全 文 ：·基础研究·
蕨麻对缺氧诱导心肌细胞凋亡的影响
李建宇 ,李灵芝 ,龚海英 ,李怡 ,张新宁
摘要:目的　观察蕨麻(Po tentilla anserina L.)对缺氧诱发乳鼠心肌细胞凋亡的影响 , 并探讨其可能机制。方法　
采用原代培养的 SD乳鼠心肌细胞建立缺氧损伤实验模型 ,分为正常对照组 、缺氧模型组 、蕨麻醇提物干预组 ,通过
HE 染色 、双苯并咪唑-碘化丙锭荧光染色及透射电镜技术 , 观察细胞镜下结构的改变 ,并通过免疫组织化学染色观
察细胞内 P53蛋白表达水平 。结果　与缺氧模型组和正常对照组比较 ,蕨麻醇提物干预组可有效减轻缺氧导致的
心肌细胞肿胀变形 、细胞质空泡化及 DNA 凝集等损伤变化 , 并可显著降低 P53蛋白的表达(P <0.01)。结论　蕨
麻能有效抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡损伤 ,其机制之一可能是通过调节 P53 蛋白的表达实现的。
关键词:蕨麻;心肌;细胞凋亡;缺氧;蛋白质 P53
中图分类号:R542.2　　　　　　文献标识码:A　　　　　　文章编号:1009-0126(2007)09-0619-04
Effect of Potentilla anserina L.on cardiomyocyte
apoptosis induced by hypoxia
LI Jian-yu , LI Ling-zhi ,GONG Hai-ying , et al
(Department o f Pharmacy , Medical College of Chinese People s Armed Police Forces , T ian jin 300162 , China)
Abstract:Objective　To study the ef fect of Potenti l la anserina L .on apoptosis of cultured neo-
natal rat cardiomyocy te s induced by hypoxia and its po ssible mechanism.Methods　A model of
hypoxia injury w as established by using primary cul tured myocy tes of neona tal SD rats.Using HE
staining , Hochest-PI staining and technique of t ransmission elect ron microscopy (TEM), the mo r-
phological changes of cardiac myocy tes were observed.The mechanism w as studied using immu-
nohistochemical staining of P53 protein at molecular biological level.Results　Compared w ith hy-
pox ic model g roup and normal contro l g roup , the ex t ract of Potent il la anserina L .in alcohol could
significant ly at tenuate the injurious changes , such as sw elling , f ragmentation and condensation of
nucleus and could down-regulate the expression of P53 pro tein (P <0.01).Conclusion　Poten-
ti l la anserina L.has a no table at tenuating ef fect on apopto sis of cardiomyocy tes induced by hy-
pox ia.This ef fect might be related to regulating the expression of P53 protein.
Key words:Potent il la anserina L.;myocardium;apoptosis;anoxia;protein P53
基金项目:国家自然科学基金(30672774)
作者单位:300162 天津 ,武警医学院药化教研室
通讯作者:李灵芝 , E-mail:llz hx@t om.com
　　蕨麻(Potenti l la anserina L.)俗称人参果 ,为
蔷薇科委陵菜属鹅绒委陵菜的地下块根 ,性平味甘 ,
健脾益肾 ,生津止渴 、益气补血。其富含淀粉 、脂肪
酸及人体所需的十八种氨基酸和多种维生素 ,具有
较高的医疗和营养价值[ 1] 。研究表明 ,蕨麻中多糖
成分具有显著的提高免疫力与抗氧化活性[ 2 , 3] 。另
有实验证实 ,蕨麻可显著提高小鼠在减压缺氧状态
下的存活率 ,延长窒息性缺氧状态下的存活时间 ,降
低整体耗氧量[ 4 ～ 6] 。心肌细胞凋亡在心肌缺氧 、缺
血损伤中具有重要的病理生理学意义 。本实验通过
建立乳鼠心肌细胞缺氧损伤模型 ,观察蕨麻对缺氧
诱导细胞凋亡的影响及可能机制 。
1　材料与方法
1.1　主要试剂与仪器　蕨麻购自青海 ,粉碎后用
70%乙醇回流提取 , 减压除净乙醇得浓缩浸膏
(Epot ,每克浸膏相当于 3.0 g 生药),呈棕褐色 ,以
D-Hank s 液进行药物溶解;DMEM/F-12 培养基
(Gibco)、胎牛血清(中国医学科学院血液病研究
所)、5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU , Sigma)、胰蛋白酶
(Difco)、双苯并咪唑-碘化丙锭(HO-PI)凋亡试剂盒
购自北京鼎国生物技术发展中心;浓缩型 DAB 试
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剂盒 ,购自北京中杉生物工程公司;浓缩型兔 P53
多克隆抗体 ,购自 Santa C ruz公司;即用型 SP 免疫
组织化学检测试剂盒 ,购自华美生物工程公司 。医
用型超净工作台(SW-CJ-1F 苏州), CO2 培养箱
(fo rma3111 美国), 倒置荧光显微镜(Olympus
1X71),透射电子显微镜(JEM-2000EX型 日本),数
字式测氧仪(CYS-1型 ,北京)。
1.2　乳鼠心肌细胞的原代培养[ 7] 　新生1 ～ 3天的
SD乳鼠 ,雌雄不限 ,由中国军事医学科学院动物实
验中心提供 ,许可证号:SCK-(军)2002-001 。
乳鼠经 75%乙醇消毒后 ,取出心脏置于 4℃预
冷的 D-Hanks液中 ,吹打冲洗3遍 ,取心室肌剪成 1
mm
3 大小组织块 ,加 0.25%胰蛋白酶和 0.02%
EDTA , 37℃消化 ,弃去首次消化上清液 ,收集其余
各次上清液加入等体积含 10%胎牛血清的
DMEM/F-12培养基中止消化 ,离心(1 000 r/min)
收集心肌细胞 ,加入含 10%胎牛血清的 DMEM/
F-12培养基和 BrdU(终浓度 0.1 mmo l/L),轻轻吹
打混匀 ,接种于 25 m l培养瓶中 ,于 37℃、5%CO 2
培养箱中孵育 70 min ,使绝大部分非心肌细胞贴
壁。调整细胞浓度为 3×105/ml ,接种培养 。48 h
细胞贴壁后 ,更换含 10%胎牛血清的 DMEM/F-12
培养基(不含 BrdU),以后每 2 天换液 1次 ,培养 4
天后进行实验。
1.3　心肌细胞缺氧损伤模型的建立[ 8] 及实验分组
　取培养4天的心肌细胞 ,换无血清 DMEM/F-12
培养基连续培养 12 h后 ,用无糖 D-Hanks 液(预先
充入 95%N 2 、5%CO2 混合气饱和 30 min)替代正常
培养基 ,而后迅速将培养板移入缺氧装置中 , 通入
95%N 2 、5%CO2 混合气 ,排气口监测氧浓度<1%,
37℃缺氧培养 48 h 后进行心肌细胞相关实验 。实
验分为正常对照组(心肌细胞不做任何处理 ,按正常
条件培养)、缺氧模型组(细胞按照缺氧处理)、蕨麻
醇提物干预组(细胞缺氧同时加入 0.024 g/ml蕨麻
乙醇提取物)。
1.4　细胞形态学观察　取细胞爬片的盖玻片 ,0.01
mol/L PBS 洗3次 ,95%乙醇固定 ,按 HE染色常规
方法操作 ,光学显微镜下观察并摄片。心肌细胞常
规消化收集于无菌离心管中 ,1 000 r/min离心 ,弃
去上清液 ,0.01 mo l/L PBS 悬浮细胞 ,相同条件下
离心去上清 , 0.01 mol/L PBS 1 ml悬浮细胞 ,相同
条件离心去上清 , 0.01 mo l/L PBS 200 μl悬浮细
胞 ,加 HO-PI 染色剂 , 37℃染色 8 ～ 10 min , 2 000
r/min离心 ,弃去上清液 ,加 0.01 mol/ L PBS 制成
细胞悬液 ,荧光显微镜下观察并摄片。透射电镜观
察:分别取正常对照组 、缺氧模型组及蕨麻醇提物干
预组心肌细胞 ,常规 0.25%胰蛋白酶消化 , 0.01
mol/ L PBS 洗 , 细胞悬液以 2 000 r/min 离心 10
min ,沉淀用 4%戊二醛固定 ,常规包埋 、切片 、染色 ,
透射电镜下观察其超微结构并摄片。
1.5　免疫组织化学法检测心肌细胞 P53蛋白表达
　常规胰蛋白酶消化离心 ,调整合适的细胞浓度后 ,
制成细胞涂片 , 4%多聚甲醛 4℃固定过夜 , 0.01
mol/ L PBS 充分冲洗 、晾干 , 3%H2O 2 室温孵育 20
min ,0.01 mol/L PBS 冲洗后 ,加羊血清封闭液 ,室
温 30 min。滴加 1 ∶100 稀释的一抗 , 4℃过夜 ,
0.01 mol/L PBS 洗 ,滴加 1∶200稀释的生物素化
二抗 , 37℃温育 30 min ,0.01 mol/ L PBS 洗 ,加辣根
过氧化物酶标记的链霉卵白素 , 37℃孵育 30 min ,
0.01 mol/L PBS 洗 , DAB 显色 ,充分水洗 ,常规脱
水 、透明 、中性树胶封固 。
1.6　免疫染色结果判定及图像分析　每张切片随
机选择放大 200倍视野 ,以胞核染成棕黄色为阳性 ,
BioMias图像分析处理系统下测定各组心肌细胞内
P53阳性细胞数。测量窗面积为 1 928 934.00μm2 。
1.7　统计学方法　采用 SPSS 10.0统计软件进行
单因素方差分析 ,结果用 x ±s 表示 , P <0.05为差
异有显著性意义。
2　结　果
2.1　HE染色　正常对照组细胞成簇生长 ,伸出伪
足 ,核大而饱满 ,细胞质丰富 ,细胞间联系紧密 ,生长
状态良好;缺氧模型组细胞凋亡损伤 ,表现为伪足缩
短或消失 ,细胞质皱缩 ,核固缩而深染 ,细胞间隙增
大 ,联系减少;蕨麻醇提物干预组细胞缺氧损伤后未
见明显细胞质 、胞核等凋亡形态学改变 ,仅见胞核略
深染(图 1 ～ 3)。
2.2　HO-PI染色　正常对照组细胞核大而饱满 ,边
界清晰 ,形态呈圆形 ,淡蓝色 ,内有较深的蓝色颗粒;
缺氧模型组细胞呈凋亡损伤改变:核浓集或呈分叶 、
碎片状 ,并伴有红染的坏死细胞;蕨麻醇提物干预组
未见红染坏死细胞 ,细胞核完整 ,无分叶 、碎片 ,与正
常对照组比较 ,仅有轻度浓集 ,体积略缩小 ,边界欠
清晰。
2.3　透射电镜　正常对照组细胞结构完整 、清晰 ,
核染色质均匀分布;缺氧模型组细胞凋亡损伤 ,表现
为细胞质皱缩 ,核深染固缩 ,染色质浓集 ,并可见部
分核膜缺损 ,伴细胞质空泡;蕨麻醇提物干预组细胞
形态 、结构接近正常对照组 ,核稍固缩 ,且伴染色质
少量边集 、深染(图 4 ～ 6)。
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　　图 1　正常对照组心肌细胞　图 2　缺氧模型组心肌细胞　图 3　蕨麻醇提物干预组心肌细胞(图 1～ 3均为 HE　×200)
　　图 4　正常对照组心肌细胞　图 5　缺氧模型组心肌细胞　图 6　蕨麻醇提物干预组心肌细胞(图 4～ 6均为　×8 000)
　　图 7　正常对照组 P53蛋白的表达　图 8　缺氧模型组 P53蛋白的表达　图 9　蕨麻醇提物干预组 P53蛋白的表达(图 7～ 9均为 SP 法
　×200)
2.4　P53蛋白免疫组织化学染色　正常对照组染
色切片中 , P53蛋白免疫反应阳性表达较弱 ,缺氧模
型组细胞 P53蛋白表达增强 ,蕨麻醇提物干预组可
显著降低缺氧损伤细胞 P53蛋白的表达 ,阳性细胞
数与缺氧模型组有显著性差异(P <0.01 ,图 7 ～
10)。
注:与缺氧模型组比较 , ＊P <0.01
图 10　3组P53蛋白阳性细胞的表达
3　讨　论
在哺乳动物机体内 ,心脏是代谢最旺盛的器官
之一 ,在正常情况下 ,其能量需求可以通过氧化磷酸
化过程满足 。当心肌处于缺血缺氧状态时 ,则会由
于能量代谢紊乱 ,影响其形态 、结构及功能 。
凋亡是一种能动的受基因调控的生理性细胞死
亡过程 ,以细胞核浓缩 ,染色质凝集 ,细胞质皱缩 ,最
终形成凋亡小体为主要的形态变化特征 。研究表
明 ,缺氧可诱导体外培养的心肌细胞发生凋亡[ 9] 。
本实验也证实 ,在缺氧损伤后 ,缺氧模型组心肌细胞
质 、胞核均发生明显凋亡形态学改变 ,表现为伪足缩
短或消失 ,紧密的星形心肌细胞变得疏松孤立 ,而呈
条索状;细胞核发生断裂 ,呈分叶 、碎片状 ,核膜完整
包被形成凋亡小体;可见细胞质皱缩 ,核固缩 、深染 ,
染色质浓集等主要凋亡形态变化特征 。经蕨麻醇提
物干预后 ,心肌细胞依然紧密生长 ,伪足交错连接 ,
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表现出良好的生长状态;胞核结构依然完整清晰 ,未
出现任何染色质的断裂或崩解 ,与正常细胞比较仅
体积略缩小且边界欠清晰;肌细胞超微结构无明显
凋亡损伤改变 ,细胞核形态接近正常 ,仅有轻度的固
缩伴少量染色质边集 。表明蕨麻可有效抑制缺氧诱
导的心肌细胞凋亡损伤 ,对改善缺氧损伤心肌细胞
的形态 、结构 ,具有显著的保护作用 。
细胞凋亡过程有多种因素参与 ,在缺氧损伤时 ,
不能被有效清除的自由基 ,通过一系列过氧化反应 ,
影响细胞的结构和功能 ,甚至影响基因的表达与调
控。活性氧自由基可诱导细胞凋亡 ,抗氧化剂可阻
断细胞凋亡发生[ 10] 。文献报道蕨麻能减慢植物油
氧化变质速度[ 11] 。我们在研究中发现蕨麻能显著
对抗自由基对红细胞的氧化作用[ 5] ,同时证实蕨麻
可抑制心肌细胞缺氧导致超氧化物歧化酶活性降低
和过氧化脂质产物丙二醛含量升高 ,提示蕨麻抑制
缺氧导致心肌细胞凋亡的途径之一可能是通过捕获
自由基或对抗自由基的氧化作用。
在细胞凋亡的调控基因中 ,P53是缺血 、缺氧损
伤中的关键调控因子 ,P53蛋白表达上调 ,将促进细
胞凋亡的发生[ 12] 。本实验研究表明 ,心肌细胞缺氧
后 P53蛋白水平升高 , 蕨麻干预后则可显著降低
P53蛋白的表达 ,提示下调 P53蛋白表达可能是蕨
麻抑制缺氧导致心肌细胞凋亡的另一条途径 。
参考文献:
[ 1] 　马春花.藏药蕨麻的化学成分及药理作用研究概况[ J] .时珍
国医国药 , 2006 , 17:1584-1585.
[ 2] 　陈炅然 ,胡庭俊 ,张瑞孝 ,等.蕨麻多糖对小鼠免疫功能的影响
[ J] .中兽医医药杂志 , 2005 , 24:14-16.
[ 3] 　陈炅然 ,王琴.蕨麻多糖的提取及其清除自由基的作用[ J] .中
国兽医科技 , 2004 , 34:59-62.
[ 4] 　李灵芝 ,张丽 ,龚海英,等.蕨麻石油醚部位的抗缺氧及其初步
机制研究[ J] .中国药学杂志 , 2006 , 41:37-38.
[ 5] 　李灵芝 ,张丽 ,龚海英,等.蕨麻醇提物抗缺氧及抗氧化机制研
究[ J] .中国食品卫生杂志 , 2005 , 17:306-309.
[ 6] 　回晶 ,尚得静 ,李庆伟.西藏人参果对小鼠抗疲劳及抗缺氧能
力的影响[ J] .营养学报 , 2003 , 25:218-219.
[ 7] 　Kaw ahara K , Hachi ro T , Yokokaw a T , et al .Ischemia/ reper-
fu sion-induced death of cardiac myocy tes:possible involve-
men t of nit ric oxide in the coordinat ion of ATP supply and de-
mand du ring ischemia[ J] .Mol Cel l Cardiol , 2006 , 40:35-46.
[ 8] 　Regula KM , Ens K , Kirshenbaum LA.Inducible exp ression of
BNIP3 provokes mi tochondrial defect s and h ypoxia-mediated
cell death of vent ricu lar myocytes[ J] .Circ Res , 2002 , 91:226-
231.
[ 9] 　周舟 ,王小华 ,朱光旭 ,等.缺氧诱导心肌细胞凋亡与 C aspase-
3激活及细胞内钙超载的关系[ J] .中国应用生理学杂志 ,
2005 , 21:10-14.
[ 10] 　刘戎 ,宣昭林.活性氧 、线粒体与细胞凋亡[ J] .中国地方病防
治杂志 , 2005 , 20:30-33.
[ 11] 　李园媛 ,袁勤生.青藏高原蕨麻植物抗氧化作用的研究[ J] .药
物生物技术 , 2004 , 11:25-28.
[ 12] 　H ammond EM , Giaccia AJ.Th e role of P53 in hypoxia-in-
duced ap op tosi s[ J] .Biochem Biophys Res Communi , 2005 ,
331:718-725.
(收稿日期:2007-03-05)
(本文编辑:马卫东)
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