全 文 ：基金项目：国家自然科学基金（８１１６０５４７）
作者简介：周　倩（１９９１－），女，在读硕士，研究方向：药食两用资源。
通信作者：张　帆，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：中药与民族药资源，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｆａｎ５９６＠１６３．ｃｏｍ。
新疆特产７种乌头类药材的ＩＳＳＲ特征分析
周　倩１，高福春１，马红梅２，张　帆２
（１新疆医科大学中医学院中药系，２新疆名医名方与特色方剂重点实验室，乌鲁木齐　８３００１１）
摘要：目的　探讨新疆特产准噶尔乌头、多根乌头、白喉乌头、那拉提乌头、空茎乌头、林地乌头、拟黄花乌头
共７个种共４１个居群间的遗传多样性和变异情况，为药材鉴定提供ＤＮＡ特征。方法　利用植物基因组提取试
剂盒提取ＤＮＡ，采用紫外分光光度法检测ＤＮＡ的浓度和纯度，使用６０种哥伦比亚引物分别对７个种共４１个居
群的乌头基因进行ＩＳＳＲ分析，应用ＮＴＳＹＳ－ＰＣ２．１０和ＰＯＰＧＥＮ３２对所得数据进行处理，计算不同种乌头的遗传
相似系数和遗传距离，采用非加权平均法（ＵＰＧＭＡ）进行聚类，构建亲缘关系系统图，用主坐标分析法绘制二维、三
维散点图。结果　从６０个引物中筛选出１３个条带清晰、多态性明显且重复性好的引物用于扩增，共扩增得到
１６３个条带，其中多样性条带１５１个。根据ＩＳＳＲ聚类分析，４１个居群的乌头可聚为７大类群，与种的分类相当符
合；而且乌头类药材在多个引物下具有特征的ＤＮＡ标记。结论　乌头种质资源间具有很高的多态性，遗传变异
较大；ＩＳＳＲ分子标记法可用于７种药材的鉴别，提供了分子水平依据，也为构建其ＤＮＡ指纹图谱提供可能。
关键词：毛茛科；乌头；ＩＳＳＲ；遗传多样性；鉴别
中图分类号：Ｒ９１４　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９－５５５１（２０１４）１２－１６１４－０５
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－５５５１．２０１４．１２．０１７
Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ＩＳＳＲ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ＡｃｏｎｉｔｕｍＬ．ｅｔｈｎｉｃ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｉｎ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ
ＺＨＯＵ　Ｑｉａｎ１，ＧＡＯ　Ｆｕｃｈｕｎ１，ＭＡ　Ｈｏｎｇｍｅｉ　２，ＺＨＡＮＧ　Ｆａｎ２
（１　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００１１，Ｃｈｉｎａ；
２　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｆａｍｏｕｓ　Ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｆｏｒｍｕｌａｓ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００１１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ　ａｎｄ　ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｅｖｅｎ　ＡｃｏｎｉｔｕｍＬ．ｓｐｅｃｉｅｓ，ｉｎ－
ｃｌｕｄｉｎｇ　Ａｃｏｎｉｔｕｍ　ｓｏｏｎｇａｒｉｃｕｍ　Ｓｔａｐｆ．，Ａ．ｋａｒａｋｏｌｉｃｕｍ　Ｒａｐａｉｃｓ．，Ａ．ｌｅｕｃｏｓｔｏｍｕｍ　Ｗｏｒｏｓｃｈ．，Ａ．
ｌｅｕｃｏｓｔｏｍｕｍ　ｖａｒ．ｎａｌａｔｉｅｎｓｉｓ　Ｆ．Ｚｈａｎｇ，Ａ．ｎｅｍｏｒｕｍ　Ｍ．Ｐｏｐ．，Ａ．ａｐｅｔａｌｕｍ　Ｂ．Ｆｅｄｔｓｃｈ．ａｎｄ　Ａ．
ａｎｔｈｏｒｏｉｄｅｕｍＤＣ．，ａｎｄ　ｔｏ　ｓｕｐｐｌｙ　ＤＮＡ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｆｏｒ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｒｕｄｅ　ｄｒｕｇｓ　ｏｆ　Ａｃｏｎｉ－
ｔｕｍ　Ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｏｍｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｅｘｔｒａｃｔ　ＤＮＡ，ａｎｄ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍ－
ｅｔｅｒ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　ＤＮＡ．Ｓｉｘｔｙ　ＩＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ
ｔｈｅ　ＤＮＡ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｏｒｔｙ－ｏｎｅ　ｐｒｏｖｅｎａｎｃｅｓ　ｏｆ　ｓｅｖｅｎ　Ａｃｏｎｉｔｕｍ　Ｌ．ｓｐｅｃｉｅｓ　ｆｏｒ　ＩＳＳＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｓｏｆｔｅａｒｅｓ
ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ＮＴＳＹＳ－ＰＣ２．１０ａｎｄ　ＰＯＰＧＥＮ３２ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｂａｎｄｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．ＵＰＧＭＡ
ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｍａｋｅ　ｕｐ　ｔｈｅ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｄｉａｇｒａｍ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ，ｗｉｔｈ　ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｓｃａｔｔｅｒ－
ｇｒａｐｈ　ａｎｄ　ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｓｃａｔｔｅｒ－ｇｒａｐｈ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｉｎｃｉｐａｌ　ｃｏｒｄｉｎａｔｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　
Ｔｈｉｒｔｅｅｎ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　６０ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　１６３ＤＮＡ　ｂａｎｄｓ　ｗｅｒｅ
ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　１５１ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｂａｎｄｓ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＩＳＳＲ，ｔｈｅ　ｆｏｒｔｙ－ｏｎｅ
ｐｒｏｖｅｎａｎｃｅｓ　ｏｆ　Ａｃｏｎｉｔｕｍ　Ｌ．ｗｅｒｅ　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎｔｏ　ｓｅｖｅｎ　ｇｒｏｕｐｓ，ｗｈｉｃｈ　ａｃｃｏｒｄｅｄ　ｐｒｅｔｔｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｅｓ；ａｎｄ　ｔｈｏｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｗｈｅｎ　ｕｓｉｎｇ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｆ　Ａｃｏｎｉｔｕｍ　Ｌ．ｓｈｏｗｅｄ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎｄ　ｈｉｇｈｅｒ
ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ．ＩＳＳＲ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｋｅｒ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｓ　ｕｓｅｆｕｌ　ｆｏｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　Ａｃｏｎｉｔｕｍ　Ｌ．
ｐｌａｎｔｓ，ｓｕｐｐｌｙｉｎｇ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｌｅｖｅｌ　ｂａｓｉｓ　ａｎｄ　ｍａｋｉｎｇ　ＤＮＡ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ　ｂｕｉｌｄｉｎｇ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ；Ａｃｏｎｉｔｕｍ　Ｌ；Ｉｎｔｅｒ－Ｓｉｍｐｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅｐｅａｔ；Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　第３７卷　第１２期 新 疆 医 科 大 学 学 报 Ｖｏｌ．３７　Ｎｏ．１２
　２０１４年１２月 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｄｅｃ．２０１４
　　乌头属 （ＡｃｏｎｉｔｕｍＬ．）为毛茛科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）
植物，在我国广泛分布，但是具有较强的地区分布
性，如川乌、草乌及青藏高原、云贵高原、东北地区所
产各种乌头植物。本课题组前期考察发现在新疆天
山山脉海拔１　０００～３　０００ｍ地区也特产某些乌头
植物，主要有准噶尔乌头、多根乌头、白喉乌头、那
拉提乌头、空茎乌头、林地乌头和拟黄花乌头，其
分布集中，资源丰富，可利用度高，是值得开发利
用的野生植物资源［１－３］。此类药材在西北地区被
当作川乌和草乌的替代品而使用，同时也是当地
多个民族的传统药材、民间药材，主要用于止痛除
湿祛风寒，其块根曾被收载于前苏联的《国家药
典》和《哈萨克药志》中，酊剂外用为神经痛、牙痛、
关节炎及其他各种疼痛时的镇痛剂，具有较高、潜
在的药用价值［４－５］。
但是由于人们对乌头类药材品种认知不清、鉴
别不明，造成药用乌头品种混乱、种质不清，使得质
量参差不齐，严重影响了该类药材的临床疗效，而传
统四大鉴别方法又无法提供药材之间细微甚至本质
差异特征。目前分子标记技术已应用到中药遗传关
系的研究中［６－７］，其中ＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒｅｐｅａｔ）标记技术具有引物设计较简单、多态性高、
重复性好、能够提供更多遗传信息的优势，为明确各
品种药材间的遗传关系及物种的分类鉴定提供了准
确的方法［８－９］。
本实验首次采用ＩＳＳＲ标记方法对新疆地产７
个种共４１个居群的乌头属药材的ＤＮＡ进行分析，
研究其种源间的遗传多样性及变异情况，以发现种
间、种内的ＤＮＡ特征为目标，为从ＤＮＡ分子水平
上对７种乌头类药材进行鉴定及规范化提供科学实
验依据。
１　仪器与试药
１．１　仪器　Ｍｙ　ｃｙｃｌｅｒ　ＰＣＲ仪（美国ＢＩＯ－ＲＡＤ公
司），Ｇｅｌ　Ｄｏｃ紫外凝胶成像系统（美国ＢＩＯ－ＲＡＤ公
司），ＮＤ１０００超微量紫外分光光度计（美国Ｔｈｅｒｍｏ
Ｆｉｓｈｅｒｓ），电泳仪（北京市六一仪器厂），ＪＹ－ＳＰＣ电
泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司），Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ
５８０４高速冷冻离心机（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）。
１．２　试药　本实验所用准噶尔乌头 （Ａｃｏｎｉｔｕｍ
ｓｏｏｎｇａｒｉｃｕｍＳｔａｐｆ．）、多根乌头 （Ａ．ｋａｒａｋｏｌｉｃｕｍ
Ｒａｐａｉｃｓ．）、白喉乌头 （Ａ．ｌｅｕｃｏｓｔｏｍｕｍ Ｗｏｒｏｓｃｈ．）、
那拉提乌头 （Ａ．ｌｅｕｃｏｓｔｏｍｕｍ　ｖａｒ．ｎａｌａｔｉｅｎｓｉｓ　Ｆ．
Ｚｈａｎｇ）、林地乌头 （Ａ．ｎｅｍｏｒｕｍ Ｍ．Ｐｏｐ．）、空茎乌
头 （Ａ．ａｐｅｔａｌｕｍＢ．Ｆｅｄｔｓｃｈ．）与拟黄花乌头 （Ａ．
ａｎｔｈｏｒｏｉｄｅｕｍＤＣ．）等鲜药材于２０１２年７月采自新
疆十几个不同地区，经新疆医科大学中药系张帆教
授鉴定为以上各品种，凭证标本保存于新疆医科大
学中药民族药标本馆，药材来源见表１，均为野生
居群。
植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒（北京天根生物
技术有限公司），６０种哥伦比亚 ＵＢＣ系列引物（上
海生工生物有限公司），ＰＣＲ试剂盒（北京博迈德生
物公司），琼脂糖、溴化乙锭、氯仿和β－巯基乙醇均为
分析纯试剂。
表１　７个种共４１个居群乌头属植物来源
编号 居群 产地 编号 居群 产地
１ 准噶尔乌头 巩留县Ａ　 ２２ 那拉提乌头 新源县Ａ
２ 准噶尔乌头 新源县Ｂ　 ２３ 那拉提乌头 新源县Ｂ
３ 准噶尔乌头 新源县Ｃ　 ２４ 那拉提乌头 新源县Ｃ
４ 准噶尔乌头 新源县Ｄ　 ２５ 那拉提乌头 新源县Ｄ
５ 准噶尔乌头 新源县Ｅ　 ２６ 那拉提乌头 新源县Ｅ
６ 准噶尔乌头 新源县Ｆ　 ２７ 空茎乌头 特克斯县Ａ
７ 多根乌头 昭苏县Ａ　 ２８ 空茎乌头 新源县Ｂ
８ 多根乌头 新源县Ｂ　 ２９ 空茎乌头 新源县Ｃ
９ 多根乌头 新源县Ｃ　 ３０ 空茎乌头 新源县Ｄ
１０ 白喉乌头 新源县Ａ　 ３１ 空茎乌头 新源县Ｅ
１１ 白喉乌头 新源县Ｂ　 ３２ 空茎乌头 新源县Ｆ
１２ 白喉乌头 新源县Ｃ　 ３３ 林地乌头 沙湾县Ａ
１３ 白喉乌头 尼勒克县Ｄ　 ３４ 林地乌头 沙湾县Ｂ
１４ 白喉乌头 昭苏县Ｅ　 ３５ 林地乌头 昭苏县Ｃ
１５ 白喉乌头 巩留县Ｆ　 ３６ 林地乌头 尼勒克县Ｄ
１６ 白喉乌头 霍城县Ｇ　 ３７ 林地乌头 乌鲁木齐县Ｅ
１７ 白喉乌头 特克斯县 Ｈ　 ３８ 林地乌头 新源县Ｆ
１８ 白喉乌头 特克斯县Ｉ　 ３９ 拟黄花乌头 温泉县Ａ
１９ 白喉乌头 哈巴河县Ｊ　 ４０ 拟黄花乌头 温泉县Ｂ
２０ 白喉乌头 哈巴河县Ｋ　 ４１ 拟黄花乌头 哈巴河县Ｃ
２１ 白喉乌头 布尔津县Ｌ
２方法与结果
２．１　药材基因组ＤＮＡ提取与纯度检测　每个居群
的植物分别随机取５株以上的干燥叶片５０ｍｇ，采
用快速干磨法研磨，按照植物基因组ＤＮＡ提取试
剂盒的步骤ＣＴＡＢ法提取基因组ＤＮＡ。
采用凝胶电泳与Ｇｅｌ　Ｄｏｃ紫外凝胶成像系统观
察得到清晰、明亮、基本无降解、完整性好的 ＤＮＡ
条带（图１）。用超微量紫外分光光度计检测ＤＮＡ
的纯度和浓度，其ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值为１．７０～１．９２，表
明ＤＮＡ浓度和纯度均满足要求，完全达到ＩＳＳＲ扩
增反应对ＤＮＡ的质量要求。
２．２　ＩＳＳＲ引物的筛选　利用６０个哥伦比亚 ＵＢＣ
二核苷酸重复ＩＳＳＲ系列引物分别对４１份药材进
行扩增筛选，从中筛选出电泳条带清晰、稳定、多态
性强、重复性好的１３个引物用于遗传多样性分析
（表２）。
从ＩＳＳＲ扩增产物的电泳图谱可以看出，扩增
产物多集中在１００～２　０００ｂｐ之间。同种乌头的主
５１６１　第１２期 周　倩，等：新疆特产７种乌头类药材的ＩＳＳＲ特征分析
条带较为一致，说明供试药材种内具有一定的遗传
关系，ＩＳＳＲ标记能有效区分这些遗传关系很近的种
源。４１个样品用 ＵＢＣ８３５引物扩增，在６００ｂｐ位
点处有１条共有条带；用ＵＢＣ８４２引物扩增，在２００
ｂｐ位点处有１条共有条带（图２）；用 ＵＢＣ８７６引物
扩增，在 ６００ｂｐ 位 点 处 有 １ 条 共 有 条 带；用
ＵＢＣ８７９引物扩增在７５０ｂｐ位点处有１条共有条
带，１３个引物扩增图谱中可以找到１２条共有条带，
即有１２个同源位点可以作为以上药材种间的特征
性位点，用于区分鉴定。
图１　４１个居群药材的ＤＮＡ电泳图
表２　筛选出ＩＳＳＲ分析所用的１３个引物及扩增结果
序号 引物 序列 退火温度／℃ Ｎｂ　 Ｎ －ｂｐ　 Ｐｐｂ／％
１ ＵＢＣ８０７ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴ　 ５０．３　 １２　 １１　 ９１．６７
２ ＵＢＣ８０８ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣ　 ５５．０　 １５　 １５　 １００．００
３ ＵＢＣ８１０ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴ　 ５０．３　 １２　 １２　 １００．００
４ ＵＢＣ８１１ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣ　 ５５．０　 １２　 １１　 ９１．６７
５ ＵＢＣ８２６ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣ　 ５６．０　 １３　 １３　 １００．００
６ ＵＢＣ８３５ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＹＣ　 ５３．８　 １３　 １０　 ７６．９７
７ ＵＢＣ８３６ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＹＡ　 ５２．５　 １２　 １２　 １００．００
８ ＵＢＣ８４２ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＹＧ　 ５３．６　 ９　 ８　 ８８．８９
９ ＵＢＣ８７３ ＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡ　 ５１．５　 １１　 １１　 １００．００
１０ ＵＢＣ８７６ ＧＡＴＡ　ＧＡＴＡＧＡＣＡ　ＧＡＣＡ　 ４６．０　 １６　 １５　 ９３．７５
１１ ＵＢＣ８７９ ＣＴＴＣＡ　ＣＴＴＣＡＣＴＴＣＡ　 ４６．０　 １２　 １１　 ９１．６７
１２ ＵＢＣ８９５ ＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣ　 ５５．８　 １４　 １２　 ８５．７１
１３ ＵＢＣ９００ ＡＣＴＴＣＣＣＣＡＣＡＧＧＴＴＡＡＣＡＣＡ　 ５４．７　 １２　 １０　 ８３．３３
总 数 １６３　 １５１　 ９２．６４
平均数 １２．５４　 １１．６２　 ９２．５８
　　注：Ｎｂ：扩增带数；Ｎｂｐ：多态性带数；Ｐｐｂ：多态性百分率；Ｙ＝（Ｃ，Ｔ）。
图２　引物ＵＢＣ８４２对乌头属基因组ＤＮＡ的ＩＳＳＲ扩增图谱
　　当引物 ＵＢＣ９００扩增时（图３），准噶尔乌头和
多根乌头在２００、３２０、３７０、７２０ｂｐ　４个位点处同时
扩增出４条共有条带，即４个同源性位点，其中
２００ｂｐ位点是这２个种的特征性位点，而其他种的
乌头在此位点处未扩增出条带，通过此特点可以将
这２个种与其他品种区分开。
引物ＵＢＣ８４２扩增时（图２），白喉乌头和那拉
提乌头在１００、２００、７５０ｂｐ　３个位点处同时扩增出
重复性好的３条共有条带，即３个同源性位点，其中
７５０ｂｐ位点处是这２个种的特征性位点，而其他种
的乌头在此位点处未扩增出条带，通过此特点可以
将这２个种与其他品种区分开。
引物ＵＢＣ８３６扩增时（图４），空茎乌头分别在
１５０、２００、３００、３５０、４００、５００、６００ｂｐ　７个位点处扩增
出重复性好的７条共有条带，即７个同源性位点，故
能将空茎乌头与其他品种的乌头区分开。引物
６１６１ 新 疆 医 科 大 学 学 报 第３７卷　
ＵＢＣ８２６扩增时（图５），林地乌头在２００、４００、５００、
７５０ｂｐ　４位点处扩增出明亮、整齐的４条共有条带，
可以很直观地与其他样品区分开，故这４个同源位点
可以作为用ＵＢＣ８０７扩增林地乌头时的特征性位点。
图３　引物ＵＢＣ９００对乌头属基因组ＤＮＡ的ＩＳＳＲ扩增图谱
图４　引物ＵＢＣ８３６对乌头属基因组ＤＮＡ的ＩＳＳＲ扩增图谱
图５　引物ＵＢＣ８２６对乌头属基因组ＤＮＡ的ＩＳＳＲ扩增图谱
２．３　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增　以４１个居群的乌头药材的
ＤＮＡ为模板，优化之后的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系为：２
×ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ　１０μＬ，其中 ＴａｑＤＮＡ　Ｐｏｌｙ－
ｍｅｒａｓｅ （ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）０．０５ ｕｎｉｔｓ／μＬ；ＭｇＣｌ２
４ｍｍｏｌ／Ｌ；ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）
０．４ｍｍｏｌ／Ｌ，模板 ＤＮＡ　２μＬ（８０～１５０ｎｇ），引物
２μＬ，其余用６μＬ灭菌双蒸水补至总体积为２０μＬ。
ＰＣＲ扩增反应参数为９５℃预变性４ｍｉｎ，每循环在
９５℃变性３０ｓ，４６．０℃～５６．０℃退火４５ｓ，７２℃延伸
９０ｓ，共３５个循环；７２℃总延伸７ｍｉｎ；４℃保存。
扩增产物经电泳与染色后用紫外凝胶成像系统
检测拍照，扩增出的ＤＮＡ片段为１００～２　０００ｂｐ。
２．４　数据统计与分析　对成像系统中重复性好且
清晰的条带记数，对照反应产物在胶上的位置，电泳
图谱中迁移率一致的条带被认为具有同源性，有带
记为“１”，无带记为“０”，建立“１／０”矩阵。将筛选出
的１３条引物扩增结果合并构建“１／０”矩阵图，采用
ＮＴＳＹＳ－ＰＣ２．１０软件中ＵＰＧＭＡ法对４１个居群药
材进行系统聚类分析，得到亲缘关系树状聚类图（图
６）；主坐标分析法绘制二维、三维散点图（图７、８）。
图６　４１个居群乌头药材的ＵＰＧＭＡ聚
类图
　
图７　４１个居群乌头的主坐标分析二
维散点图像
　
图８　４１个居群乌头的主坐标分析三维
散点图像
７１６１　第１２期 周　倩，等：新疆特产７种乌头类药材的ＩＳＳＲ特征分析
　　从主坐标二维散点图和三维散点图可以看出，
不同产地的准噶尔乌头（编号１～６号）和不同产地
的多根乌头（编号７～９）２个种在二维图和三维图中
的空间距离较小，说明这２个种的亲缘关系较近；不
同产地的白喉乌头（编号１０～２１号）和不同采样点
的那拉提乌头（编号２２～２６号）２个种在二维图和
三维图中的空间距离很小，说明这２个种的亲缘关
系很近；不同产地空茎乌头（编号２７～３２号）、不同
产地的林地乌头（编号３３～３８号）和不同产地的拟
黄花乌头（编号３９～４１号）在二维图和三维图中，同
种乌头空间分布密集，说明种的一致性，使得种内的
分化较小，亲缘关系十分近。主坐标分析结果与树
状聚类结果相同，与ＰＯＰＧＥＮＧ３２软件分析得出的
遗传距离与遗传一致度关系基本一致。
３　结论
１３个引物共检测得到１６３个条带，其中１５１个
为多态性条带，多态性百分率约占９２．６４％。平均
每个引物扩增出１２．５４个，不同引物扩增多态性条
带为８～１５个，平均每条引物多态性条带为１１．６２
个，表明乌头属种质资源间具有很高的多态性，遗传
变异较大。说明ＩＳＳＲ标记在检测以上７种乌头药
材基因组遗传多态性上有显著的检出效率。
ＩＳＳＲ分子标记是评估乌头类药材遗传多样性
的有效方法，能有效揭示药材间的亲缘关系，并从
ＤＮＡ分子水平上发现种间、种内的特征位点，为其
种质资源的鉴定提供识别特征，为构建ＤＮＡ指纹
图谱奠定基础。
参考文献：
［１］　蔡冬梅，刘悦，张帆．新疆特产乌头属植物的研究概况［Ｊ］．
新疆中医药，２０１１，２９（２）：７４－７５．
［２］　张帆，杨娟，蔡冬梅，等．新疆天山和阿尔泰山野生乌头药材
资源调查［Ｊ］．新疆医科大学学报，２０１１，３４（１２）：１３９９－１４０１．
［３］　张帆，刘悦，蔡冬梅．新疆乌头属（毛茛科）一新变种［Ｊ］．西
北药学杂志，２０１２，２７（６）：５１９－５２０．
［４］　中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志（第２７卷）
［Ｍ］．北京：科学出版社，１９７９：３０８－３１０．
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［收稿日期：２０１４－０３－２６］
（本文编辑　施洋
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产物及异构化反应。例如（１）发生开环反应后降解
产生的有关物质２、４、５、１０；（２）产生异构化的有关
物质６、７、８。也有来自合成过程中原料药的有关物
质１、３和来自合成过程中使用的有机催化剂产生的
副产物如有关物质１１。各降解产物的裂解规律主
要是内酰胺的开环、３－位侧链的断裂脱去噻二唑以
及四氮唑环的开裂。
图２４　有关物质１１可能的裂解途径
该法简便、快速、准确，适用于注射用头孢唑啉
钠中有关物质的分析，可为其质量控制和工艺优化
提供技术参考。
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［收稿日期：２０１４－０５－２３］
（本文编辑　施洋）
８１６１ 新 疆 医 科 大 学 学 报 第３７卷