全 文 ：中国兽医科技 1 9 9 5年 第 5 2卷 第 6期
的平行性 .r F ig eut( 1 98 5) 等采用在游离抗体含量计算抗原抗
体反应的 K值 ,并与同位素盐析法和黄光转移法的结果进行
比较 ,各方法 K 值非常接近 。 郝春海等 ( 1 9 8 6 )用 ELI S A 间接
法测定了腺病毒单克隆抗体 的相对亲和 力 ,并从理论上分析
了其可靠性 ,认为用初步纯化 (硫酸钱沉淀 )的单抗 E LI S A 法
测定其相对亲和 力 , 能明显 比较各抗体之间亲和力的差 异 , 因
此没有必要进行烦琐的测定再求出 K 值 。 我们也用初步纯化
的 M c A b 法测其相对亲和力 , 亦显著和 比较出各抗体之间亲
和力的差异 . 亲和力与特异性成 反 比 ,抗体与抗原亲和力决定
于 抗体 分 子与 抗 原决 定 簇 的构型 吻 合程 度 , 我 们测得
M
c A b一 ZG , 2亲和力最大 ,这与猪水泡病病毒抗原表位关系分
析结果 M c A b一 2G I 之是 S V D V 的共同表位这一结论完全相吻
合 (李忠润等 1 9 2) 。 因此 ,采用 E L is A 法则 M c A b 的亲和力
是可靠的 ,而且 用不同产地 , 不同规格的聚苯 乙烯板作同一试
验 , 其结果一致 ,证明试验具有良好的重复性 。
(收稿日期 1 9 9 5一 0 2一1 6 )
用 毛 地 黄 皂 昔 分 离 霉 形 体 膜
逮忠新 邓 光明 包慧芳 梁桂香
(中国农业科学院兰州兽医研究所 73 0 46 )
渗透榕解是目前常用的分离无胞质污染霉形体细胞膜的
方法 . 但渗透溶解霉形体的敏感性依赖于霉形体的种和生长
时间 , 其中生长慢的霉形体 (如羊肺炎霉形体 )对渗透溶解有
一定抵抗力 。 我们采用毛地黄皂昔来分离羊肺炎霉形体细胞
膜获得了较好的效果 .
1 材料和方法
1
.
1 菌种 和生 长 条件 羊肺炎霉形体购 自英国 国际 霉形体
鉴定中心 ,将含 20 % 马血清的 K M : 液体培养基用 l m ol L/
N a O H 调 p H 至 7 . 6~ 7 . 8 ,接菌种后 3 7 ,C培养 3一 6天 ,待呈
轻度均匀混浊 、 p H 下降至 7 . 0 左右时 , 将培养物以 2。。 o r / m in
离心 15 分钟除去杂质 ,上清液再以 1 2 0 0 09 离心 30 分钟分离
细胞 , 细胞用 0 . 2 5m o l / L N a C I 洗 2 次 ,按 一 1 0 0 溶解于 N a C I
溶液中 , 以紫外分光光度计测定蛋白含量后备用 。
1
.
2 毛地黄 皂普 上海产 , 以 10 Om g / m l溶于 乙醉中 。
1
.
3 测定毛地黄皂普对羊肺 炎霉形体敏感性 的指标 测定
不同量蛋白与不同浓度对毛地黄皂昔破膜的相互关系及不同
温度对毛地黄皂昔破膜的影响 . 破膜效果根据差速离心后收
集的膜确定 。
1
.
4 分析 方法
1
.
4
.
1 电镜超薄切片的制备按常规双固定法进行 .
1
.
4
.
2 密度梯度离心用 20 % ~ 70 %的线性庶糖密度梯度 。
1
.
4
.
3 S D S一 P A G E 电泳浓缩胶为 5写 ,分离胶为 12 . 5 % , 电
泳后用考马斯亮蓝 R 25 o 做常规染色 。
2 实验结果
2
.
1 毛地黄皂等破膜的敏感性 实验 结果见表 1 、 2 .
从表中看出 , 羊肺炎霉形体和毛地黄皂普的含至不同 ,破
膜效果也不尽一致 , 最佳的含量为 1 0 0拌 g / m l 蛋白与终浓度
3。产 g / m l 的毛 地黄皂普作用 ,温度对毛地黄皂昔破膜的影响
极大 , 4℃ 时对霉形体细胞膜作用不大 , 随着温度升高效果逐
渐明显 , 最佳温度为 37 ℃ 。
表 1 不同浓度毛地黄皂昔对不同呈
霉形体细胞破膜的影响 %
毛地黄皂昔浓度年g /m l)蛋 白浓度—王」0 2 0 2 5 3 01 0 0 73 8 5 9 0 9 43 0 0 50 80 8 5 8 96 0 0 2 0 3 0 4 5 75表 2 温度对毛地黄皂普破膜的影响 %毛地黄皂昔浓度年 g / m D温度 (℃ )—1 0 1 5 2 0 2 54 万 8 1 3 1 73 7 3 5 4 7 6 5 8 52 . 2 电镜超薄切片观察 结果见图 1 。 正常霉形体可见明显的细胞膜和充满于胞质的核蛋 白体 ,而破膜霉形体仅形成不规则的空泡样细胞膜结构 ,表明获得的膜蛋白是较纯的 。2 . 3 密度 梯度分析 膜蛋白样品 l m l 加在 9m l 20 写一 70 %线性蔗糖密度梯度之上 ,梯度在 1 1 7。。 9 4℃ 离心 2 小时 , 每
0
.
5m l收集一组份 ,经检测膜蛋白形成一条较集中的区带 。
2
.
4 S D S一P A G E 分析 结果见图 2 。 图 2 显示膜蛋白与细
胞蛋白及 eS p h ad e x G一 20 纯化膜蛋白的主要多肤带完全一
致 。 A 为超声波破碎的膜蛋白 , B 为毛地黄皂昔处理的膜蛋
白 , C 为 S e p h a d e x G一 2 0 0 纯化膜蛋白 。
中国农业科学院院长基金资助项 目
DOI : 10. 16656 /j . i ssn. 1673 -4696. 1995. 06. 013
中国兽医科技 19 9 5年 第 25卷 第 6期
的平行性 .i r Fg e u t( 198 5)等采用在游离抗体含量计算抗原抗
体反应的 K值 ,并与同位素盐析法和黄光转移法的结果进行
比较 ,各方法 K 值非常接近 。 郝春海等 ( 1 9 8 6 )用 ELI S A 间接
法测定了腺病毒单克隆抗体 的相对亲和 力 ,并从理论上分析
了其可靠性 ,认为用初步纯化 (硫酸钱沉淀 )的单抗 E LI S A 法
测定其相对亲和 力 , 能明显 比较各抗体之间亲和力的差 异 , 因
此没有必要进行烦琐的测定再求出 K 值 。 我们也用初步纯化
的 M c A b 法测其相对亲和力 , 亦显著和 比较出各抗体之间亲
和力的差异 . 亲和力与特异性成 反 比 ,抗体与抗原亲和力决定
于 抗体 分 子与 抗 原决 定 簇 的构型 吻 合程 度 , 我 们测得
M
c A b一 ZG , 2亲和力最大 ,这与猪水泡病病毒抗原表位关系分
析结果 M c A b一 2G I 之是 S V D V 的共同表位这一结论完全相吻
合 (李忠润等 1 9 2) 。 因此 ,采用 E L is A 法则 M c A b 的亲和力
是可靠的 ,而且 用不同产地 , 不同规格的聚苯 乙烯板作同一试
验 , 其结果一致 ,证明试验具有良好的重复性 。
(收稿日期 1 9 9 5一 0 2一1 6 )
用 毛 地 黄 皂 昔 分 离 霉 形 体 膜
逮忠新 邓 光明 包慧芳 梁桂香
(中国农业科学院兰州兽医研究所 73 0 46 )
渗透榕解是目前常用的分离无胞质污染霉形体细胞膜的
方法 . 但渗透溶解霉形体的敏感性依赖于霉形体的种和生长
时间 , 其中生长慢的霉形体 (如羊肺炎霉形体 )对渗透溶解有
一定抵抗力 。 我们采用毛地黄皂昔来分离羊肺炎霉形体细胞
膜获得了较好的效果 .
1 材料和方法
1
.
1 菌种 和生 长 条件 羊肺炎霉形体购 自英国 国际 霉形体
鉴定中心 ,将含 20 % 马血清的 K M : 液体培养基用 l m ol L/
N a O H 调 p H 至 7 . 6~ 7 . 8 ,接菌种后 3 7 ,C培养 3一 6天 ,待呈
轻度均匀混浊 、 p H 下降至 7 . 0 左右时 , 将培养物以 2。。 o r / m in
离心 15 分钟除去杂质 ,上清液再以 1 2 0 0 09 离心 30 分钟分离
细胞 , 细胞用 0 . 2 5m o l / L N a C I 洗 2 次 ,按 一 1 0 0 溶解于 N a C I
溶液中 , 以紫外分光光度计测定蛋白含量后备用 。
1
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2 毛地黄 皂普 上海产 , 以 10 Om g / m l溶于 乙醉中 。
1
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3 测定毛地黄皂普对羊肺 炎霉形体敏感性 的指标 测定
不同量蛋白与不同浓度对毛地黄皂昔破膜的相互关系及不同
温度对毛地黄皂昔破膜的影响 . 破膜效果根据差速离心后收
集的膜确定 。
1
.
4 分析 方法
1
.
4
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1 电镜超薄切片的制备按常规双固定法进行 .
1
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4
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2 密度梯度离心用 20 % ~ 70 %的线性庶糖密度梯度 。
1
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4
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3 S D S一 P A G E 电泳浓缩胶为 5写 ,分离胶为 12 . 5 % , 电
泳后用考马斯亮蓝 R 25 o 做常规染色 。
2 实验结果
2
.
1 毛地黄皂等破膜的敏感性 实验 结果见表 1 、 2 .
从表中看出 , 羊肺炎霉形体和毛地黄皂普的含至不同 ,破
膜效果也不尽一致 , 最佳的含量为 1 0 0拌 g / m l 蛋白与终浓度
3。产 g / m l 的毛 地黄皂普作用 ,温度对毛地黄皂昔破膜的影响
极大 , 4℃ 时对霉形体细胞膜作用不大 , 随着温度升高效果逐
渐明显 , 最佳温度为 37 ℃ 。
表 1 不同浓度毛地黄皂昔对不同呈
霉形体细胞破膜的影响 %
毛地黄皂昔浓度年g /m l)蛋 白浓度—王」0 2 0 2 5 3 01 0 0 73 8 5 9 0 9 43 0 0 50 80 8 5 8 96 0 0 2 0 3 0 4 5 75表 2 温度对毛地黄皂普破膜的影响 %毛地黄皂昔浓度年 g / m D温度 (℃ )—1 0 1 5 2 0 2 54 万 8 1 3 1 73 7 3 5 4 7 6 5 8 52 . 2 电镜超薄切片观察 结果见图 1 。 正常霉形体可见明显的细胞膜和充满于胞质的核蛋 白体 ,而破膜霉形体仅形成不规则的空泡样细胞膜结构 ,表明获得的膜蛋白是较纯的 。2 . 3 密度 梯度分析 膜蛋白样品 l m l 加在 9m l 20 写一 70 %线性蔗糖密度梯度之上 ,梯度在 1 1 7。。 9 4℃ 离心 2 小时 , 每
0
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5m l收集一组份 ,经检测膜蛋白形成一条较集中的区带 。
2
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4 S D S一P A G E 分析 结果见图 2 。 图 2 显示膜蛋白与细
胞蛋白及 eS p h ad e x G一 20 纯化膜蛋白的主要多肤带完全一
致 。 A 为超声波破碎的膜蛋白 , B 为毛地黄皂昔处理的膜蛋
白 , C 为 S e p h a d e x G一 2 0 0 纯化膜蛋白 。
中国农业科学院院长基金资助项 目