPase 进行疏水性分析，SfVP
位于正值区域内的氨基酸残基的分数较大， 说明
SfVP的疏水性较强，亲水性较弱。 疏水性较强的氨
基酸残基，位于该蛋白质跨膜区。
2.3 SfVP的序列比对与进化树构建
对 SfVP 氨基酸序列进行 Clustal X 比对分析，
结果见图 4。
图 2 SfVP 的保守结构域分析
Fig.2 Conservative domain analysis of SfVP
命名为 SfVP。
2.2 SfVP的序列分析
SfVP 基因 cDNA 全长 2738 bp，其中含有 2301
bp的完整 ORF， 编码 766个氨基酸，ProtParam分析
软件推测 SfVP相对分子量为 80.94 ku，等电点 pI为
5.09。
利用 NCBI 网站在线软件对 SfVP 蛋白进行保
守结构域分析，结果见图 2。 图 2 显示：其属于 H+-
转运无机焦磷酸化酶超家族，具有典型的 H+-PPase
结构域。
使用生物信息学软件 TMHMM 2.0 对该基因
编码的氨基酸序列进行跨膜结构分析结果见图 3。
石河子大学学报（自然科学版）322 第 32 卷
图 4 显示 ：SfVP 同盐爪爪 KfVP 和盐穗木
HcVP的相似度都很高，达到了 97%。 SfVP具有 V-
H+-PPase 家族保守的 3 个结构域，第 1 个保守片段
CSl（图 4 粗线框表示）含有与 PPi 水解有关的催化
区域（图 4，* 号表示），该区域暴露于细胞质中，保
守片段 CS3（图 4细线框表示）可能也暴露于细胞质
中，与 CS1 和 CS2（图 4 虚线框表示）共同在酶的催
化功能中起关键作用。 构建了包括 SfVP 蛋白系统
发育树（图 5），SfVP 与盐生植物盐穗木、盐爪爪亲
缘关系最近，被分在一支。
▲表示本研究中的费尔干猪毛菜 SfVP
图 5 SfVP 蛋白的进化树构建
Fig.5 Phylogenetic tree construction of SfVP protein
with plant VP proteins
2.4 SfVP基因响应盐胁迫的表达分析
从盐处理 0、6、12、24、48、96、144 h 的费尔干
猪毛菜全株中提取总 RNA 并反转录成 cDNA，以
Actin1 基因（GenBbank 登录号：FJ560483）作为内部
参照标准进行半定量分析，结果见图 6.图 6 显示：
随着盐处理时间的增加，SfVP 的表达量逐渐升高，
在处理 12 h后显著增加并一直维持较高的表达。
图 6 费尔干猪毛菜 SfVP 基因在盐胁迫下的表达分析
Fig.6 Expression analysis of Sfvp under salt stress
treatment by semi-quantitative RT-PCR
3 讨论
植物 V-H+-PPase 能够将 Na+区隔化从而增强
植物的耐盐性。许多研究克隆了 H+-PPase基因并验
证了其与植物的耐盐性密切相关：盐生植物盐爪爪
（Kalidium foliatum）V-H+-PPase 基因 KfVP 转入拟
南芥中，增强了拟南芥的耐盐性；拟南芥 AVP1 基因
转入商业品种的番茄（Lycopersicon esculentum）中，
转基因番茄比对照组更耐受盐处理； 拟南芥 AVP1
在棉花中过表达，建立了耐盐棉花株系[11-13]。
本研究从费尔干猪毛菜中克隆得到 V-H+-
PPase 基因 SfVP，SfVP 蛋白与盐生植物具有较近的
亲缘关系，并且具有保守的 H+-PPase 结构域，这与
其他物种中的 H+-PPase蛋白相似[14-15]。 SfVP基因能
够响应盐处理而提高转录表达量，暗示了该基因与
盐响应信号的传递及植物耐盐性之间有着密切的
联系。 H+-PPase可以作为衡量植物耐盐性的一个指
标，大豆（Glycine max L.）耐盐栽培品种与不耐盐
品种相比， 在 NaCl处理后根中 H+-PPase活性升高
[16-17]。 转液泡膜 H+-PPase基因提高植物耐盐性的原
因可能增强了跨膜电化学势，促进了 K+和其他离子
的吸收与代谢，保持高的 K+/Na+比[18]。后期将对 SfVP
基因在模式植物中过量表达验证其耐盐功能，并进
一步探索该基因与植物耐盐性之间的联系和响应
机制。 本研究为研究 V-H+-PPase 基因的耐盐功能
和机制及进一步的农业生产应用提供了参考。
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